Çok hücreli organizmalar içinde, doku uzamsal yönelimlerinde yüksek dereceleri daha fazla gösterir. Hücreler, morfogenez boyunca büyük mesafelerde bir dizi öncelik gösterir ve hizalar. Epitelin düzlemsel düzenlemelerinin gelişim sırasında nasıl ulaştığını anlamak için, hücrenin oryantasyonlarını ve büyüme dinamiklerini yüksek aralıklı zamansal doğrulukla izlemek çok önemlidir.
Açıklanan protokol drosophila pupal epidermis küresel ve yerel düzeyde hücre davranışlarını görüntülemek ve analiz etmek için tasarlanmıştır. Bu metodoloji farklı araştırma kuramı, hücre biyolojisi, morfogenez ve düzlemsel polarite hakkında bilgi verebilir ve diğer dokuların, yapıların ve modellerin analizine uygulanabilir. Tüm adımlar bazı uygulamadan sonra kolayca gerçekleştirilebilir.
Kesinlik istiyorlar. Bu protokolün görselleştirilmesi, en iyi sonuçların daha kısa sürede elde edilebilmesine yardımcı olur. Pupal diseksiyonu karmaşıktır.
Başlamak için, taze bir plastik şişe için sahnelenen beyaz pre-pupa aktarmak için nemli bir boya fırçası kullanın ve 25 santigrat derece gerekli olduğu sürece onları tutmak. Sonra, forceps yardımıyla şişe duvarından her pupa çıkarın. Çift taraflı yapışkan bant ile kaplı bir cam slayt üzerinde her pupa ventral tarafı tutkal.
Pupal kasanın banda yapışmasını sağlamak için pupanın uçlarıyla baş spiracles'e ve pupanın sırt yüzeyine hafifçe dokunun. Operkülonu puparium'dan forceps ile hafifçe çıkararak stereo mikroskop altında diseksiyonun diseksiyona başlayın. Operküler açıklık yoluyla pupal durumda ve pupa yüzeyi arasında sığ bir forceps bir ucu yerleştirin.
Bir veya daha fazla salıncakta kılıfı baş lardan kuyrağa yırtarak pupayı çimdiklemekten kaçının. Arka uça doğru devam ederken kırık pupal kılıfı lateral kenarlara katlayın. Pupayı, hayvanın altına dikkatlice sokarak ve yavaşça yukarı çekerek açılan pupal kasadan çıkarın.
Pupa, ponpların ucuna yapışır. Pupayı ventral tarafta hafifçe tutun ve pupayı gaz geçirilebilir halokarbon yağının küçük bir damlasının üzerine cam dipli bir tabağa aktarın. Yemeğin kenarlarında ıslak mendil kağıt bir parça rulo ve nem korumak için çanak kapağı.
Dibine bünyedeki tabakların üzerindeki yağ damlası üzerine pupa nın üzerine yönlendirin etki alanına ve sürece göre değerlendirilecektir. Dorsal yuvaların erken genişlemesinin uzun süreli canlı görüntülemeiçin, dorsal yanal pupa yönlendirmek. Geç genişleme ve doku remodeling görüntü için, dorsally pupa yönlendirmek.
Monte edilmiş pupa içeren cam dipli kabı mikroskop aşamasına aktarın ve aktarılan ışığı kullanarak karın bölgesinin yüzeyine odaklanın. Karın epitelinde genetik mozaikleri indüklemek için mitotik rekombinasyon kullanmak için, ısı şoku indüklenebilir flipaz, belirli bir genomik konumda bir FRT bölgesi ve FRT bölgesine tanınabilir hücresel marker distal taşıyan bakire dişileri hazırlayın. Eşdeğer genomik konumda FRT alanı taşıyan mutant erkekleri hazırlayın.
Dört ila beş gün boyunca 25 santigrat derece bir plastik şişe üç-bir oranda birkaç kadın ve erkek çapraz. Histoblastlarda somatik klonlar oluşturmak için, 37 santigrat derecede hayvanları içeren plastik şişeleri bir saate 45 dakika ila 45 dakika sallayarak haçın soyundan gelen üçüncü yıldız larva evresinde ısı şoku tedavisi yapın. Görüntü J yazılımında, 2B konfokal mikroskopi ile elde edilen Z yığın dilimlerini korumak için maksimum yoğunluklu projeksiyon işlevini kullanın.
Yuvalar, onları düzlemsel koordinat sistemi ön solunda ve sırtüstü doğru yönlendiren karakteristik bir şekle sahiptir. Bu analizle en iyi sonuçları elde etmek için giriş görüntüsünün yüksek çözünürlükte elde edilmesi gerekir. Yerel hücre kenarlarında nitel yönlendirme değerleri elde etmek için eklenti menüsüne tıklayın ve yön J dağıtım seçeneğini seçin.
Gausspencere sigmasını bir piksele, kübik spline degradeye, minimum tutarlılığı yüzde 20'ye ve minimum enerjiyi yüzde bire ayarlayın. Eklentinin renk etüdü seçeneğini kullanır. Tonunu yönlendirmeye, doygunluğu tutarlılığa ve giriş görüntüsüne parlaklık olarak ayarlayın.
Bu renk, hücre kenarı yönünü ayarlanan düzlemsel koordinat sistemine göre kodlar. Ardından, eklenti menüsüaltında, hücresel yönlendirmeleri ve yön hücresini hücre hizasına göre ölçmek için yön J ölçüsü seçeneğini kullanın. Histoblastların işgal ettiği alan içinde 20 mikrometre çarpı 20 mikrometre civarında tek tip ağırlığın ilgi küçük, bitişik örtüşen olmayan bölgeleri oluşturun.
Presleme ölçüsü, ROI'ların baskın yerel yönünü ve tutarlılığını hesaplar. Bu çalışmada, kullanılan metodoloji önemli fotoğraf ağartma veya fotoğraf toksisitesi olmadan 48 saate kadar süreler için gelişmekte olan pupa yüksek çözünürlüklü filmler üretmek mümkün. Burada, rfp NLS'nin yokluğunda işaretlenen yabani tip klonlar ve ikiz noktalarının puparium oluşumundan 26 saat sonra gösterilmektedir.
Klonlar segmental sınırlar boyunca uzamış. İkiz klonlar paralel veya birlikte düzenlenmiştir. Puparium oluşumundan 26 saat 47 saat sonra vahşi tip bir klonun morfolojisi her iki aşamada da karmaşık sınır morfolojisi gösterir.
Puparium oluşumundan 26 saat 47 saat sonra geometrik parametreler için kutu ve bıyık çizimleri ortalama alan ve çevre nin bu zaman penceresinde önemli ölçüde arttığını göstermektedir. Klonun oryantasyonu genişleme ve yeniden şekillendirme sırasında sürdürüldü. Puparium oluşumundan 26 saat 47 saat sonra şekil parametreleri, yabani tip klonlarda pürüzlülük, yuvarlaklık ve daireselliğin zar zor değiştiğini gösterir.
Pupa zarar değil emin olun, aksi takdirde birkaç saat içinde ölecek, canlı görüntüleme etkileyen. Bu protokol, sartus reaktifinin veya enstrümanın çalıştırılmasını gerektirmez. Parçalara ayırırken kendinizi çimdiklemekten kaçının.
Bu metodolojileri uygulayarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü filmler üretmek için farklı hayal teknikleri kullanarak mümkün. Fotonların veya dönen disklerin odaknoktası. Rastgele hücreler çapraz görüşmeler veya hücre iletişim mekanizmalarının belirlenmesinde kolaylık sağladığından, otonom olmayan yanıtları araştırmak için klorsal analiz kullanılabilir.
Bu yöntemler kolayca morfogenetik olayların tam bir dizi çalışma için adapte edilebilir, metamorfoz sırasında epidermal koordinasyonu da dahil olmak üzere, kas, ve nöro gelişim.
