PLP Sanford Çocuk Sağlığı Araştırma Merkezi&#39;nin bir Associate Araştırmacı. R01AR056712, R01AR052779 ve Artrit ve Kas-iskelet Sağlık / Ulusal Enstitüsü Ulusal Enstitüsü ve Cilt Hastalıkları (NIAMS), MDA ve Sanford Çocuk Sağlığı Araştırma ödül gelen P30 AR061303: Bu çalışma PLP&#39;ye aşağıdaki hibe tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen projede Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı araştırma fonlarından yararlandı FP7-Sağlık - 2009 ENDOSTEM 241440 (tamir ve kas dokusunun bakımı için damar ilişkili kök hücre ve kas kök hücrelerinin aktivasyonu) SA tarafından desteklenmiştir. CIRM dostluk.

HESC 1. Enfeksiyon Bu protokol, yüksek titre lentivirüsler kodlayan BAF60C ve MyoD 13 gerektirir. Bu yapılar istek üzerine mevcuttur. <ol><li> Başlamadan önce Öneriler <ol><li> Besleyici ücretsiz koşullarına enfeksiyon viral alımı sırasında hücresel rakiplerini ortadan kaldırmak için (Şekil 2A) için enfeksiyon, plaka hESC yüksek verim sağlamak için. Gerçekten de, MEF&#39;ler HESC göre ve MyoD-aracılı dönüşüm için yetkin olduğu gibi enfekte herkesin bildiği gibi daha kolaydır. Bu nedenle, HESC kültürlerden MEFS ortadan enfeksiyon oranı artar. </li><li> Bu enfeksiyon, yüksek verim sağlamak için yüksek titre lentivirüsler olması tavsiye edilir. Enfeksiyon verimliliğini artırmak için Seçenekler &quot;enfeksiyon kontrol&quot; bölümünde tartışılmıştır. </li><li> Her kuyucuğa 1 mg / ml 1 ml Matrigel eklenerek Matrigel kaplı tabak hazırlayın ve en az 1 saat oda sıcaklığında (veya O bırakmak / N 4 ° C&#39;de mühürlübir gün önce hazırlandı ise). </li></ol></li><li> Enfeksiyon işlemi <ol><li> Enfeksiyondan bir gün önce <ol><li> 1000 X seyreltme (2 mM nihai konsantrasyon) de ortam içinde embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek ekleyin. </li></ol></li><li> Gün 0 - BAF60C ile enfeksiyon Not: İlk MyoD ile enfeksiyonu takiben BAF60C ile hESC enfeksiyon yapın. <ol><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca TrypLE 1 ml ile kuluçkalama ile tek bir hücre süspansiyonu olarak 14 koloni olarak yetiştirilen hESC bir 6-yuvalı plakanın bir kuyu ayrıştırmaları </li><li> 15 ml tüp transfer süspansiyon, 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj HESC orta ve 9 ml ekleyin. </li><li> Santrifüj sırasında, 1 ml mTeSR1, polibren (6 mg / ml) ve embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek (2 mM) ilave edilerek temiz bir tüp içinde enfeksiyon karışım hazırlayın. </li><li> Bir c yeniden askıya hücre topağı (yaklaşık olarak 5 x 10 5 -1 x 10 6 hücreonfluent iyi hESC) plastiğe yapışmasını engelleyen bir hücreler 6-çukurlu, düşük tutturucu levha, üzerine enfeksiyon karışımı ve plakanın 1 ml. </li><li> 8 10 MOl&#39;de BAF60C-IRES-GFP virüs ekleyin ve inkübatör içinde 3 saat inkübe </li><li> Virüs içeren hücre süspansiyonu toplayın ve iki Matrigel kaplı oyuklara eşit bölün. Daha sonra her bir oyuğa mTeSR1 + embriyonik kök hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ekleyin ve inkübatör O / N bırakın. </li></ol></li><li> Gün 1 <ol><li> Dikkatle virüs içeren orta kaldırmak ve mTeSR1and iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ile değiştirin. Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, hücreler topaklanmış başlayacaktır. </li></ol></li><li> Day2 - myod ile enfeksiyon <ol><li> Devam önce, enfeksiyon riski yüksek verim için emin olmak için flöresanlı bir mikroskop altında, hücrelerin floresans durumunu kontrol edin. Değilse, Infect kontrol &quot;bölümüne bakıniyonu &quot;. </li><li> Hücreler izdiham en az% 80 ulaştı varsa aşağıdaki işlemleri; Aksi önce işlem için ek bir gün bekleyin. </li><li> Ortamı çıkarın ve hücreleri ayırmak için TrypLE maddesi 1 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe </li><li> Tarif from1.2.2.2 gibi tekrarlayın - 1.2.2.6 10 8 MOI&#39;da MyoD virüs ekledi. </li></ol></li><li> 3. Gün <ol><li> Dikkatle virüs içeren orta kaldırmak ve mTeSR1and iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek 2 ml ile değiştirin. </li><li> Matrigel Plaka MEF&#39;ler enfekte olmuş hücrelerin yayılmasını sağlamak için ertesi gün için 2.5 x 10 5 / cm 2 plakaları kaplı. </li></ol></li><li> 4. Gün <ol><li> Ortamı çıkarın ve hücreleri ayırmak için TrypLE maddesi 1 ml ekleyin. 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe </li><li> 15 ml Falcon tüpüne transfer hücreleri, 1200 rpm&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj HESC orta ve 9 ml ekleyin. </li><li> Raldır süpernatan ve HESC orta 6 ml yeniden askıya. </li><li> Her bir MEF&#39;ler ihtiva eden 3 ml dağıtma 1:2 bir bölünme oranında MEF&#39;ler ihtiva eden 6 oyuklu plaka ve plaka hESC orta çıkarın. Koloniler izdiham ulaştığınızda! TIP, MyoD/BAF60C-infected hücrelerin bazı kuyularında bir rezerv stok olarak sıvı nitrojen içinde dondurulmuş olabilir. Donma orta 90 KOSR% ve% 10 DMSO artı 2 mM iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Desteği içerir. Geri kalan kuyular sonra farklılaşma protokole maruz olabilir - açıklama için aşağıya bakınız. Daha hücreleri daha myospheres üretmek için gerekli aşağıdaki gibi, enfekte HESC daha çoğaltılabilir: </li><li> Ortamı çıkarın ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1 mg / ml kollajenaz IV, 1 ml &#39;si ile inkübe </li><li> Kollajenaz IV çıkarın ve HESC ortamın 1 ml. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında 10 ml ucu ile koloniler kazımak. </li><li> Coloni ve parçaları toplayın, 15 ml bir tüp içinde ve 3 dakika boyunca tortu izin es. Daha sonra, bir oran 01:04 ile MEF&#39;ler tabakalarına HESC orta ve plaka içindeki süpernatan, tekrar süspansiyon çıkarın. </li></ol></li></ol></li><li> Enfeksiyon kontrol etme <ol><li> Hücreleri yayılan iken, RNA analizi için hasat ve (Temsilcisi sonuçları görmek) her aşamada doğru biyolojik durumu yansıtır biyobelirteçlere kontrol etmek için immünofloresans tarafından protein ekspresyon analizi gerçekleştirmek için daha küçük bir ölçekte enfekte hücreleri plaka tavsiye edilir. Yüksek titre lentivirüsler için beklenen enfekte olan hücrelerin yüzdesi en az% 80 olmalıdır. </li><li> Yüksek verim sağlamak için, lentiviral vektörler, floresan bir seçim işaretleyicisi ve / veya bir antibiyotik direnç sokulması, modifiye edilebilir. BAF60C ifade Bizim lentiviral Plazmid aynı zamanda GFP floresan taşır. </li><li> Bir floresan işaretleyici için hESC sıralama. Enfeksiyonunun düşük verimlilik durumunda floresan a kullanılması önerilirBAF60C virüs eksprese eden hücreler için zenginleştirmek ve daha sonra yüksek titre MyoD virüs ile enfekte etmek için hücreler (FACS-sıralama) sıralama ctivated hücreleri. <ol><li> Orta iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Ek sıralama gün önce ekleyin. </li><li> Sıralama günü, (günde 0 açıklandığı gibi) TrypLE tarafından hücreleri ayırmak ve FACS-tüplerde KO yedek serum artı iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Eki&#39;nde hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Sıralama sonunda, iEK Hücre Klonlama ve Kurtarma Desteği ekleyerek MEF&#39;ler plakalar üzerinde KO yedek serum ve plakadaki hücreleri toplamak. </li></ol></li></ol></li></ol> 2.. EB-benzeri İndüksiyon ve Farklılaşma <ol><li> Indüksiyon ve farklılaşma prosedür <ol><li> Gün 0 - EB indüksiyon <ol><li> Kuyunun (Şekil 2C) koloni sayısının yüksek olması, BAF60C/Myod-infected hESC farklılaşma başlamadan önce, emin olun. </li><li> Her bir Raldır ortam, PBS ile yıkayın ve 1 mg / ml kollajenaz IV, 1 ml. 37 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe </li><li> Kolajenaz çıkarın ve EB ortamın 1 ml. </li><li> , Bir teşhir mikroskopu altında hızlı bir şekilde, mekanik olarak 10 ml ucu ile kazınarak 400-800 hücre agregalar halinde kolonileri ayırmak. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde koloni parçalarını toplamak ve 3 dakika boyunca çöktürmek için izin verir. Süpernatantı, EB ortamının 3 ml yeniden askıya ve 6-kuyulu düşük bağlanma plakanın bir çukuruna hücre süspansiyonu aktarın. </li></ol></li><li> Gün 1 <ol><li> Geçmeden önce koloni büyüklüğü ve hücre ölümünü edin. Büyük parçalar varsa, bir 5 ml pipet, 3-4 kez hafifçe yukarı pipetleme ve onları yıkmak. Hücre ölümü çok yüksek ise (bir çok yüzer hücreler ve döküntüler) çekimi ile bir 15 ml&#39;lik bir tüp içinde agregalar toplayarak orta yerine taze ortam EB 3 ml ile levha, aşağıdaki gibi başka bir devam edin. </li><li> Ekle 1.5kuyu taze ortam ml EB </li></ol></li><li> 2. Gün <ol><li> 15 ml&#39;lik bir tüp içinde kuyulardan agrega toplayarak orta değiştirin. Onları 2 dakika sakin olalım. </li><li> Süpernatantı taze EB orta 3 ml ile değiştirin ve aynı kuyuların üzerinde dağıtabilir. </li></ol></li><li> 3. Gün <ol><li> Kuyularda taze EB orta 1.5 ml ekleyin. </li></ol></li><li> 4. Gün <ol><li> &quot;2. Gün&quot; de anlatıldığı gibi devam edin. </li></ol></li><li> Gün 5 - EB-benzeri kümeler (Şekil 2B) ve andMyogenic farklılaşması. <ol><li> 2.1.3.1 tarif edildiği gibi agrega toplayın ve 2 ml PBS ile bir kez yıkama; toplanmış çöktürmek için izin verir. </li><li> PBS çıkarın ve DM orta 3 ml ekleyin; Aynı kuyu üzerinde plaka. </li></ol></li><li> Gün 6 - Gün 20 <ol><li> D6 kaynaktan d20 için her 3 günde bir, taze ortam ile orta yerine. Temsilci myospheres F gösterilirŞEKIL 2E. </li></ol></li></ol></li><li> Denetleme myosphere farklılaşma <ol><li> Daha fazla ilerlemeden önce, bir önceki protokol JoVE 12&#39;de tarif edildiği gibi, OCT bileşiği içine gömülü myospheres bölümleri yaparak myospheres içinde miyojenik farklılaşma etkinliğini kontrol etmek için önerilmektedir. Böyle myognenin gibi miyojen belirteçleri (klon F5D, DSHB) ve miyozin ağır zincir (klon MF20, DSHB) (Temsilcisi sonuçları görmek) için bir imünoflüoresans lekeleme gerçekleştirin. Bu, 5 dakika boyunca sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.5 ile işlenerek antijen alma gerçekleştirmek için kritiktir EB bölümlerinde myogenin için boyama ile başarılı olmak için! Uç. Buna ek olarak, bu F5D ve MF20 antikorlar kullanılarak çift boyama için bu protokolü kullanmak mümkündür. </li></ol></li></ol> 3.. Medya Tarifler <ol><li> ESC orta DMEM-F12 1 mM L-glutamin % 20 Knockout Serum değiştirme ortamı (KOSR) 0.1 mM esas olmayan amino asitleri (NEAA) 50 U / ml penisilin / streptomisin (Pen / Strep) 0.1 mM beta-merkaptoetanol 8 ng / ml temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) </li><li> EB orta DMEM F12 1 mM L-glutamin % 15 FBS % 5 at serumu </li><li> DM ortamı DMEF F12 1X ITS Sıvı Medya Desteği 1X N-2 Ek </li></ol>

<ol>
	<li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+skeletal+muscle+regeneration+from+differentiating+embryonic+stem+cells.">Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells.</a> Nat Med. 14, 134-143 (2008).</li><li>Darabi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ES-+and+iPS-derived+myogenic+progenitors+restore+DYSTROPHIN+and+improve+contractility+upon+transplantation+in+dystrophic+mice.">Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice.</a> Cell Stem Cell. 10, 610-619 (2012).</li><li>Iacovino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+cassette+exchange:+a+rapid+and+efficient+system+enabling+conditional+gene+expression+in+embryonic+stem+and+primary+cells.">Inducible cassette exchange: a rapid and efficient system enabling conditional gene expression in embryonic stem and primary cells.</a> Stem Cells. 29, 1580-1588 (2011).</li><li>Barberi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+engraftable+skeletal+myoblasts+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of engraftable skeletal myoblasts from human embryonic stem cells.</a> Nat Med. 13, 642-648 (2007).</li><li>Goudenege, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myoblasts+derived+from+normal+hESCs+and+dystrophic+hiPSCs+efficiently+fuse+with+existing+muscle+fibers+following+transplantation.">Myoblasts derived from normal hESCs and dystrophic hiPSCs efficiently fuse with existing muscle fibers following transplantation.</a> Mol Ther. 11, 2153-2167 (2012).</li><li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI/SNF+chromatin-remodelling+complex.">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> Embo J. 31, 301-316 (2012).</li><li>Albini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+reprogramming+of+human+embryonic+stem+cells+into+skeletal+muscle+cells+and+generation+of+contractile+myospheres.">Epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells into skeletal muscle cells and generation of contractile myospheres.</a> Cell Rep. 3, 661-670 (2013).</li><li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment,+nerve,+fat,+liver,+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD.">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 5434-5438 (1989).</li><li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD1:+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+Myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts.">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a Myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li><li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts.">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li><li>Ho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+embryonic+stem+cell+chromatin+remodeling+complex,+esBAF,+is+essential+for+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+pluripotency.">An embryonic stem cell chromatin remodeling complex, esBAF, is essential for embryonic stem cell self-renewal and pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 5181-5186 (2009).</li><li>Gomes, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+pluripotent+stem+cells+by+using+cryosections+of+embryoid+bodies.">Analysis of pluripotent stem cells by using cryosections of embryoid bodies.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+purification+of+lentiviral+vectors.">Production and purification of lentiviral vectors.</a> Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).</li><li>Barcova, M., Campa, V. M., Mercola, M., Loring, J. F., Wesselschmidt, R. L., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell+cardiogenesis.">Human embryonic stem cell cardiogenesis.</a> Human Stem Cell Manual: a Laboratory Guide. , 227-237 (2007).</li><li>Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+identification+of+enhancers+in+skeletal+muscle:+the+role+of+MyoD1.">Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1.</a> Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).</li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Burada önerilen protokol doğrudan hESC kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeleri oluşturmak için nasıl açıklar. Önerilen strateji tarama deneyleri ve gelişim çalışmalarında hem modeli &quot;bir çanak içinde hastalık&quot; olarak uygun olabilir süspansiyon mini kasları üretmek için görülmemiş ve olağanüstü bir potansiyele sahip. Ayrıca, hESC myospheres üretmek için yöntem basittir ve tipik olarak geri kazanılan hücre verimi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olan farklılaşması sırasında herhangi bir FACS-ayırma adımı gerektirmez. Bu, tek hücre içine EB bir ayrışma olduğunu ima eder Bunun yanı sıra, farklılaşması sırasında bir ayırma prosedürü toplama müdahale olacaktır. Önerilen yöntem, pluripotent kök hücrelerde ifade olmayan özel faktörlere ve MyoD BaAF60C ile hESC epigenetik reprograming dayanmaktadır. MyoD ve BAF60C &quot;çekirdek&quot; protein kompleksi TH sağlamakişaretleri de transkripsiyon iskelet miyojen programı etkinleştirmek için devam hangi genomik loci. Bu iki faktör lentiviral enfeksiyonların yoluyla hücrelere teslim ve bütün hücrelerde her iki faktörün enfeksiyon yüksek verim elde etmek için kritiktir edilir. Bu yüksek titreli bir virüs ya da seçim işaretçileri sahip virüs kullanılarak elde edilebilir. Kültür koşulları da kas kaynaklı farklılaşma ölçüde optimize de önemli bir rol oynamaktadır. Iskelet myotubes miyojen öncüllerinin dönüşüm elde etmek - Biz, serum serbest tanımlanmış ortamda inkübasyon (ITS insülin transferin içeren) izledi miyojen öncüleri kümeler halinde hESC ifade MyoD/BAF60C farklılaşması için bir serum bazlı farklılaşma protokol öneriyoruz. Ancak, diğer tanımlanmış medya eşit veya daha iyi miyojen farklılaşma elde etmesi mümkündür. Protokolün bir akım sınırlama yanında içeren, fetal sığır serumu, kullanımına dayanır olmasıdırbirçok hayvan proteinleri ve maddeler ing, çok partiye farklılıklar göstermektedir. Bu myospheres içinde kas kaynaklı dönüşümü daha düşük verimlilik veya heterojen neden olabilir. Notun, BAF60/MyoD-expressing hESC türetilen tüm EB-benzeri yapılar myospheres değil; yani, bazı tamamen myofibers oluşan EB gibi agrega vardır. (Sonuçlar bakınız) protokolünün sonunda gerçekleştirilen EB bölümleri üzerinde imüno-boyama ile tahmin edildiği üzere, normal BAF60C ve MyoD ifade hESC türetilen myospheres sayısı 30 ila 60% arasında değişebilir. Sadece myospheres için bir kültür çanak zenginleştirmek için olası bir yaklaşım miyojen muhabiri kullanmak olacaktır. Bu, kısmen ya da farklılaşmış EB benzeri gruplar atarak ve sadece myospheres seçerek kolaylaştıracaktır. Son olarak, tanıtılan faktörlerin zamansal şartları altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması teslimat yöntemi geliştirmek için yararlı olacaktır. Örneğin, BAF60C ve MyoD sadece sh için gereklidirort zaman doğru yönde &quot;tekme&quot; hücreleri için, modifiye mRNA teslim dayalı yöntemler uygulanabilir olabilir. Faktörleri hücreler, endojen proteinler istismar önce daha uzun bir süre için gereklidir Buna karşın eğer, epizomal bir yaklaşım değişkenliği ve genomuna entegrasyonu nedeniyle kontrolsüz etkilerini ortadan kaldırmak için tavsiye edilir. Son olarak, bu önce, iskelet kas içine HESC dönüşüm elde etmek için ya da MyoD (hiçbir zaman sonra) ile aynı anda BAF60C ifade etmek için zorunlu olduğunu not edin. BAF60C önceden ekspresyonu için gereksinim muhtemelen genom 6,15 ile uygun MyoD kromatin dağıtımı için epigenetik manzara ön ayar rolü dayanır. Gibi, gelecekte protokoller bileşikler veya hESC BAF60C ifadesini destekleyen diğer manipülasyonlar tarafından geliştirilmiş olabilir.

Pluripotensini koruyarak çünkü kendi benzersiz yeteneği kendini yenilemek, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) rejeneratif tıpta paha biçilmez bir kaynak olarak kabul edilir. In vitro hastalık modelleme için iskelet kaslarının hastalıklı kas ve HESC-veya uyarılmış pluripotent kök hücrelerinin hücre aracılı iskânından Kök (iPSC) türetilmiş nesil tedaviler belirlenmesi ve birçok nöromüsküler hastalıkların patogenezi tanıtılması amaçlanmıştır çalışmaların önemli hedefleri vardır. Ancak bu çalışmalar iskelet kası hücrelerine dönüştürmek için hESC direnci ve iskelet Miyogenesis doğru HESC-taahhüdünün moleküler düzenlenmesi ile ilgili bilgilerin azlığı meydan olmuştur. Gerçekten de, hESC iskelet kası ata hücreleri üretmek için daha önceki girişimler sadece embriyoit gövde (EB) türetilmiş yavrularıyla veya mezenkimal hücreler transkripsiyonel aktivatör elemanının ve ektopik ifade (alttaki iskelet Miyogenesis aktif hale getirmek için yeterli olduğunu ortaya örPax3 veya Myf5) 1-3 ya da özel kültür koşulları 4-5 maruz kalma. Daha önce (SMARCD3 tarafından kodlanan) SWI / SNF bileşen, BAF60C, kas özel lokusların 6 MyoD aracılı aktivasyonunu sağlar: transkripsiyonel makinelerin önemli bir bileşen olduğunu göstermiştir. Yakın zamanda BAF60C seçici olmaması HESC üzerine başka bir somatik hücreler 8-10 ifade BAF60C gözlenmiştir iskelet Miyogenesis 7&#39;nin MyoD aracılı aktivasyonu için direnç kazandıran keşfettiler bir işlem genel olarak kas kaynaklı dönüştürme anılacaktır. BAF60C Zorla ifadesi doğrudan BAF60C ve miyojen soy 7 doğru hESC taahhüt epigenetik bir imza heybetli myod ile, belirli bir kültür şartlara bağlı, hESC iskelet Miyogenesis etkinleştirmek için myod sağlar. Not, önceki proteomik analiz BAF6 seçici olmadığını ortaya0C, SWI / SNF bileşenleri arasında, EKH 11. Biz üç boyutlu kasılma oluşturmak için toplanmış olabilir iskelet miyoblastların homojen bir nüfus nesil lider, miyojenik soy üzerine hESC epigenetik bir taahhüt altına bu bilgi kullanılır yapıları (myospheres), işlevsel taklit minyatür iskelet kasları 7. Nitekim, hESC iskelet kas atalarıdır üreten bizim yöntem böyle hücresi gibi hücreler farklılaşma sinyallere maruz kadar fenotipik gizildir miyogenik soyu, için hESC epigenetik taahhüt dayanır farklılaştırma ortamı içinde toplama ve kültür (belirli bir protokol bakınız). Bu strateji epigenetik iskelet kası soy kararlı ve histolojik iskelet ve fonksiyonel özellikleri özetlemek üç boyutlu kasılma myospheres oluşumuna uygun olan hESC bir homojendirler ve genişlemesine izin verenkaslar. Myospheres kas hastalıklarının modeli bir &quot;bulaşık hastalık&quot; için işletilebilir minyatür kasların ilk kanıt. Hasta türetilmiş iPSCs üretilen, bu myospheres tedavi edici bileşiklerin yüksek veri akışı tarama için bir araç olarak büyük potansiyel sunan ek olarak, uzun süredir devam eden gelişim soru aydınlatmak için potansiyel ve nadir hastalıkların patojenezi. Ayrıca Gomes et al. 12 ile bir JoVE protokolde tarif edildiği gibi analiz myosphere hemen tek bir okuma, bölme immünohistokimyasal olarak temin edilebilir olduğuna dikkat

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3506</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well low attachment plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFR Matrigel</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciencies</td>
			<td style="width:259px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">MEFs (growth arrested)14</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">KOSR</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1mM L-glutamine (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NEAA (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polybrene</td>
			<td style="width:259px;">Millipore</td>
			<td style="width:259px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">N2-supplement&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:259px;">HyClone</td>
			<td style="width:259px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">HS</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;"><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</a></td>
			<td style="width:259px;">Stemgent</td>
			<td style="width:259px;">01-0014-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">bfgf</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">4114-TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:259px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:259px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyoD</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:259px;">554130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyHC</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-myogenin</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">F5D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

Insan embriyonik kök hücreleri (hESC) ikinci iskelet kas hücrelerinin homojen ve bol nüfusun Üretimi hücre bazlı terapiler için ve insan nöromüsküler hastalıklar modeli bir &quot;bir bulaşık hastalık&quot; için bir gerekliliktir. Örneğin düşük yoğunlukta ve ilgi nüfus, hem de üç boyutlu kasılma yapıların oluşumu için protokoller eksikliği heterojenlik gibi büyük engel, nöromüsküler bozukluklar için kök hücrelerin kullanımı da sınırlıdır. Biz HESC tanımlanan faktörlerin ektopik getirilmesi ile bu sınırları aşan bir protokol tasarladık - kas belirleyicidir MyoD ve SWI / SNF kromatin karmaşık bileşen BAF60C biçimlenme - iskelet kası hücrelerine hESC yeniden programlamak mümkün olduğunu. Burada protokol HESC türetilmiş miyoblastları oluşturmak ve üç boyutlu minyatür yapılar (myospheres) onların kümelenmeyi teşvik için kurulan açıklayan fonksiyonel taklit minyatür iskelet kasları 7 </sup&gt;.

Şekil 1A protokolünün şematik hESC myospheres oluşturmak için önerilen gösterir. (Oklar ile belirtilen) kontrol etmek için en önemli adımlar hESC enfeksiyonun etkinliği ve myospheres içindeki kas kaynaklı dönüştürme bulunmaktadır. Deneylerde GFP floresan taşıyan lentiviral vektör kodlama BAF60C yararlanmak. Genellikle BAF60C ifade nüfus için zenginleştirmek için enfeksiyondan sonra BAF60C ve FACS-sıralama 72 saat ile hücreleri enfekte etmektedir. Hücreler izdiham yaklaşık% 70-80 ulaştığında, biz MyoD lentivirüsünün ile enfekte. İlk enfeksiyondan sonra, normal olarak bu izdiham ulaşmak için, hücreler için iki ya da üç gün sürer. Şekil 1B bulaşmamış HESC misli indüksiyon göreceli olarak eksojen genlerin ifade seviyelerini gösterir. Şekil 1C tanıtılan faktörlerin protein seviyesinde ifade ve dağılımını gösterir. BAF60C<html> MyoD ifade MyoD antikoru ile bağışıklık fluorışıması yoluyla tespit edilir ise ifade GFP floresan olarak gösterilir. Biz EB gibi agrega içine enfekte hESC farklılaşma başlatmak gün Günü 0 düşünün. DM ortamı içinde 15 gün sonra, myospheres bir kısmı (genelde bir bütün oyuk) bileşik 12 Ekim gömülü ve kas kaynaklı dönüştürme etkinliğini kontrol etmek için kas kaynaklı işaretleri için immünofloresan gerçekleştirmek için kesilir. Şekil 1D myogenin ve miyozin ağır zincir için temsili boyamasını göstermektedir optimal miyojen farklılaşma. Myospheres belki de daha küçük myospheres ile füzyon sonucunda, farklı ya da anormal şekillere sahip olabilir. Günün 10 başlayarak, (film 1 ve 2 bakınız) myospheres sporadik daralmayı gözlemlemek mümkündür. 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. A) hESC. B&#39;den myospheres) BAF60C ve MyoD (H9-BM) QRT-PCR ile gözlenmiş ve katı bir endüksiyon olarak ifade ile enfekte HESC olarak dışsal genin mRNA seviyeleri üretimi için kullanılan protokol şematik olarak enfekte hESC taklit göre nedeniyle. D) immünofloresan Myogenin için boyandı myosphere bölümlerinde gerçekleştirilmiştir vektöründe IRES-GFP elemanı (MYOG için MyoD boyama (kırmızı) ve BAF60C floresan (yeşil) arası (H9-ctr). C) immünofloresan görsel ), miyozin ağır zincir (MyHC) ve DAPI için zıt (İmmünofloresan detaylarını görmek). Ölçek çubuğu 100 mikron. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> Şekil 2. Farklı aşamalarında hücre görünümü Temsilcisi resimlerifarklılaşması (Bölüm II) için enfeksiyon (part I) protokolü. Ölçek çubuğu 100 mikron. EB-benzeri yapıların ise d1 den d5 şekil (D) çoğunlukla dairesel, Şekil 1A şeması beklenmeyen bir şekil sunmak ve kültür heterojen göre 15 gün içinde büyüdü myospheres; E ve F iki örneklere bakın.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming at JoVE.com

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları.

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

generation-of-myospheres-from-hescs-by-epigenetic-reprogramming

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Görüntüleme.  Sanford-Burnham Institute for Medical Research.  Burada, biz insana biyolojik özelliklerini özetlemek permisif kültür koşulları altında kasılma myofibers (myospheres) üç boyutlu kümeler oluştururlar iskelet kası atalarıdır, homojen bir nüfusa üreten doğru insan embriyonik kök hücreleri (hESC) epigenetik yeniden programlama dayalı bir protokol açıklar iskelet kasları. 

Video: Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.


This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells. Part 1 of 3.

MEFS I Matrigel: MEFS Durum Pasajlanması hESC

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

Biyoloji

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

MEFS Matrigel 2 Matrigel üzerine MEFS Yarma hESC:

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

Matrigel MEFS Matrigel 3: Matrigel üzerine gelen Pasajlanması hESC

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Genetik ve epigenetik Analizleri Parafin Gömülü Malzeme DNA Ekstraksiyon

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Elde Edilen Fare Üretimi

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.