Mezenkimal kök hücreyi insan göbek kordonu dokusundan izole etmek için protokolümüzü ve bunları iskelet kası soyuna ayırmak için sağlam bir yöntemi tarif ediyoruz. Bu teknik, yüksek canlılığa ve ısıya sahip mezenkimal kök hücreleri, endotel kökenli hücrelerin kontaminasyonu çok az veya hiç kirlenmeden izole etmemizi ve bu hastalıklarda miyojenik farklılaşmayı etkili bir şekilde indüklememizi sağlar. Kordon burulması ve mukoid kıvamı, kablonun tutulmasını zorlaştırır.
Kordonun nasıl işleneceğini, Wharton'un jölesini kazımamayı ve endotel hücrelerini popülasyondan dışlamayı gösteriyoruz. Kordon dokusunu teslim zamanında topladıktan sonra, kordon dokusu parçasını toplama tüpünden 10 santimetrekarelik doku kültürü ile işlenmiş bir kaba aktarın ve dokuyu taze PBS ile iyice yıkayın. Kordon burulması ve mukoid yüzeye dikkat etmek için, bir elde tutulan bir çift forseps ile dokuyu sabitleyin.
Bir neşter kullanarak, iki yarım silindirik parça elde etmek için kordon dokusunu uzunlamasına erişimi boyunca dikey olarak dilimleyin. Bu noktada, göbek damarlarını ve damarlarını gözlemleyin. Bir neşter kullanarak, kan damarlarını yüzeyden bir yönde kazıyarak çıkarın ve dokuyla ilişkili tüm artık kanı çıkarmak için kordon dokusunu PBS'de durulayın.
Kordon dokusunun her yarısını 0,5 santimetreküp büyüklüğünde parçalara ayırın. Parçaları, ışıklı yüzeyi çanağın üzerine bakacak şekilde yerleştirin ve tabağı 10 dakika boyunca kısaca inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, kordon dokusunu içeren kabın kenarları boyunca yavaşça MEM Alpha modifikasyonu içeren 20 mililitre ortam ekleyin.
Eksplantların oryantasyonlarından ayrılmadığından emin olun ve doku eksplantlarının kuluçka sırasında emeceği bir kısmı hesaba katmak için fazla ortam ekleyin. Sonra tabağı üç gün boyunca inkübatöre yerleştirin. Kuluçkanın bitiminden sonra, kültüre taze ortam ekleyin ve yemeklerle uğraşırken kültürlerin şoklardan ve eksplantların hareketlerinden korunmasını sağlayın.
Bir hafta sonra, steril forseps kullanarak, doku parçalarını tek tek çıkarın ve bertaraf için uygun biyolojik tehlike torbaları kullanarak atın. Mevcut ortamı koruyun ve 10 mililitre taze büyüme ortamı ekleyin. Bireysel koloniler %70'lik bir birleşime ulaşana kadar her dört günde bir büyüme ortamını değiştirin Makalede açıklandığı gibi hücreleri boyadıktan sonra, etiketli hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin ve CD105 CD90 pozitif ve CD105 CD73 pozitif hücrelerin yüzdesini belirleyin.
CD105 pozitif ve CD34 CD45 negatif hücreleri ayrı ayrı analiz edin. Doku kültürü plakasını PBS'de% 0.01 kollajen vemililitre laminin başına 20 mikrogram ile kaplayın ve oda sıcaklığında en az dört saat boyunca rocker'ın üzerine yerleştirin. Kuluçkadan sonra, kollajeni çıkarın ve plakayı PBS ile yıkayın, ardından uMSC'leri büyüme ortamında santimetrekare yoğunluğu başına 10.000 hücrede plakalayın.
Hücreler% 70 akıcılığa ulaştığında, büyüme ortamını aspire edin ve kültür plakasını PBS ile iki kez durulayın. Miyojenik progresyonun kinetiğini belirlemek için, kültürlere her gün M1 ortamı ekleyin ve sırasıyla iki gün, dört ila beş gün, altı ila yedi gün ve on ila on dört günde pax7, MyoD, miyogenin ve miyozin ağır zincirinin ekspresyonu için uMSC'leri analiz edin. uMSC'ler CD105 ve CD90 ekspresyonunu görüntüler ve CD34 ve CD45 hematopoetik belirteçlerini eksprese etmez.
uMSC'ler, uMSC'lerin CD73 işaretleyicisinin ekspresyonu için de pozitifti, bu da uMSC'lerin birden fazla anahtar belirteci ifade ettiğini gösteriyordu. uMSC'ler, M1 ilavesinin ilk iki günü içinde pax7 ekspresyonunu gösterdi, bunu M1 ilavesinin ilk dört günü içinde MyoD ekspresyonu izledi. Hücreler altı günlük farklılaşmada miyojenin proteinini eksprese eder, bunu takiben farklılaşma indüksiyonunun 10 gün ila 14 günü arasında miyozin ağır zincirinin ekspresyonu gelir.
Diferansiye edilmemiş uMSC'lere kıyasla miyojenik farklılaşmanın indüksiyonuna yanıt olarak 970 gen yukarı regüle edildi. Kordon dokusundan türetilmiş uMSC'lerde, kordon kanı kaynaklı uMSC'lere kıyasla daha fazla miyojenik gen yukarı regüle edildi. Hem kordon dokusu hem de kordon kanı, aktin bağlama ve sarkomer montajı ile ilişkili sitoiskelet proteinleri ile ilişkili genlerin regülasyonunu, kontraktil fonksiyonla ilişkili taşıyıcıları, kas kütlesini korumayı, kalsiyum sinyallemesini ve enzimatik fonksiyonu gösterdi.
Dokuyu aseptik durumda toplayın ve steril kültürü koruyun. Kordon dışarıdan% 70 etanol ile süpürülmeli ve mümkün olduğunca hızlı işlenmelidir. Birçok rejeneratif tedavi, erken pasajlardan çok sayıda hücre gerektirir.
Ayrıca tüm kuru ortamı taklit etmek ve doğum sonrası metabolizmayı yansıtmak için bir model olarak da kullanılabilir.
