Bu protokol, Drosophila dizisini model bir sistem olarak kullanarak hücre içi kaçakçılığın ve bazal membran proteinlerinin salgılanmasının karakterizasyonuna izin verir. Tekniğimizin temel avantajı, endojen olarak etiketlenmiş proteinler ve Airyscan süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak bazal membran proteinlerinin hücre içi trafiğinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine izin vermesidir. Bu protokol, bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını görüntülemek için geliştirilmiş olsa da, diğer proteinlerin ve hücre kültürü ve organoidler de dahil olmak üzere diğer biyolojik sistemlerin kaçakçılığını incelemek için genişletilebilir.
Başlamak için, PBS'deki Drosophila yumurtalıklarını diseksiyon kapsamı altında diseke ettikten sonra, bir mililitre fiksasyon çözeltisi ekleyin ve yumurtalıkları 15 dakika boyunca bir somun platformunda sabitleyin. Fiksasyon çözeltisini çıkarın ve her biri bir mililitre PBST içeren iki hızlı yıkama gerçekleştirin. Mikrosantrifüj tüplerini beş ila altı kez hafifçe ters çevirerek, daha sonra bir somun platformu rocker üzerinde bir mililitre PBST ile her biri 10 dakikalık dört uzun yıkama gerçekleştirin.
Fiksasyon ve yıkama yaptıktan sonra, PBST'yi çıkarın, ardından bir mililitre engelleme çözeltisi ekleyin ve yumurtalıkları en az bir saat boyunca bir somun platformu rocker üzerinde bloke edin. Daha sonra, bloke edici çözeltiyi çıkarın ve bloke edici çözeltide uygun konsantrasyonlarında seyreltilmiş birincil antikorlar içeren 300 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin. 4 santigrat derecede bir nutating platform rocker üzerinde gece boyunca inkübe edin.
Birincil antikor çözeltisini çıkardıktan sonra, daha önce gösterildiği gibi iki hızlı yıkama ve dört uzun yıkama gerçekleştirin, ardından PBST'yi çıkarın ve kullanılan birincil antikorları tespit edecek floresan sekonder antikorlar içeren 500 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Yumurtalıkları ikincil antikor çözeltisindeki yumurtalıkları oda sıcaklığında iki saat boyunca bir nutating platform rocker üzerinde inkübe edin, daha sonra bir nutating platform rocker'da daha önce gösterildiği gibi PBST'de iki hızlı yıkama ve dört uzun yıkama gerçekleştirin. Son yıkamadan sonra, yumurta odalarını ayırmak için yumurtalıkları tüp içinde yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetlemek için bir P-1000 pipet kullanın.
Tüpü beş ila 10 dakika boyunca dik konumda tutarak yumurta odalarının dibe batmasına izin verin. Ardından, PBST'yi bir Pasteur pipet kullanarak çıkarın ve yaklaşık 50 mikrolitre bırakın. Daha sonra, bir P-200 pipet kullanarak kalan PBST'nin mümkün olduğunca çoğunu çıkarın ve bir kapak kayması üzerine eşit şekilde yayılacak kadar iki damla montaj ortamı ekleyin.
Viskoz montaj ortamının mikrosantrifüj tüpünden kızağa kolayca aktarılmasını sağlamak için, P-200 pipet ucunun ucunu kesin. Daha sonra, montaj ortamındaki tüm yumurta odalarını yavaşça cam slayta aktarın ve kabarcıklar oluşturmadığınızdan emin olun. Diseksiyon mikroskobu altında, montaj ortamını yavaşça dağıtın ve yumurta odalarını, yaklaşık bir kapak kayması büyüklüğünde bir alanı kaplamak için yeni bir P-200 pipet ucu veya forseps kullanarak ayırın.
Forseps kullanarak, kabarcıkları önlemek için kapak kaymasını yumurta odalarına dikkatlice bir açıyla yerleştirin ve slaytı polimerize etmek için iki gün boyunca karanlıkta düz bir yüzeyde oda sıcaklığında saklayın. Montaj ortamı sertleştikten sonra, slayt görüntüleme için birkaç hafta boyunca karanlıkta 4 santigrat derecede saklanabilir. Bodrum zarı proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunu görselleştirmek için, hedefi 63x'e ayarlayın ve yavaşça lensine bir damla daldırma yağı yerleştirin, ardından kapağı numuneyi bulma hedefine bakacak şekilde slaytı objektif üzerine yerleştirin.
Epifloresan mikroskobun göz merceğini kullanarak ilgilendiğiniz bölgeyi bulun, ardından floroforların makalede açıklandığı gibi görüntülenmesi için uygun ayarlara sahip bir konfigürasyon seçin. Yapılandırma ayarlandıktan sonra, Edinme Modu altında Canlı seçeneğini belirleyerek numunenin görüntüsünü alın ve numunenin tarama alanını optimize etmek için yakınlaştırmayı 2 ile 4x arasında ayarlayın. Her bir kanal için, Kanal altında bir parça seçin ve Canlı'yı tıklayın.
Aralık göstergesi aracını kullanırken ana kazancı ve lazer gücünü ayarlayın ve makalede açıklandığı gibi doymuş pikselleri önlemek için tüm yönergeleri izleyin ve her kanal için aynısını tekrarlayın. Edinme Modu geçiş penceresinde, Görüntü Boyutu altında, dedektörün yeteneklerini en üst düzeye çıkarmak ve çerçeve boyutunu otomatik olarak ayarlamak için SR'ye tıklayın. Airyscan modunda ortalamayı Yok olarak tutun, çünkü genellikle gerekli değildir ve tarama süresini kısaltır.
Bununla birlikte, bazı durumlarda, ortalama 2x'lik bir değer, sinyal-gürültü oranını artırabilir, ardından bir görüntü elde etmek için Snap'e tıklayın. Bir Z-yığını edinmek için, Edinme sekmesinin altındaki Z-Yığını onay kutusuna tıklayın. Ardından, numuneyi gözlemlemek için istediğiniz kanalı seçin.
Örneğin, DAPI kanalı ve canlı bir tarama başlatmak için Canlı'ya tıklayın, ardından mikroskoptaki ince ayar düğmesini kullanarak Z-yığını için bir aralık ayarlayın. Daha sonra, İlk Ayarla ve Son Ayarla'yı tıklatarak Z-yığınının uç noktalarını ayarlayın. En uygun 3B yeniden yapılandırma için, adım boyutunu atamak üzere Z yığınının aralığını 0,5 mikrometreden daha düşük bir değere ayarlayın ve Z-yığını alımına başlamak için Denemeyi Başlat'a tıklayın.
Görüntüler veya Z-yığını elde edildikten sonra, İşleme, ardından Yöntem seçeneğine tıklayın ve Airyscan İşleme'yi seçin. Başlamak için Otomatik Filtre uygulayın ve gerekirse, numune için en iyi sonuçları elde etmek üzere süper çözünürlük değerini değiştirerek daha fazla manuel işleme gerçekleştirin. En uygun SR değeri belirlendikten sonra, işlenmiş bir görüntü oluşturmak için Uygula'ya tıklayın.
Z-yığını görüntüleri söz konusu olduğunda, 3B İşleme kutusuna tıklayarak bir Z-dilimi veya tüm Z-yığını olarak işleyin. Bir Z-yığınının alınmasından sonra 3B'de protein kaçakçılığını görselleştirmek için, önizleme penceresindeki 3B simgesine tıklayarak Airyscan işlenmiş görüntünün ekran kontrolü bölümünde görünecek bir 3B görüntü oluşturun. Farklı 3B görünüm seçeneklerinden, veziküllerin yapısını görüntülerken Yüzey veya Karışık görünümleri kullanın.
En yüksek kaliteli görüntü için, En Hızlı ayarı daha az doğru olacağından ve zayıf 3B işlemeye yol açacağından Hassas ayarını seçin. Görüntü oluşturulduktan sonra, tercih edilen bir konuma odaklanmak için yakınlaştırıp döndürerek 3B görüntüyü değiştirin. Görünüm elde edildikten sonra, 3B sekmesi altında, Görüntülenen Çözünürlük'ü seçin ve ardından görüntünün görüntülendiği yönde bir anlık görüntüsünü oluşturacak ve çeşitli dosya biçimlerinde kaydedilip dışa aktarılabilecek Görüntü Oluştur'a tıklayın.
Konfokal mikroskopi, edinme parametreleri optimize edildiğinde Viking-GFP gibi bazal membran proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunu ve birikimini görselleştirmek için kullanılabilir. Yakalama ve görüntü işleme düzgün bir şekilde gerçekleştirildiğinde, süper çözünürlüklü mikroskopi, konfokal mikroskopiye kıyasla görüntü çözünürlüğünü arttırır. Viking gibi bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığında daha iyi tanımlanmış görüntülerle gösterildiği gibi.
Ortogonal projeksiyon, bazal membran proteinleri içeren veziküllerin ve bölmelerin genel dağılımının konfokal veya süper çözünürlüklü görüntüleme kullanılarak tek bir görüntüde görselleştirilmesini sağlar. Hücre içi bazal membran proteinlerinin lokalizasyonunu ve dağılımını değerlendirmek için konfokal veya süper çözünürlüklü görüntüleme ile alınan bir optik Z-kesitleri yığınını bir araya getirerek bir 3D rekonstrüksiyon kullanılmıştır. Süper çözünürlüklü görüntüleme, mutant koşullarda bazal membran proteinlerinin hassas lokalizasyonunu belirlemek için kullanılabilir.
Örneğin, Crag knockdown epitel hücrelerinde, bazal membran proteinleri hem apikal hem de bazal olarak birikir, bu da bazal membran proteinlerinin polarize sekresyonunu kontrol ettiğini gösterir. Konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi, ko-lokalizasyon deneylerinde de kullanılabilir. Örneğin, bu şekil Viking-GFP'nin kısmi birlikte lokalizasyonunu ve bir Golgi işaretleyicisi GM-130'u göstermekte ve Viking'in salgılanmadan önce Golgi'ye sıralandığını doğrulamaktadır.
Süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak bazal membran proteinlerinin kaçakçılığını verimli bir şekilde görüntülemek için, yumurtalıkları dikkatlice monte etmenizi ve edinim ve evrişim parametrelerini ayarlarken özellikle dikkat etmenizi öneririz. Bu protokol, bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, ilgilenilen diğer proteinlerin kaçakçılığını verimli bir şekilde görüntülemek için kolayca değiştirilebilir.
