Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri LJMC için hibe R01-HL87290, R01-HL87290-S1 ve R01-AI082610 tarafından da desteklenmiştir.

1. Kraniotomi 8-10-haftalık farelerde kraniotomi titanyum çubuk baş hayvanın yer almamış olması dışında, daha önce açıklanan 1 olarak önceden yapılması gerekir. Kronik kafa penceresi pial mikrosirkülasyon hatta aylar implante edildikten sonra istikrarlı bir hazırlık izin muayene. Genellikle 2-3 hafta kafatası pencere implantasyon sonrası çalışmaları yapmak. 2. Intravital mikroskopi <ol><li> İki-üç hafta sonra kraniotomi, vücut ısısı kontrol edilmeli ve sonra fare ile hafifçe anestezi izofluran (indüksiyon için% 4, bakım için% 1-2). Hafif anestezi deneysel prosedür sırasında hayvan stres ve rahatsızlık önlemek için kullanılır. </li><li> Hayvanlar daha sonra stereotaksik bir çerçeve ve dikkatle kulak bar kullanarak güvenli bir şekilde baş yüzükoyun pozisyonda yerleştirilir. Düzeyi, sağ ve sol kolları kullanılarak ayarlanır. Çekirdek vücut ısısını bir ısıtma yastığı kullanılarak korunur. Serebral sıtma ile fareler hipotermi geliştirmek için, sıcaklık ayarları her bir hayvan için ayarlanması gerekir. </li><li> Kafa pencerede kapak kayma, mineral yağ ve pencerenin altında gemiler panoramik bir resim, bir stereomikroskopta ve bir dijital fotoğraf makinesi (Nikon Coolpix 995, Japonya) yardımı ile alınır ile ıslatılmış bir pamuk çubukla hafifçe temizlenir. Resim, basılı, tespit ve tarih ve damar çapı ve kırmızı kan hücre (RBC) hızlarının ölçümleri için bir harita olarak kullanılır. </li><li> Fare, sonra bir intravital mikroskop aşaması (Leica-McBain, San Diego, CA özel) aktarılır. Bir damla su, diş akrilik oluşturduğu yararlanarak kafatası pencere üzerine yerleştirilir, odak ayarlanır. Ölçümler bir 20X (LUMPFL-WIR, sayısal diyafram 0.6 Olympus) su altında kalacak amacı ile yapılmaktadır. Aynı damarların bazal düzeylere doğrudan karşılaştırmalar, küçük bir örnek popülasyonları için daha sağlam istatistikler için izin olabilir takip edilmektedir. Görüntüler bir dijital düşük ışık koşullarında yüksek hızlı kamera (Hamamatsu C9300-221, Japonya), veya bir VCR kaset bağlı düşük ışık analog kamera (Cohu 4815, San Diego, CA) (JVC, Japonya), damgalı zaman (MicroImage Video kullanılarak yakalanır Sistemleri, Boyertown, PA) ve renkli monitör (PELCO, Clovis, CA). Bant kayıt başlamadan önce doğru tespit ve zaman damgası, bu tür olaylar recoded olduğu zaman diliminde belgeleyen olayların belirlenmesini sağlar. </li><li> Gemilerin ilk onay kan damarlarında akan ise hazırlık kalitesini değerlendirmek için yapılan ve. Sonra, ölçülecek olan gemilerin seçimi yapılır ve değişik çaplarda venüller ve arterioller (fare pial hazırlıkları, en gemiler 20 ve 80μm arasında değişmektedir) ve pencere tarafından maruz kalan alan içinde farklı yerlerde kapsamalıdır. Arteriol ve venüller geminin etkileri kan akışı (dağıtan veya kan toplar olmadığını) yönünü kontrol ederek kolayca ayırt edilebilirler. Çalışmalarda, ölçümleri 12 damarlarında yapılır. Ölçülecek her noktanın tam yerini pial damarsal resim açıklamalı. </li><li> Her nokta için, bir görüntü kesme cihazı (Resim Kesme, Vista Electronics, San Diego, CA) 2 damar çapı ile ölçülür. Nokta seçildikten sonra, geminin görüntü dikey konumda uyumlu ve karşı aşırı hizalanır ve okuma belgelenmiştir kadar görüntü makaslanmış. Bu değer, Reticle Kalibrasyon Stage Mikrometre (Edmund Optik A.Ş., Barrington, NJ) kullanarak her bir spesifik büyütme önceki kalibrasyon mikrometre tercüme edilebilir. </li><li> Her nokta için en az 30 saniye boyunca eritrosit izleme kaydedilir. Izleme için kan örneği toplanır ve eritrositler floresan ile etiketlenmiş boya Dil (Molecular Probes, Carlsbad, CA) ve kuyruk ven yoluyla aşılanan bir ~ 0,4-0,5% 3 in vivo konsantrasyonu elde etmek için carbocyanine. , Etiketli hiçbir infüzyon; Plasmodium berghei ANKA (PBA) yeşil flüoresan protein (CJ Janse ve AP Waters tarafından yatırılan PBA-GFP, Sıtma Araştırma ve Referans Reaktifi Kaynak Merkezi MR4, Manassas, VA bağış) ifade ile enfekte hayvanların hücre gerekli. Saniyede 150 kare hızında video görüntüleri kaydedilir. Bu oran 8 mm / sn &#39;ye kadar hızlarının belirlenmesi için bir video çerçeve üzerinde bir hücre 05:59 görüntüler elde etmek için Video görüntüleri Adobe Premier 4.0 yazılımı kullanarak bir kişisel bilgisayar ile sayısallaştırılmış ve her hücre görüntü için xy koordinat verileri SigmaScan Pro 4.0 yazılımı (SPSS, Chicago, IL) 4 kullanılarak elde edilir . Hücre pozisyonları göz eğitimli bir gözlemci, iyi bir tahmin, bir hücrenin merkezinde, yerini vermek gösterildi verilen elle yerine, görüntü analiz yöntemi ile belirlenirh genel olarak çoğu hücre yönelimleri için gözlenen maksimum floresans konuma karşılık gelir. Birden fazla pozisyon ve hız tespitler her hücre için yapılan ve ortalama eritrosit hızı elde etmek için ortalama. </li><li> RBC hız ölçümleri çevrimdışı yapıldığında, her bir fare için toplam gözlem süresi 10-15 dakika anestezi cardiodepressive etkilerinin en aza indirilmesi aşmamaktadır. </li><li> Damar çapı ve RBC hız ölçümleri sonra, her damarda kan akımının hesaplanmasında aşağıdaki formül kullanılarak yapılabilir: Q = V x π (D / 2) 2, Q = kan akımı, V = RBC hızı ve D = damar çapı. </li><li> Bu prosedürler zaman içinde tekrar edilebilir. Örneğin, fare modelinde serebral sıtma, enfeksiyon günde 4 günlük ölçümler gerçekleştirir. Her fare için her gün elde edilen değerler% 100 olarak kabul edilir ile ilgili günlük 0 (pre-enfeksiyon), normalize edilir. </li><li> Örneğin gelişmiş perfüzyon pial damarların lökosit ve / veya trombosit haddeleme ve bağlılığın değerlendirmesi ve analizi için, damar çapı ve kan akım ölçümleri yanı sıra, ek değerlendirmeler yapılabilir. Bu ölçümler floresan etiketli işaretleyicileri yardımıyla yapılmaktadır. Sıtma durumda, biz de GFP ifade PBA suşu kullanılarak yoluyla dolaşan veya yapışık parazitleri tespit edebilir. </li><li> Perfüzyon değerlendirmesi için bir çözüm FITC etiketli albumin (Sigma, St Louis, MO 50μg/mouse), ve Texas Kırmızı (TxR) etiketli pan-lökosit işaretleyici CD45 karşı antikor pial damarlara lökosit bağlılığı ölçmek için ( Invitrogen, Carlsbad, CA 4μg/mouse). Bunun için, 25μL Albumin-FITC (2mg/mL) ve anti-CD45-PE antikor 20μL (200μg/mL) karıştırılır ve önceden ısıtılmış kuyruk ven enjekte edilir. Daha sonra fare sızıntı ölçümleri albümin-FITC 15 dakika dolaşmasına izin alacağı ancak, hemen görüntülü olabilir. XF100-2 (Omega Optik, Brattleboro, VT) ve anti-CD45-TxR floresan (615nm) çıkıldı ve albümin-FITC ve GFP (GFP pRBC PBA-) tarafından yayılan Yeşil floresan (518nm) kullanarak ve ALPHA Canlı yakalanır XF42: Canlı Standardı ile ele geçirdi. </li><li> Floresan etiketli albumin damar ağı, delici damarları dahil olmak üzere gelişmiş görselleştirme sağlar ve non-perfüze veya altında-perfüze damarları kontrol etmek için serebral sıtma gibi hastalık durumlarında yararlıdır. Ayrıca vasküler sızıntı 5 ölçmek için kullanılabilir. </li><li> Floresan etiketli anti-CD45 antikorları pial damarlara lökosit yuvarlanma ve yapışma belirlemek ve ölçmek için kolaylaştırır. Nicelleştirmesinde önyargı önlemek için, aynı noktalar kan akışını ölçmek için önceden tanımlanmış bir yuvarlanma ve yapışma ölçmek. Lökosit adezyonu Niceleme 100μm damar uzunluğu lökosit sayısı sayım yapılır. Rolling kan hızı 30 saniye boyunca aynı 100μm uzunluğu göre çok daha yavaş bir hızda seyahat lökosit sayısı sayarak sayısal. </li></ol> 3. Temsilcisi sonuçları <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Kraniyal pencere üzerinden erişilebilir fare pial damar ağı (Adım 2.6) Resimler. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Fare pial mikrosirkülasyon intravital mikroskopi için set (Steps 3,1-3,5) Şematik gösterilecek. 1: intravital mikroskop, 2: 20X suya daldırma amacı; 3: ışık kaynağı; 4a: dijital düşük ışık yüksek hızlı kamera, 4b: analog kamera, 5: stereotaksik çerçeve fare, 6 bilgisayar monitörü, 7: Analog Shearer görüntü kesme (ok), damar çapı ölçmek için nasıl yapıldığını gösteren izler. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. (Adım 3,6-3,8), yüksek hızda floresan video kayıtları hücre takip ederek Mikrovasküler kırmızı kan hücre hız ölçümleri . F Resimleri bir kamera tarafından mikroskobik bir alan ayrılmış geçiş, tek bir hareket RBC gösteren bir pial damar dizisi görüntüleri. Alanında geçiş öncesi kalibre mesafe ile, 15 veya daha fazla hücre çerçevesi konumlarında kare Manuel belirlenmesi, bir Excel elektronik tablosu yardımı ile her bir geminin ortalama RBC hızının hesaplanması sağlar. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. (Adım 3.9) Veri Plasmodium berghei ANKA (PBA) enfekte olmuş fareler (n = 5) ve bulaşmamış kontrol farelerde zamanla pial kan akışındaki değişiklikleri gösteren bir temsilcisi deney (n = 5). Pial kan akışını kontrol farelerde zaman içinde nispeten sabit olduğunu dikkate alarak, PBA enfekte farelerde kan akışının belirgin bir azalma göstermektedirserebral sıtma geliştirme (Günde 6) zamanında. Veriler ortalama ± SEM. <img src="/files/ftp_upload/2184/2184fig5.jpg" alt="Şekil 5" /> Şekil 5. Plasmodium berghei ANKA ile enfekte bir fare pial damarlara yapışık lökositlerin (Adım 4.3) büyük bir kısmı, anti-CD45-Texas Kırmızı floresan antikorlar ile boyanarak ortaya koyduğu gibi.

<ol>
	<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging.">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J. Vis. Exp. (15), (2008).</li><li>Intaglietta, M., Tompkins, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+measurements+by+video+image+shearing+and+splitting.">Microvascular measurements by video image shearing and splitting.</a> Microvasc. Res. 5, 309-312 (1973).</li><li>Briceno, J. C., Cabrales, P., Tsai, A. G., Intaglietta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+displacement+of+red+blood+cells+during+hemodilution+and+the+effect+on+arteriolar+oxygen+profile.">Radial displacement of red blood cells during hemodilution and the effect on arteriolar oxygen profile.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, 1223-1228 (2004).</li><li>Bishop, J. J., Nance, P. R., Popel, A. S., Intaglietta, M., Johnson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+erythrocyte+aggregate+size+and+flow+rate+in+skeletal+muscle+venules.">Relationship between erythrocyte aggregate size and flow rate in skeletal muscle venules.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 286, H113-120 (2004).</li><li>Baldwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+hemoglobins+produce+venular+interendothelial+gaps+and+albumin+leakage+in+the+rat+mesentery.">Modified hemoglobins produce venular interendothelial gaps and albumin leakage in the rat mesentery.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 277, H650-H659 (1999).</li><li>Cabrales, P., Zanini, G. M., Meays, D., Frangos, J. A., Carvalho, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+cerebral+malaria+is+associated+with+a+vasospasm-like+microcirculatory+dysfunction,+and+survival+upon+rescue+treatment+is+markedly+increased+by+nimodipine.">Murine cerebral malaria is associated with a vasospasm-like microcirculatory dysfunction, and survival upon rescue treatment is markedly increased by nimodipine.</a> Am. J. Pathol. 176 (3), 1306-1315 (2010).</li></ol>

Burada açıklanan intravital mikroskopi yöntemi fare pial mikrosirkülasyon detaylı gözlem için benzersiz ve güçlü bir araç sağlar. Diğer bireysel arteriyollerin ve venüller singling ve damar çapları, RBC hızları, kan akımı, bağlılık ve lökosit, trombosit ve diğer kan elemanları, vasküler kaçak, doku pH ve pO2 haddeleme gibi parametreleri bir dizi değişiklikler ölçüm sağlar ve potansiyel olarak pek çok uygulamaları. In vivo vasküler yanıt ilaç idaresine gibi müdahaleler üz...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Isoflurane</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>FDG9623</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Carbocyanine dye Dil </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Probes</td>
<td>D306</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Albumin-FITC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>A9771</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Anti-CD45-TxR Ab</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>MCD4517</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P. berghei ANKA-GFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MR4</td>
<td>MRA-865</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window

Bu deneysel model, in vivo floresan mikroskobu kullanarak, akut ve kronik, fizyolojik ve patofizyolojik hemodinamik, inflamatuvar ve metabolik koşullar sırasında fare pial mikrosirkülasyon değerlendirmek için tasarlanmıştır . Kapalı bir kafa penceresi farelerin sol parieto-oksipital kortekste üzerine yerleştirilir. Yerel mikrosirkülasyon epi ve floresan aydınlatma, ve damarların çapları ve kırmızı kan hücre (RBC) hızları yapılan ölçümleri kullanarak pencere üzerinden gerçek zamanlı olarak kaydedilir. RBC hızı gerçek zamanlı çapraz korelasyon ve / veya floresan etiketli eritrositler kullanılarak ölçülür. Perfüzyon ve vasküler sızıntı pial damarları ve değerlendirme Lökosit ve trombosit bağlılık Albumin-FITC ve anti-CD45-TxR antikorları gibi floresan etiketli işaretleyicileri yardımıyla yapılır. Mikrosirkülasyon birkaç gün içinde tekrar tekrar video kayıt olabilir. Biz ilk defa pial mikrosirkülasyon çalışmada farelerde Plasmodium berghei ANKA enfeksiyonu seyri sırasında dinamik değişiklikleri takip edebilecek ve CM ifade kan derin düşüş, vazokonstriksiyon ile karakterize mikrosirkulasyonu işlev bozuklukları ile ilişkili olduğunu göstermek için pencereyi kapat beyin intravital mikroskopi için kullanılan akış ve sonuçta vasküler çöküşü.

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window at JoVE.com

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Kapalı Kranial Pencere kullanarak Fare Beyin Mikrosirkülasyon intravital Mikroskopi

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

intravital-microscopy-mouse-brain-microcirculation-using-closed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.2K Görüntüleme.  University of California, San Diego. Intravital mikroskopi pial mikrosirkülasyon zamansal ve mekansal hemodinamik ve inflamatuar olayları takip etmek.

Video: Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

An Experimental Platform to Study the Closed-loop Performance of Brain-machine Interfaces

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine interface to assess the robustness of different control-laws applied to a closed-loop image stabilization task. Taking advantage of the well-characterized fly visuomotor pathway we record the electrical activity from an identified, motion-sensitive neuron, H1, to control the yaw rotation of a two-wheeled robot. The robot is equipped with 2 high-speed video cameras providing visual motion input to a fly placed in front of 2 CRT computer monitors. The activity of the H1 neuron indicates the direction and relative speed of the robot's rotation. The neural activity is filtered and fed back into the steering system of the robot by means of proportional and proportional/adaptive control. Our goal is to test and optimize the performance of various control laws under closed-loop conditions for a broader application also in other brain machine interfaces.

We use a closed-loop fly-machine interface to investigate general principles in neuronal control.

Beyin-makine Arayüzler Kapalı döngü Performans Çalışması için Deneysel Bir Platform

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine ...

Nörobilim

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Extinction Training During the Reconsolidation Window Prevents Recovery of Fear

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents the return of fear. Pavlovian fear-conditioning paradigms are commonly employed to create a controlled, novel fear association in the laboratory. After pairing an innocuous stimulus (conditioned stimulus, CS) with an aversive outcome (unconditioned stimulus, US) we can elicit a fear response (conditioned response, or CR) by presenting just the stimulus alone1,2 . Once fear is acquired, it can be diminished using extinction training, whereby the conditioned stimulus is repeatedly presented without the aversive outcome until fear is no longer expressed3. This inhibitory learning creates a new, safe representation for the CS, which competes for expression with the original fear memory4. Although extinction is effective at inhibiting fear, it is not permanent. Fear can spontaneously recover with the passage of time. Exposure to stress or returning to the context of initial learning can also cause fear to resurface3,4.
Our protocol addresses the transient nature of extinction by targeting the reconsolidation window to modify emotional memory in a more permanent manner. Ample evidence suggests that reactivating a consolidated memory returns it to a labile state, during which the memory is again susceptible to interference5-9. This window of opportunity appears to open shortly after reactivation and close approximately 6hrs later5,11,16, although this may vary depending on the strength and age of the memory15. By allowing new information to incorporate into the original memory trace, this memory may be updated as it reconsolidates10,11. Studies involving non-human animals have successfully blocked the expression of fear memory by introducing pharmacological manipulations within the reconsolidation window, however, most agents used are either toxic to humans or show equivocal effects when used in human studies12-14. Our protocol addresses these challenges by offering an effective, yet non-invasive, behavioral manipulation that is safe for humans.
By prompting fear memory retrieval prior to extinction, we essentially trigger the reconsolidation process, allowing new safety information (i.e., extinction) to be incorporated while the fear memory is still susceptible to interference. A recent study employing this behavioral manipulation in rats has successfully blocked fear memory using these temporal parameters11. Additional studies in humans have demonstrated that introducing new information after the retrieval of previously consolidated motor16, episodic17, or declarative18 memories leads to interference with the original memory trace14. We outline below a novel protocol used to block fear recovery in humans.

Conditioned fear can be diminished through an inhibitory process called extinction, but can resurface under conditions such as the passage of time or exposure to stress. Our protocol presents a novel way of preventing fear recovery by introducing extinction during the reconsolidation window (the re-storage phase of a reactivated memory).

Reconsolidation Pencere sırasında Extinction Eğitim Fear Kurtarma önler

Fear is maladaptive when it persists long after circumstances have become safe. It is therefore crucial to develop an approach that persistently prevents ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Bir Model Olarak Koku Sistemi Akson Büyüme Modelleri ve Morfoloji Eğitim için<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies using Drosophila have contributed important breakthroughs in understanding neurological processes. Thus, with the goal of understanding the cellular and molecular basis of TBI pathologies in humans, we developed the High Impact Trauma (HIT) device to inflict closed head TBI in flies. Flies subjected to the HIT device display phenotypes consistent with human TBI such as temporary incapacitation and progressive neurodegeneration. The HIT device uses a spring-based mechanism to propel flies against the wall of a vial, causing mechanical damage to the fly brain. The device is inexpensive and easy to construct, its operation is simple and rapid, and it produces reproducible results. Consequently, the HIT device can be combined with existing experimental tools and techniques for flies to address fundamental questions about TBI that can lead to the development of diagnostics and treatments for TBI. In particular, the HIT device can be used to perform large-scale genetic screens to understand the genetic basis of TBI pathologies.

A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila

Here we describe a method to inflict closed head traumatic brain injury (TBI) in Drosophila. This method provides a gateway to investigate the cellular and molecular mechanisms that underlie TBI pathologies using the vast array of experimental tools and techniques available for flies.

Kapalı Başkanı Travmatik Beyin yaralayabilecek Bir Yöntem<em&gt; Drosophila</em

Traumatic brain injury (TBI) affects millions of people each year, causing impairment of physical, cognitive, and behavioral functions and death. Studies ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated thinning of the skull. Cranial window surgery is typically performed with a high speed rotary drill, and many investigators find it challenging to prevent the drill from damaging the delicate dura and blood vessels. Extensive training and practice is required to remove the bone without damage to underlying tissue and thus cranial window surgery can be difficult, time consuming, and produce tissue damage. Piezoelectric surgery, which is extensively used for maxillofacial and dental surgery, utilizes ultrasonic vibrations to remove bone without damaging soft tissues. We have developed a method applying piezoelectric surgery to improve cranial window surgery in mice in preparation for multiphoton imaging. Comparisons within our lab find that the method requires less surgery time and has a lower average rate of complications due to dural bleeding than cranial window surgery with a rotary drill.

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoelectric surgery has led to improvements in human maxillofacial and dental surgery. We have developed a protocol to optimize piezoelectric surgery for cranial window surgery in mice.

Piezo yüksek doğruluk cerrahi Osteal kaldırma (FAZÖR): Farelerde geliştirilmiş kafatası pencere ameliyat için bir teknik

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated digital vaporizer is utilized to achieve a stable plane of anesthesia at a low-flow rate of isoflurane. A single vertebral spine is removed, and a commercially available cover-glass is overlaid on a thin agarose bed. A 3D-printed plastic backplate is then affixed to the adjacent vertebral spines using tissue adhesive and dental cement. A stabilization platform is used to reduce motion artifact from respiration and heartbeat. This rapid and clamp-free method is well-suited for acute multi-photon fluorescence microscopy. Representative data are included for an application of this technique to two-photon microscopy of the spinal cord vasculature in transgenic mice expressing eGFP:Claudin-5 &#8212; a tight junction protein.

This protocol describes implantation of a glass window onto the spinal cord of a mouse to facilitate visualization by intravital microscopy.

Farede Laminektomi ve Omurilik Penceresi İmplantasyonu

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

Türdeş olmayan dağıtım ayirt kullanarak fare beynindeki bir sinaptik protein miktarının

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...