Bu protokol, pulmoner lökosit adezyonu ve kılcal perfüzyonu in vivo olarak görüntülemek için vakumla stabilize edilmiş bir sistemin cerrahi olarak hazırlanmasını ve kullanımını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, minimal fiziksel travma ile sağlam aynalı akciğerin stabil yüksek çözünürlüklü intravital görüntülemesine izin vermesidir. Başlamak için, vakum kanalının kirlenmesini önlerken dış halkanın üstüne ince bir vakum gresi tabakası uygulayarak görüntüleme penceresini hazırlayın.
Pencereye temiz bir 8 milimetrelik cam kapak kayması yerleştirin ve bir conta oluşturmak için yavaşça aşağı bastırın. Görüntüleme penceresini dijital basınç göstergesi ile donatılmış ve 50 ila 60 milimetre cıva sabit emme sağlayabilen bir vakum pompasına bağlayın. Bir uzunlukta fiber optik kabloyu 20 gauge endotrakeal kanülden geçirin ve ucu lidokain HCL'ye batırın.
Anesteziden sonra, üst kesici dişler spekulumdaki boşluğa sığacak şekilde modifiye edilmiş bir otoskop yerleştirin. Epiglottis ve ses telleri açıkça görülebilene kadar kapsamı ve dil pozisyonunu ayarlayın. Fiber optik kabloyu spekulumdaki boşluktan yerleştirin ve kabloyu ses telleri arasında geçirmek için küçük dairesel hareketler kullanın, ardından fiber optik kabloyu bir kılavuz olarak kullanarak, fareyi entübe etmek için kanülü yavaşça trakeaya kaydırın.
Ventilasyona% 1.5 izofluran ile başladıktan sonra, pedal refleksini test ederek anestezi derinliğini onaylayın. Kanülü tıbbi bantla burnuna sabitleyin. Sağ ön pençeyi saat dokuz konumundaki ısıtma yastığına sabitlemek için etiketleme bandı kullanın ve sol arka pençeyi kaudal olarak uzatın ve saat altı konumunda sabitleyin.
Bir bez bant kullanarak, sol ön pençeyi hafifçe saat 12 pozisyonuna kadar gerin ve bandın diğer ucunu intravital mikroskopi platformunun tepesine sabitleyin, ardından deney boyunca hayati belirtileri izlemek için bir rektal sıcaklık probu ve pençe nabız oksimetresi uygulayın. Fareyi ameliyata hazırlamak için,% 70 alkollü mendille göğüs kafesini ve karnı sterilize edin ve farenin sol tarafındaki saçları nemlendirmek için hafif bir mineral yağ tabakası uygulayın. Altta yatan kas tabakasını açığa çıkarmak için göğüs kafesinin dibine yakın küçük bir kesi yapın, ardından ilk insizyonu uzatın ve göğüs kafesini açığa çıkarmak için künt diseksiyon kullanın.
Hemostatik forseps kullanarak, disseke edilmiş epitel ve yağ dokusunu kavrayın ve cerrahi alandan temizleyin. Lökositleri ve kan akışını floresan olarak etiketlemek için, kuyruk damarı yoluyla kilogram bolus başına 2.5 mililitrelik bir Rhodamine 6G ve FITC-albümin uygulayın. Dişli forseps kullanarak, kaburgayı son ilhamda akciğer tabanının konumundan hemen daha düşük bir seviyede kavrayın.
Kaburgayı akciğerden uzaklaştırmak için forsepsleri hafifçe geri çekin ve ardından bir pnömotoraksı indüklemek için kaburgayı kesin. Akciğere dokunmamaya dikkat ederek insizyonu her iki yönde de yanal olarak uzatın. Bir sonraki en yüksek kaburgayı künt forseps ile kavrayın ve akciğerin göğüs duvarından düşmesine izin vermek için hafifçe geri çekin.
Akciğer ayrılmazsa, akciğerin altta yatan plevraya yapışmasına ve böylece daha kolay düşmesine neden olmak için göğüs duvarını akciğere hafifçe bastırın. Orijinal insizyona sonunda sternuma kadar ve akciğerin tepesi açığa çıkana kadar kraniyal olarak devam edin. Ortaya çıkan kanamayı hafifletmek için pamuklu aplikatörler ve gazlı bez kullanın.
Göğüs boşluğunun dorsal kısmındaki interkostal kan damarlarını açığa çıkarmak için göğüs kafesini kaldırın, akciğere zarar vermemeye dikkat edin, omurganın yakınındaki en düşük interkostal damarı koterize edin, ardından bitişik kaburgayı kesin. Kraniyal olarak hareket etmek ve sonunda, göğüs kafesinin yaklaşık bir ila iki santimetrelik bir kısmını çıkarmak için tekrarlanan bir koterizasyon ve kesme paterni kullanın. Görüntülemeye hazırlanmak için, intravital mikroskopi platformunu mikroskop aşamasına aktarın ve görüntüleme penceresini doğrudan maruz kalan akciğerin üzerine yerleştirin.
Akciğer yüzeyine yapışıp stabilize olana kadar görüntüleme penceresini dikkatlice indirmek için mikro manipülatörü kullanın. Pulmoner mikrosirkülasyonu görselleştirmek için, 20x objektif ve standart FITC ve Rhodamine filtre setleri ile donatılmış geniş bir alan floresan mikroskobu kullanın. Videoları optimum kontrastla kaydetmek için siyah beyaz bir CCD kamera kullanın.
FITC filtre setini kullanarak, kan akışının yakınsak modeline dayalı bir pulmoner mekan tanımlayın ve mekanın odaklandığı 30 saniyelik bir video kaydedin, ardından lökositleri görselleştirmek için Rhodamine filtre setini kullanarak kaydı aynı görüş alanında tekrarlayın. Bir pulmoner arteri bulmak için, farklı bir kan akışı modeline sahip bir damarı tanımlamak ve 30 saniyelik bir video kaydetmek için FITC filtre setini kullanın. Lökositleri görselleştirmek için Rhodamine filtre setini kullanarak kaydı aynı görüş alanında tekrarlayın.
İlgilenilen kılcal bölgeleri bulmak için, daha büyük damarlarla kesişmeyen bir alveol ve kılcal damar alanını tanımlamak ve 30 saniyelik bir video kaydetmek için FITC filtre setini kullanın. Lökositleri görselleştirmek için Rhodamine filtre setini kullanarak kaydı aynı görüş alanında tekrarlayın. Bu video, yeşil okla gösterildiği gibi bir pulmoner mekan içindeki kan akışının FITC görüntülemesini göstermektedir.
Rhodamine görüntüleme, lökositlerin kırmızı oklarla gösterilen iki yapışkan lökosit ile aynı mekanda görselleştirilmesine izin verir. Bu yöntemler aynı fenomeni ve pulmoner arterleri ve ilgilenilen kılcal bölgeleri görselleştirmek için de uygulandı. Mikrodolaşım parametrelerinin miktarını göstermek için, fareler pulmoner inflamasyonu indüklemek için intranazal LPS ile tedavi edildi.
Pulmoner lokallerde lökosit kaçakçılığı, naif ve LPS ile tedavi edilen farelerde analiz edilen endotel bölgelerini temsil eden ana hatlarıyla gösterilmiştir. LPS ile tedavi edilen farelerde lökosit yapışması ve yuvarlanması artmıştır. Pulmoner arteriyallerde lökosit kaçakçılığı, naif ve LPS ile tedavi edilen farelerde analiz edilen endotel bölgelerini temsil eden ana hatlarıyla gösterilmiştir.
LPS ile tedavi edilen farelerde lökosit yapışması daha yüksekti. Bu şekil, naif ve LPS ile tedavi edilen farelerde pulmoner kılcal damarlar içinde lökosit yapışmasını göstermektedir. Lökosit yapışmasının LPS ile tedavi edilen farelerde naiflere göre daha yüksek olduğu gösterilmiştir.
Bu şekil, naif ve LPS ile tedavi edilen farelerde pulmoner kılcal damarların perfüzyonunu göstermektedir. LPS ile tedavi edilen farelerde fonksiyonel kılcal yoğunluğun naiflere göre daha düşük olduğu gösterilmiştir. Bu protokolün birçok zorlu yönü var.
Farenin platformdaki konumunu optimize etmek, cerrahi ve görüntüleme adımlarını çok daha tekrarlanabilir hale getirebilecek basit bir adımdır. Bu prosedür çok çeşitli çalışma parametrelerine ve mikroskopi yaklaşımlarına uyarlanabilir. Bu nedenle, hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda pulmoner mikrosirkülasyonun daha fazla araştırılmasını kolaylaştırmalıdır.
