Name: analysis of epididymal protein synthesis and secretion
Uploaded: 2018-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion at JoVE.com

Yazarlar bu eser destek için Ulusal Sağlık ve tıbbi araştırma Konseyi, Avustralya proje Grant APP1103176 kabul etmek istiyorum.

Hayvan doku koleksiyonu içeren tüm deneysel prosedürler Newcastle Üniversitesi'nın hayvan bakım ve Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
1. ayirt parafin gömülü epididimal bölümlerini (Şekil 1 ve 2) boyama
<ol><li>Hemen sonra ötenazi CO2 inhalasyon (İsviçre fareler, 8 hafta boyunca) ile yetişkin farelerin, dikkatle (cerrahi makas ve cımbız kullanarak) epididim teşrih bağ dokusu ve yağ örten ücretsiz ve Bouin'ın sabitleştirici bırakın Çözüm (> 10 kat birim/doku ağırlık) gecede fiksasyon için.</li>
	<li>Doku % 70 etanol ile 2 × değişiklik ile her gün 2 gün boyunca yıkama ve infiltrasyon ve parafin blok içine gömmek için hazırlık kademeli etanol (% 70, % 95 ve % 100) kurutmak.</li>
	<li>Parafin blok kalınlığı 4-6 µm ve mount ayirt boyama için hazırlık slaytlarda, bölüm.</li>
	<li>Bir duman başlık, epididimal parafin kesitler ksilen yeterli miktarda tamamen doku bölümü (3 × 5 dk her zaman) sokmak için slayt kavanoz ekleyerek dewax.</li>
	<li>Saf H2O seyreltilmiş kademeli etanol çözümlerinde daldırma tarafından doku bölümleri rehydrate (% 100 etanol 5 dk, 5 dk, % 90 etanol 1 dk, % 80'i etanol 1 dk, % 70 Etanol Etanol % 100 1 dk ve % 50 Etanol 1dk).</li>
	<li>Bir kez yeterli fosfat tamponlu tuz tamamen tüm doku bölümü sokmak için (PBS) ile 5 min için bir slayt kavanoz bölümlerde yıkayın (tüm sonraki yıkama için bu yönergeleri izleyin).</li>
	<li>Uygun antijen alma çözüm dikkatle boşaltmak (i.e., 10 mmol/L sodyum sitrat, 50 mmol/L Tris pH 10,5 veya alternatif antijen alma isn'ta bağlı olarak algılanabilmesi için antijen) bir slayt raf ve kaynar kadar mikrodalga. Bu çözüm içine slaytlar bırakın ve doku bölümlerde ısı kaynaklı antijen alma koşulları bireysel antikorlar (bkz. Tablo 1) için en iyi duruma getirilmiş tabi. Dikkat: emin olun slaytları tam antijen alma işlemi sırasında antijen alma çözümde daldırılır.</li>
	<li>Slayt konteyner mikrodalga ve serin oda sıcaklığına çıkarın.</li>
	<li>PBS ile slaytlar durulama ve doku bölümü sıvı keşfedilmeden slayt marker kalem izlemek için kullanın.</li>
	<li>Slaytlar (kapsayıcı temelini ıslatılmış bir doku tarafından oluşturulan) bir oksijen kapsayıcı yerleştirin ve engelleme çözümü uygulamak (% 3 BSA/PBS, daha önce filtre 0,45 µm filtreden) 37 ° C'de 1 h için</li>
	<li>Bir kez PBS ile slaytlar durulayın.</li>
	<li>Filtre uygulanan % 1'deneysel olarak en iyi duruma getirilmiş bir konsantrasyon için seyreltilmiş uygun birincil antikor ile bölümleri kuluçkaya BSA/PBS gecede 4 ° C'de (anti-DNM1, DNM2 ve DNM3 için 1:60 antikorlar; 1: 100 için anti-ATP6V1B1 antikor, malzemeler tablo bkz: antikor Ayrıntılar için). Not: ayırt etmek için non-spesifik antikor bağlama, belirli bu sıkı negatif eklemek gereklidir (i.e., ikincil antikor tek, birincil antikor peptid immunizing karşı preabsorbed) ve pozitif denetimleri24.</li>
	<li>Slaytları, oda sıcaklığında 30 dakika yerleştirerek ısıt.</li>
	<li>PBS ile slaytlar 3 × bir platformda sallayarak (60 rpm) 10 dakika yıkayın.</li>
	<li>%1 içinde seyreltilmiş uygun ikincil antikor ile bölümleri kuluçkaya BSA/PBS için 1 h 37 ° C'de (0,45 µm filtreden filtre) (1: 400 seyreltme için tüm ikincil antikorlar, görmek Tablo reçetesi antikor Ayrıntılar için). Dikkat: slayt konteyner bu adımından itibaren karanlıkta bırakın. Çift etiketleme için ikincil antikorlar uyumlu birleşimini seçin (i.e., ikincil antikorlar gerekir yükseltilmiş oldu farklı türler).</li>
	<li>PBS ile slaytlar 3 × bir platformda sallayarak (60 rpm) 10 dakika yıkayın.</li>
	<li>Propidium iyodür (PI, 7.48 μmol/L) ya da 4΄, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 4.37 μmol/L) hücre çekirdeği etiketlemek için oda sıcaklığında 2 min için bölümlerle counterstain.</li>
	<li>PBS ile iki kez slaytlar bir platformda sallayarak (60 rpm) 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Mowiol 4-88 hazırlanan % 30 gliserol 0.2 mol/L Tris (pH 8,5) içinde bir çözümde % 10 bölümlerle mount ve %2.5 1, 4 - diazabicyclo-(2.2.2)-oktan.</li>
	<li>Tırnak vernik ile coverslip mühür ve gelecekteki gözlem için 4 ° C'de slaytları depolama. Dikkat: Bu görüntüleme slaytların sürede pratik olarak sonra aşırı floresan kaybı olmaması için hazırlık yapmak önerilir.</li>
</ol>Epididymosomes fare kaput epididimlerden (Şekil 3) üzerinden 2 yalıtım
<ol><li>Hemen yolu ile CO2 inhalasyon (İsviçre fareler 8 hafta boyunca) yetişkin fareler ötenazi sonra onların damarlara (37 ° C-kan kirlenme epididimal dokusunun en aza indirmek için önceden ısındı) PBS ile sıvı. Dikkat: kan plazması farklı nüfus epididymosomes25benzer büyüklükte olan exosomes içerir. Kan izni epididimal dokusundan etkinliğini erişilebilir ilk kesimi muayene ile son derece bozukluklarına epididimal segment bulunan proksimal kaput bölümüne (i.e., 1 Şekil1a bölge)</li>
	<li>Dikkatle yüzey için herhangi bir potansiyel azaltmak için epididimlerden örten yağ ve bağ dokusu ve durulama ücretsiz değiştirilmiş Biggers, Whitten ve Whittingham ile orta (BWW; pH 7.4, osmolalite 300 mmol/kg su26,27) incelemek kan kirlenme.</li>
	<li>Aşırı medyayı çıkarın, kaput epididim incelemek için epididimal doku leke (i.e., 2-5 içinde Şekil 1Abölgeleri) ve BWW orta içeren transfer taze Petri kabına (35 × 10 mm). Orta miktarda final kurtarma için yeterli olduğundan emin olun. Not: 6 kaput epididymides için eşit olarak bölünmüş ve sonra üstüne (bkz. Adım 2,9) 2 önceden hazırlanmış degradeler uygulanan ~ 900 µL bir iyileşme için izin vermek için orta 1.1 mL kullanmak için önerilir.</li>
	<li>Bir tıraş bıçağı ile kaput doku içine küçük kesiler bir dizi yapmak. Doku kıyma değil ve böylece aşırı sitozolik içeriği ile örnek kirletici önlemek. Hafif ajitasyon luminal içeriği serbest bırakmak 30 dk 37 ° C'de dokuyla içeren plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Sonuç süspansiyon hücresel enkaz kaldırmak için 70 µm membran aracılığıyla filtre.</li>
	<li>Filtrate toplamak ve bu Art arda aralıklarla adımları 4 ° C'de hücresel enkaz ortadan kaldırmak için hızı artan tabi (i.e., 500 × g, 2.000 × g, 4.000 × g, 8.000 × g, 5 min her; 17.000 × g 20 dk ve nihayet 17.000 × g ek bir 10 dk ya kadar hiçbir Pelet Santrifüjü sonra oluşturulur). Dikkat: Pelet rengini çok az kan kontaminasyon mevcut olduğundan emin olmak için ilk 500 × g Santrifüjü adımdan sonra değerlendirmek önemlidir. Herhangi bir örnek bu pelet pembe rengi görüntülediği atmak.</li>
	<li>Kesintili iodixanol gradyanlar (%40, % 20, % 10, % 5 katmanları oluşan) (%60 (w/v) sulu iodixanol oluşan) bir yoğunluk gradient orta sulandrarak 0,25 mol/L sukroz ve 10 mmol/L Tris (pH 7.5) bir çözüm ile hazırlayın.</li>
	<li>Bir ultracentrifuge tüp (11 × 35 mm), degradede 450 µL (Şekil 3) her kısmını hazırlamak. Degrade sonra her kesir uygulanması arabirimler epididimal sıvı örnek yükleme öncesinde her katmanı arasında başarıyla oluşturulur emin olmak için kontrol edin. Her degrade taze kullanım, günde ancak hazırlamak, epididimal luminal sıvı örnek 4 ° c için en fazla 2 saat yükleme öncesi korunmuş.</li>
	<li>Dikkatle (malzeme toplanan 3 epididymides caput karşılık) epididimal luminal sıvı süspansiyon, tek bir geçişin 450 µL ekleyin.</li>
	<li>Ultracentrifuge 160.000 × g 18 h için 4 ° C'de, degradeleri. Dikkat: Bu Santrifüjü çok yüksek hızda yapılır beri bütün ultracentrifuge tüpler eşleştirilmiş ve olmalı tam olarak dengeli. Tüpler kendi bütünlüğünü tehlikeye atabilecek görünür herhangi bir hasar ücretsiz olduklarından emin olmak için denetleyin.</li>
	<li>Yavaşça çıkarın 12 eşit kesirler (her 185 µL oluşan) en üst katmandan başlayarak ve degrade altına doğru ilerliyor. Her degrade varsa kurtarılan eşdeğer kesirler (en çok iki degradeler) havuz. Not: epididymosomes en çok kesirler 9-1122zenginleştirilmiş fare Şekil 4 ve tartışma bakın.</li>
	<li>Kurtarma ve kesirler 9-11, havuzu sonra 2 mL PBS ve ultracentrifuge örnekleri epididymosomes cips için 100.000 × g için 3 saat 4 ° C'de (13 × 56 mm tüp) adlı oranında seyreltin. Dikkat: epididymosome Pelet görmek zor olabilir bu yana, onlar rotor yerleştirilir ve epididymosome Pelet bekleyen konumunu belirtmek için tüp işaretlemek gibi tüpler yönünü kaydetti olun. Her tüpün yeterli hacim içerdiğinden emin olun (i.e., % 50'sini toplam kapasitesini aşan) tüp çökmesi riskini önlemek için.</li>
	<li>Dikkatle Aspire edin ve süpernatant epididymosome Pelet bozmadan.</li>
	<li>Epididymosome saflık (Şekil 4) değerlendirmek.</li>
	<li>Epididymosome Pelet aşağı akım uygulamaları göre istenen orta içine resuspend. Örneğin, BWW orta genellikle sperm hücreleri veya alternatif olarak uygun lizis arabellek epididimal Proteom SDS-sayfa yolu ile çözümlenmesi için hazırlık ile ortak kuluçka içeren deneyler için kullanılır.</li>
</ol>3. ayirt Staining mECap18 hücre
<ol><li>Steril coverslips hazırlanması (bir hücre kültür mahallede yapılacak)<ol>
<li>Coverslips (12 × 12 mm) % 70 etanol için 10 dk içinde ıslatın ve etanol lamba yukarıda yüksek sıcaklık altında kurutma tarafından dezenfekte.</li>
		<li>Coverslip 10 için serin s 12 iyi plakasına aktarmadan önce.</li>
		<li>Steril poli-L-lizin çözüm coverslip kapak ve oda sıcaklığında 10 dakika için yerleşmek için geçerlidir.</li>
		<li>Poli-L-lizin çözüm atmak ve coverslip steril H2O ile durulayın ya da uygun orta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hazırlık mECap18 hücreleri<ol>
<li>2 × 105 mECap18 hücrelerde her şey coverslips içeren 12 iyi plaka aliquots geçiş.</li>
		<li>MECap18 hücre Orta (%1 L-glutamine, % 1 Sodyum pyruvate, % 1 penisilin/streptomisin ve 50 μmol/L 5α-androstan-17β-ol-3-oneC-IIIN takıma DMEM) içeren % 10 fetal buzağı serum (FBS) atmosfer % 5 altında 37 ° C kuluçka hücrelerle kültür CO2 gece.</li>
		<li>Sonra hücreleri coverslip için uygun, orta atın ve hücreleri iki kez PBS ile durulayın.</li>
		<li>Tüm coverslip bırakın ve 15 dakika oda sıcaklığında hücreleri saptamak için PBS içinde seyreltilmiş yeterli miktarda % 4 paraformaldehyde (PFA) ekleyin.</li>
		<li>İngiltere'de yılın çözüm atmak ve coverslips iki kez PBS durulayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ayirt boyama<ol>
<li>MECap18 hücreleri % 0,1 daldırma tarafından permeabilize Triton X-100 PBS için 10 dk içinde.</li>
		<li>Coverslips PBS ile yıkayın.</li>
		<li>MECap18 hücreleri % 3 BSA ile engellemek ve immunolabeling epididimal doku bölümleri için açıklananlara eşdeğer protokolleri kullanan hücre ile devam edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. yalıtım şartına hücre kültür ortamdan proteinlerin
<ol><li>Klimalı hücre kültür orta topluluğu<ol>
<li>Geçit aliquots hücrelerinin 4 × 105 mECap18 6 her şey de plaka ile mECap18 hücre orta % 10 ile desteklenmiş FBS 24 h için.</li>
		<li>MECap18 hücreleri üç kez mECap18 hücre Orta (FBS hazırlanmış) ile kalan FBS ve ilgili kaldırmak için yıkama protein kirletici.</li>
		<li>Her şey için mECap18 hücre Orta (FBS hazırlanmış) 1,5 mL ekleyin ve 37 ° C kuluçka altında %5 12 h için mECap18 hücreler kuluçkaya CO2. Not: Bu adımda mECap18 hücreleri için farklı bir hedef antijenleri deneysel tasarım göre tespit edilebilir.</li>
		<li>12 h kuluçka sonra hücre orta ve santrifüj 2.000 × g tüm hücresel enkaz kaldırmak 10 dk de toplamak. Not: Kuluçka süresi uygun olarak deneysel tasarım/bitiş noktası değerlendirme ve hücrenin tolerans uygulanan treatment(s) için söz konusu değiştirilmesi yapabiliyor. Bu en iyi sonuçları elde emin olmak için belirli deneysel rejimleri göre kuluçka zamanlaması terzi için tavsiye edilir.</li>
		<li>MECap18 hücre canlılığı bir standart trypan mavi dışlama tahlil28uygulanması yoluyla değerlendirmek. Tüm malzemesini içinde % 90 ölü ya da can çekişen hücrelerden serbest proteinler tarafından tanıtıldı önyargı ortadan kaldırmak için aşağıda hücre canlılığı reddetti.</li>
		<li>Aşağıdaki gibi proteinler hücre ortamdan izole veya orta-80 ° C'de korumak</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protein yalıtım (duman mahallede yapılacak)<ol>
<li>Soğutulmuş % 100 trichloroacetic asit hacmi % 20 kültürlü mECap18 hücrelerden serbest protein çökelti şartına cep orta hacmi % 80'i ekleyin. 4 ° C'de gecede sürekli karıştırma ile kuluçkaya.</li>
		<li>Kuluçka sonra zarlarını protein Santrifüjü tarafından cips (17, 000 × g, 10 min için 4 ° C). Not: Orta salgılanan bekleniyor protein sınırlı miktarı nedeniyle, Pelet kolayca Santrifüjü sonra görüntülenmeyecektir değil ki mümkündür. Bu nedenle doğru biçimde Santrifüjü önce tüp yönlendirmek ve bekleyen Pelet konumu süpernatant kaldırılması sırasında bozmamaya özen için şarttır.</li>
		<li>Süpernatant atmak ve Pelet iki kez yeniden Santrifüjü önce soğutulmuş aseton ile yıkayın (17, 000 × g, 10 min için 4 ° C).</li>
		<li>Dikkatle kaldırmak ve süpernatant bir duman başlık içinde herhangi bir kalıntı aseton air-drying önce.</li>
		<li>Bir uygun ayıklama arabellek tam salgı protein profilleri ve/veya bireysel hedef proteinler algılamak bitiş noktası analizi için hazırlık içinde protein Pelet resuspend (Örn., SDS-sayfa, immunoblotting).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu çalışmalar parafin gömme ve standart parça protokolleri için tabi Bouin'ın sabit epididimal doku kullanımı dahil. Bouin'ın sabitleştirici çözüm özel ve tamamlayıcı bir işleve sahip her bileşeni ile formaldehit, pikrik asit ve asetik asit, karışımından oluşmaktadır. Böylece, formaldehit protein çapraz bağlantıları oluşturmak için Birincil aminler ile reaksiyona girer, pikrik asit tuzları oluşturan doku yavaş yavaş nüfuz eder ve dolayısıyla koagulasyon temel proteinler ve tersine, ...

Sperm hücreleri tüm memeli türlerinin ileri aşamalı hareketliliği görüntülemek için ve bir yumurta sırasında uzun süreli düşüşünü epididim, çok özel bir bölge olabilir erkek ekstra testis kanal sistemi ile döllemek için potansiyel elde 7-14 gün (tür bağlı olarak) gezinmek için1. Baba tarafından kromatin aşırı yoğunlaşma ve testis içinde sperm cytodifferentiation eşlik eden sitoplazma çoğunluğu dökülme nedeniyle, onların sonraki fonksiyonel olgunlaşma sadece onların etkileşim tarafından tahrik edilmektedir epididimden microenvironment ile. Bu ortamın sırayla, astar epididimal soma salgı ve dinsel etkinliği tarafından oluşturulur ve olağanüstü bir parça-parça değişimi1düzeyini görüntüler. Böylece, protein sentezi ve salgı açısından en aktif kesimleri epididimlerden (yani, kaput ve corpus)2proksimal kısmında bulunan bunlar. Bu etkinlik sperm, fonksiyonel yetkinlik işaretlerinden görüntülemek için hücreleri ilk başlangıcı ile fonksiyonel profil aynalar (i.e., asit çözündürüldükten zona glikoproteinlerin için bağlama yeteneği ve ilerici hareket) aşağıdaki onların geçit ile kaput epididim3. Bu işlev öznitelikler sperm boşalma için hazırlık içinde sakin bir durumda neyin saklandıkları distal epididimal kesimi (Kauda), ulaştığı en yüksek düzeyleri ulaşmadan önce geliştirmeye devam. Oluşumu ve bu sperm depolama haznesi bakımından da yakından hangi Kauda güçlü dinsel etkinlik4,5tarafından hakimdir astar epitel bağlıdır. Bildirilen6,7,8anatomik farklılıklar olmasına rağmen işbölümü bölgeselleştirilmiş bu tür memeli türlerin çoğunluğu arasında paylaşılan epididim karakteristik gibi görünüyor kendi9,10da dahil olmak üzere bugüne kadar okudu. Nitekim, klinik bir bakış açısından, bu o epididimal disfonksiyon erkek faktör infertilite11böylece bu özel doku Yönetmeliği anlama önemini vurgulayarak, etiyolojisi için önemli bir katkı yapar bilinmektedir.
Bu nedenle anlayışımız epididimal Fizyoloji ve sperm olgunlaşma ve depolama bu doku içinde sıralı aşamalarını düzenleyen mekanizmalar tam olarak çözümlenmesi için kalmasını üzüntü vericidir. Katkıda bulunan faktörler arasında sınırlayıcı epididimal araştırma gelişmeler bu doku genel karmaşıklığı ve bilgi luminal onun microenvironment üzerinde yasal denetim mekanizmaları vardır. Anatomik olarak, biz ötesinde kaput, corpus ve kauda kesimleri ayrım, epididim daha da çeşitli bölgelere (Şekil 1A) ayrılmıştır, her septa12 tarafından ayrılmış ve gen/protein ayrı profilleri tarafından karakterize olduğunu biliyorum ifade13,14,15,16,17,18. Nitekim, ayrıntılı transkripsiyon epididim segmental gen ifadesinde profilleme temelinde, en çok 6 ve 9 ayrı epididimal bölgeleri fare ve sıçan modellerinde, sırasıyla19,20bildirilmiştir. Bu karmaşıklık muhtemelen epididimal soma, çok sayıda farklı hücre türleri oluşan bir pseudostratified epitel bileşimi yansıtır; her yolu uzunluğu boyunca kendi bereket, dağıtım ve salgı/dinsel faaliyetleri ile ilgili olarak farklı. Böylece, asıl farkla en bol epididimal hücre türü tüm epitel hücrelerinin % 80 yukarı oluşturan hücrelerdir. Buna göre asıl epididimal protein biyosentezi ve salgı5hacim için sorumlu hücrelerdir. Buna ek olarak, epididimal soma içinde ikinci en bol bulunan hücre türü olarak rütbe, Açik Hücre nüfus öncelikle luminal bileşenlerinin seçici emme ve bu microenvironment5asitleştirme katılmaktadırlar. Karmaşıklık başka bir katmanı ekleme, androjenler ve diğer lumicrine faktörler testis kökenli onların yolu konumlandırma bağlı olarak bu epididimal hücre türlerinin her biri üzerinde değişiklik kontrol uygulamayın.
Böyle karmaşıklığı tarafından uygulanan sınırlamaları rağmen epididimal fonksiyonu mekanik temeli çözme içine yapılması önemli yayılmakta devam. Bu çalışmalar için bir anahtar ilk anketler arasından seçilen bireysel proteinlerin ayrıntılı analizler ile tandem epididimal Proteom geniş ölçekli stoklar kurmak için gelişmiş kütle spektrometresi stratejileri uygulanması olmuştur. Mechanoenzymes fare modeli21DNM ailesinin son bizim karakterizasyonu bu yaklaşım örnektir. DNM ilk bizim ilgi exo - ve endocytotic süreçlerin kaplin içinde çift kendi eylem tarafından yakıt. Bu gözlemler üzerinde bina, biz DNM (DNM1 - DNM3) üç kurallı izoformlarının çok fare epididim ifade ve protein salgılanması ve emme21 düzenleyici rolleri yerine getirmek için uygun şekilde konumlandırılmış . Ayrıca, biz böylece tamamlayıcı, epididimal epitel21içinde gereksiz, aktivite karşı sahip oldukları öne açıkça onların hücresel ve alt hücresel yerelleştirme temelinde her DNM izoformu ayırt etmek başardık.
Burada, bu bilgi daha geniş uygulama alternatif epididimal proteinler karakterizasyonu bulmak ve böylece katkıda umut ile fare epididim ifadede DNM çalışma için istihdam deneysel yöntemi açıklamak bizim Erkek üreme sistemi önemli bu öğenin işlevini anlama. Özellikle, biz hedef proteinlerin epididimal bölümlerde parafin gömülü ve bu proteinler ayirt üzerinden kayma dağılımını izleyen tespiti ayirt etiketleme için sağlam metodoloji geliştirilmesi tarif mikroskobu. Biz daha fazla yalıtım ve epididymosomes karakterizasyonu için bizim son zamanlarda en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları22 belge; epididimal salgı profili temel unsurları teşkil ve sperm olgunlaşma23teşvik önemli bir rol tutmak için görünen küçük eksozom benzeri veziküller. Tamamlayıcı bir yaklaşım biz de bir ölümsüzleştirdi fare kaput epididimal epitel (mECap18) hücre kültürünü hedef proteinlerin ayirt algılama ve bu kaynak kullanımı ile düzenleme, epididimal keşfetmek için bir model olarak tarif salgı faaliyet içinde vitro.

<table><tbody><tr><td>Dynamin 1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab108458</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Dynamin 2 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6400</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Dynamin 3 antibody</td><td>Proteintech</td><td>14737-1-AP</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>ATP6V1B1 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21206</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>CD9 antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553758</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: monoclonal</td></tr><tr><td>Flotillin-1 antibody</td><td>Sigma</td><td>F1180</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>ALOX15 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab80221</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>TUBB antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5274</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Mouse, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: monoclonal</td></tr><tr><td>PSMD7 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab11436</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Rabbit, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11008</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11055</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Donkey, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Goat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11058</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Donkey, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rat Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11007</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rabbit HRP</td><td>Millipore</td><td>DC03L</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Rat HRP</td><td>Millipore</td><td>DC01L</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>Anti Mouse HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>&lt;strong&gt;Host species&lt;/strong&gt;: Goat, &lt;strong&gt;Isotype&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;Class&lt;/strong&gt;: polyclonal</td></tr><tr><td>4&#039;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>propidium iodide (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Thermo</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td>Thermo</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;alpha;-androstan-17&amp;beta;-ol-3-oneC-IIIN</td><td>Sigma</td><td>A8380</td><td></td></tr><tr><td>sodium pyruvate</td><td>Thermo</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR Chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Sodium citrate</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Astral</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>1, 4-diazabicyclo-(2.2.2)-octane</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-gysine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>78787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Ajax Finechem</td><td>A6-2.5 L GL</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poly (vinyl alcohol)</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Ajax Finechem</td><td>783-500G</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscopy</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Optima Max-XP</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuges</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Heracell</td><td>150</td><td></td></tr><tr><td>Large Orbital Shaker</td><td>Ratek</td><td>OM7</td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>LG</td><td>MS3840SR /00</td><td></td></tr><tr><td>Lab pH Meter</td><td>MeterLab</td><td>PHM220</td><td></td></tr><tr><td>Liquid-repellent slide marker</td><td>Daido Sangyo</td><td>Mini</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Thermo</td><td>586</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>12 well plate</td><td>CELLSTAR</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Slide</td><td>Mikro-Glass</td><td>SF41296PLMK</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m filter</td><td>Millox-HV</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes Dustfree Paper</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube (2.2 ml, 11 &amp;times; 35 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>347356</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tube (3.2 ml, 13 &amp;times; 56 mm)</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer 70 &amp;micro;m Nylon</td><td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 35 &amp;times; 10 mm with cams</td><td>SARSTED</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>Slide jar</td><td>TRAJAN</td><td>#23 319 00</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of epididymal protein synthesis and secretion

Memeli epididim biri herhangi bir endokrin bezinin en karmaşık intraluminal sıvıların sonrası testis olgunlaşma ve sperm hücreleri depolanmasını desteklemek üzere oluşturur. Bu karmaşıklık kombine salgı ve dinsel etkinliği astar epitel hücreleri nedeniyle ortaya çıkar. Burada, biz dynamin (DNM) mechanoenzymes modeli protein ailesi de odaklanarak epididimal protein sentezi ve salgı analizi için teknikler tarif; Çift yönlü membran kaçakçılığı olayları düzenleyen potansiyeline sahip büyük GTPases. Protein ifade epididimal doku çalışma için biz hedef proteinlerin parafin gömülü bölümlerde ve bu proteinler kayma dağılımını izleyen tespiti ayirt etiketleme için sağlam metodoloji tarif ayirt mikroskobu. Ayrıca izolasyon ve veziküller, sperm hücrelerinin olgunlaşması ile hücreler arası iletişim katılmaya epididimal lümen içine salgılanan epididymosomes olarak bilinen gibi ya karakterizasyonu için en iyi duruma getirilmiş metodoloji açıklar. Tamamlayıcı bir yaklaşım, ayrıca bir fare SV40 ölümsüzleştirilmiş kaput epididimal epitel (mECap18) hücre kültürünü hedef proteinlerin ayirt algılama açıklar. Ayrıca, biz mECap18 hücre satırı yardımcı programı ile, düzenleme, epididimal salgı faaliyet keşfetmek için uygun vitro model olarak tartışıyorlar. Bu amaçla, biz mECap18 hücre kültürünü ve onların salgı protein profil etkileyen özelliği olan seçici farmakolojik inhibisyon rejimlerinin kullanımı için bakım gereksinimleri kodlamayla tanımlamak. Belgili tanımlık ikinci are kolayca şartına kültür orta, salgılanan proteinler trichloroacetic asit/aseton yağış ile konsantrasyon ve onların sonraki analiz SDS-sayfa ve immunoblotting üzerinden hasat ile değerlendirildi. Bu kombine Yöntemler sperm olgunlaşma ve/veya depolama fonksiyonel rollerinin belirlenmesi için bir başlangıç olarak alternatif epididimal protein hedeflerin analizleri için uygun olduğunu iddia.

Resim 1 ve Şekil 2 fare kaput epididim DNM ayirt yerelleştirme temsilcisi sonuçlarını göster. Her biri üç DNM izoformlarının görüntü farklı yerelleştirme profilleri araştırıldı. Böylece, DNM1 ilk segment ve kaput epididimlerden (Şekil 2A) boyunca epididimal hücrelerinin nispeten mütevazı diffüz etiketleme ile karakterizedir. Buna karşılık, DNM2 izoformu il...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion at JoVE.com

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Burada, proteinler parafin gömülü fare epididimal bölümlerde yer tespiti ve bu bir ölümsüzleştirdi epididimal hücre hattı (mECap18) iletişim kuralları göstermek için dynamin ayirt lokalizasyonu raporu. Ayrıca izolasyon epididimal sıvı ve şartına hücre medya salgı proteinlerin protokollerde açıklar.

Epididimal Protein sentezi ve salgı Analizi

The mammalian epididymis generates one of the most complex intraluminal fluids of any endocrine gland in order to support the post-testicular maturation ...

analysis-of-epididymal-protein-synthesis-and-secretion

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K Görüntüleme.  University of Newcastle. Burada, proteinler parafin gömülü fare epididimal bölümlerde yer tespiti ve bu bir ölümsüzleştirdi epididimal hücre hattı (mECap18) iletişim kuralları göstermek için dynamin ayirt lokalizasyonu raporu. Ayrıca izolasyon epididimal sıvı ve şartına hücre medya salgı proteinlerin protokollerde açıklar.

Video: Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and organogenesis, as well as in multiple diseases. Numerous publications have convincingly shown that specific mechanisms tightly regulate mRNA translation. Increased interest in the translation-induced regulation of protein expression has led to the development of novel methods to study and follow de novo protein synthesis in cellulo. However, most of these methods are complex, making them costly and often limiting the number of mRNA targets that can be studied. This manuscript proposes a method that requires only basic reagents and a confocal fluorescence imaging system to measure and visualize the changes in mRNA translation that occur in any cell line under various conditions. This method was recently used to show localized translation in the subcellular structures of adherent cells over a short period of time, thus offering the possibility of visualizing de novo translation for a short period during a variety of biological processes or of validating changes in translational activity in response to specific stimuli.

This manuscript describes a method to visualize and quantify localized translation events in subcellular compartments. The approach proposed in this manuscript requires a basic confocal imaging system and reagents and is rapid and cost-effective.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

Biyokimya

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For a long time, the gene expression studies were dominated by research on the transcriptional level. However, the steady-state levels of mRNAs do not correlate well with protein production, and the translatability of mRNAs varies greatly depending on the conditions. In some organisms, like the parasite Leishmania, the protein expression is regulated mostly at the translational level. Recent studies demonstrated that protein translation dysregulation is associated with cancer, metabolic, neurodegenerative and other human diseases. Polysome profiling is a powerful method to study protein translation regulation. It allows to measure the translational status of individual mRNAs or examine translation on a genome-wide scale. The basis of this technique is the separation of polysomes, ribosomes, their subunits and free mRNAs during centrifugation of a cytoplasmic lysate through a sucrose gradient. Here, we present a universal polysome profiling protocol used on three different models - parasite Leishmania major, cultured human cells and animal tissues. Leishmania cells freely grow in suspension and cultured human cells grow in adherent monolayer, while mouse testis represents an animal tissue sample. Thus, the technique is adapted to all of these sources. The protocol for the analysis of polysomal fractions includes detection of individual mRNA levels by RT-qPCR, proteins by Western blot and analysis of ribosomal RNAs by electrophoresis. The method can be further extended by examination of mRNAs association with the ribosome on a transcriptome level by deep RNA-seq and analysis of ribosome-associated proteins by mass spectroscopy of the fractions. The method can be easily adjusted to other biological models.

Polysome Profiling in Leishmania, Human Cells and Mouse Testis

The overall goal of polysome profiling technique is analysis of translational activity of individual mRNAs or transcriptome mRNAs during protein synthesis. The method is important for studies of protein synthesis regulation, translation activation and repression in health and multiple human diseases.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Proper protein expression at the right time and in the right amounts is the basis of normal cell function and survival in a fast-changing environment. For ...

RiboTag Immunoprecipitation in the Germ Cells of the Male Mouse

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, characterizing differences in the translatome (the whole of translated mRNAs) provides an additional layer of information particularly useful when trying to understand the function of RNA regulating or binding proteins. A number of methods for accomplishing this have been developed, including ribosome profiling and polysome analysis. However, both methods carry significant technical challenges and cannot be applied to specific cell populations within a tissue unless combined with additional sorting methods. In contrast, the RiboTag method is a genetic-based, efficient, and technically straightforward alternative that allows the identification of ribosome associated RNAs from specific cell populations without added sorting steps, provided an applicable cell-specific Cre driver is available. This method consists of breeding to generate the genetic models, sample collection, immunoprecipitation, and downstream RNA analyses. Here, we outline this process in adult male mouse germ cells mutant for an RNA binding protein required for male fertility. Special attention is paid to considerations for breeding with a focus on efficient colony management and the generation of correct genetic backgrounds and immunoprecipitation in order to reduce background and optimize output. Discussion of troubleshooting options, additional confirmatory experiments, and potential downstream applications is also included. The presented genetic tools and molecular protocols represent a powerful way to describe the ribosome-associated RNAs of specific cell populations in complex tissues or in systems with aberrant mRNA storage and translation with the goal of informing on the molecular drivers of mutant phenotypes.

Here, we describe the immunoprecipitation of ribosomes and associated RNA from select populations of adult male mouse germ cells using the RiboTag system. Strategic breeding and careful immunoprecipitation result in clean, reproducible results that inform on the germ cell translatome and provide insight into the mechanisms of mutant phenotypes.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Quantifying differences in mRNA abundance is a classic approach to understand the impact of a given gene mutation on cell physiology. However, ...

Gelişim Biyolojisi

Eukaryotic Polyribosome Profile Analysis

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase or the elongation phase by a variety of cellular stresses such as amino acid starvation or growth factor withdrawal. Alternatively, translation of individual mRNAs can be regulated by mRNA localization or the presence of cognate microRNAs. Studies of protein synthesis frequently utilize polyribosome analysis to shed light on the mechanisms of translation regulation or defects in protein synthesis. In this assay, mRNA/ribosome complexes are isolated from eukaryotic cells.  A sucrose density gradient separates mRNAs bound to multiple ribosomes known as polyribosomes from mRNAs bound to a single ribosome or monosome. Fractionation of the gradients allows isolation and quantification of the different ribosomal populations and their associated mRNAs or proteins. Differences in the ratio of polyribosomes to monosomes under defined conditions can be indicative of defects in either translation initiation or elongation/termination. Examination of the mRNAs present in the polyribosome fractions can reveal whether the cohort of individual mRNAs being translated changes with experimental conditions. In addition, ribosome assembly can be monitored by analysis of the small and large ribosomal subunit peaks which are also separated by the gradient. In this video, we present a method for the preparation of crude ribosomal extracts from yeast cells, separation of the extract by sucrose gradient and interpretation of the results.  This procedure is readily adaptable to mammalian cells.

This article describes a protocol for the extraction of translating ribosomes from eukaryotic cells. Once extracted, ribosomes are separated into monosomes and polyribosomes by sucrose gradient fractionation to allow different ribosomal populations to be analyzed. As such, this method is the gold standard for examining the regulation of translation.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

Protein synthesis is a complex cellular process that is regulated at many levels. For example, global translation can be inhibited at the initiation phase ...

Biyoloji

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Isolation of Primary Mouse Hepatocytes for Nascent Protein Synthesis Analysis by Non-radioactive L-azidohomoalanine Labeling Method

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for systemic energy homeostasis. Primary hepatocytes isolated from the murine liver constitute a valuable biological tool to understand the functional properties or alterations occurring in the liver. Herein we describe a method for the isolation and culture of primary mouse hepatocytes by performing a two-step collagenase perfusion technique and discuss their utilization for investigating protein metabolism. The liver of an adult mouse is sequentially perfused with ethylene glycol-bis tetraacetic acid (EGTA) and collagenase, followed by the isolation of hepatocytes with the density gradient buffer. These isolated hepatocytes are viable on culture plates and maintain the majority of endowed characteristics of hepatocytes. These hepatocytes can be used for assessments of protein metabolism including nascent protein synthesis with non-radioactive reagents. We show that the isolated hepatocytes are readily controlled and comprise a higher quality and volume stability of protein synthesis linked to energy metabolism by utilizing the chemo-selective ligation reaction with a Tetramethylrhodamine (TAMRA) protein detection method and western blotting analyses. Therefore, this method is valuable for investigating hepatic nascent protein synthesis linked to energy homeostasis. The following protocol outlines the materials and methods for the isolation of high-quality primary mouse hepatocytes and detection of nascent protein synthesis.

Here, we present a protocol for the isolation of healthy and functional primary mouse hepatocytes. Instructions for detecting hepatic nascent protein synthesis by non-radioactive labeling substrate were provided to help understand the mechanisms underlying protein synthesis in the context of energy-metabolism homeostasis in the liver.

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

Hepatocytes are parenchymal cells of the liver and engage multiple metabolic functions, including synthesis and secretion of proteins essential for ...

Tıp

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. Accordingly, dysregulation of mRNA translation is considered to play a major role in a variety of pathological states including cancer. Ribosomes also host chaperones, which facilitate folding of nascent polypeptides, thereby modulating function and stability of newly synthesized polypeptides. In addition, emerging data indicate that ribosomes serve as a platform for a repertoire of signaling molecules, which are implicated in a variety of post-translational modifications of newly synthesized polypeptides as they emerge from the ribosome, and/or components of translational machinery. Herein, a well-established method of ribosome fractionation using sucrose density gradient centrifugation is described. In conjunction with the in-house developed &#8220;anota&#8221; algorithm this method allows direct determination of differential translation of individual mRNAs on a genome-wide scale. Moreover, this versatile protocol can be used for a variety of biochemical studies aiming to dissect the function of ribosome-associated protein complexes, including those that play a central role in folding and degradation of newly synthesized polypeptides.

Ribosomes play a central role in protein synthesis. Polyribosome (polysome) fractionation by sucrose density gradient centrifugation allows direct determination of translation efficiencies of individual mRNAs on a genome-wide scale. In addition, this method can be used for biochemical analysis of ribosome- and polysome-associated factors such as chaperones and signaling molecules.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Kemirgen Epididimal Spermatozoa&#39;lar phosphopeptide Analizi

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Epididimal Protein sentezi ve salgı Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler