Yazar, desteğinden ötürü Prof. Elliot M. Meyerowitz teşekkür etmek istiyorum ve teknik sorunları çözmede yardım için Caltech&#39;te Biyolojik Görüntüleme Tesisinde Dartmouth Koleji ve Dr Andres Collazo de el yazması üzerinde yorum, hem de Ann Lavanway canlı eş odaklı görüntüleme. Nathanaël Prunet çalışmaları Elliot M. Meyerowitz Grant R01 GM104244 aracılığıyla Amerikan Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.

1. Medya ve Tabaklar Hazırlık <ol><li> % 2 agaroz ile 0.5 cm (2 cm derinliğinde, yaklaşık 6 cm genişliğinde) yuvarlak plastik kutular doldurarak yemekler kesme hazırlayın. </li><li> Bulaşıkları görüntüleme hazırlayın. <ol><li> Dik konfokal mikroskop için, dikdörtgen plastik görüntüleme ortamıyla 0.5 cm (3 cm derinliğinde, 4.5 cm genişliğinde, yaklaşık 7 cm uzunluğunda) kutuları menteşeli doldurun (bakınız Bölüm 1.3, &quot;Görüntüleme ortamı&quot;; Şekil 1F). </li><li> Ters bir konfokal mikroskop için: tam görüntüleme ortamı ile ağzına kadar (yaklaşık 3.5 cm genişliğinde 1 cm derinliğinde) küçük bir petri doldurun (bakınız Bölüm 1.3, &quot;Görüntüleme ortamı&quot;, Şekil 1G). </li></ol></li><li> Görüntüleme ortamı hazırlayın. <ol><li> tek noktalı görüntüleme için,% 1 agaroz kullanın. </li><li> zaman atlamalı deneyleri için, potasyum hydroxid ile apeks büyüme ortamı (vitamin olmayan 0.5x Murashige ve Skoog bazal tuz karışımı,% 1 sükroz,% 0.8 agaroz pH 5.8 kullanımıvitamin [% 0.01 miyo-inositol,% 0.0001, nikotinik asit,% 0.0001, piridoksin hidroklorür,% 0.001 tiamin hidroklorür,% 0.0002 glisin] ve sitokinin [500 nM N6-benziladenin]) 15 ile takviye e çözeltisi. </li></ol></li></ol> 2. Bitki Büyüme <ol><li> Uygun bir seçim ile MS plakaları (vitamin olmayan 0.5 ya da 1 x Murashige ve Skoog bazal tuz karışımı,% 0.8 ağar, potasyum hidroksit çözeltisi ile pH 5.8) ile sterilize edilmiş tohum ekmek. Uzun gün (16 saat ışık) ya da sürekli günde yer plakaları, iki hafta boyunca 16-22 ° C koşulları. </li><li> yeterli aralık ile toprak üzerine nakli fideleri sağlam gelişimine izin vermek için. kısa günde Yeri bitkileri, üç hafta boyunca 16-22 ° C koşulları. NOT: Doğrudan prematüre çiçeklenme ve daha az kuvvetli ve teşrih çok zor olan inflorescences sonuçları dikimden sonra uzun bir gün veya sürekli gün koşullarında bitkilerin yetiştirilmesi. Benzer şekilde, kısa gün iklimlendirme altında bitkiler bırakaraküç haftadan fazla gün boyu bağımsız çiçeklenme sonuçlar ve daha az şiddetlidir inflorescences için iyonları. </li><li> Uzun gün (16 saat ışık) ya da sürekli bir gün transfer bitkiler, çiçek kadar 16-22 ° C koşulları. çiçeklenme 2-10 cm uzunluğunda olduğunda sürgün ucu teşrih en kolay olanlardır. </li></ol> Atış apeksinin 3. Diseksiyon <ol><li> İsteğe bağlı: ince keskinleştirme taş ve hafif petrol bir damla kullanarak, işaret benzeri olmayan, onları bıçak benzeri yapmak için stereomicroscope altında forseps keskinleştirmek. </li><li> kırılıncaya kadar forseps ile pedinküllerin tabanını iterek birincil çiçek durumundan silikvalar, eski çiçek tomurcukları ve ikincil salkımına çıkarın. (A ve B karşılaştırma, Şekil 1) büyütme olmadan mümkün olduğu kadar çok çiçek çıkarın. </li><li> forseps, bir ayırma kabı agaroz delmek dikey delik kullanarak, çiçeklenme son 0.5 cm kesilir ve agaroz dikey olarak yapıştırın. KalanÇiçek tomurcukları, agaroz yüzeyi üzerinde olması gerekir. </li><li> Sürgün ucu tamamen dalmış, böylece steril, de-iyonize su ile görüntüleme çanak doldurun. (C ve D karşılaştırın, Şekil 1) bir stereomikroskop altında kesme tabağına yerleştirin ve 1000 uL pipetle su jetleri oluşturarak sürgün ucuna çevresinde kalan havayı çıkarmak. </li><li> Stereomikroskop altında, sapı tabanında veya peduncle sonları (Şekil 1E) kadar tomurcuk üstüne iterek yansıması değildir çiçek tomurcukları kaldırmak için forseps kullanabilir. Artık pedinküller genç çiçek tomurcukları kaldırılmasını engelleyen olarak pedinküller sapı ile kavşakta temiz kırmak önemlidir. </li><li> Görüntüleme sadece çiçek tomurcukları evre 5 ve daha küçük (Şekil 2A), sahne 6-8 çiçek tomurcukları diseksiyon önce suyu uzaklaştırmak edin. görüntüleme çiçek tomurcukları evre 5 ve üzeri, çanak yaprağı ablasyon devam ederse (bakınız bölüm 5.1). Aksi halde, pro3.7 adıma karışmaya bırakıldı. </li><li> forseps kullanarak, bir görüntüleme yemeğin orta dikey delik delmek ve orta disseke apeks dik sopa sadece sürgün apikal meristem ve çevresindeki çiçek tomurcukları ortamın yüzeyi üzerinde olacak şekilde. Bu çiçek tomurcuğu (ler), görüntülenecek olan bağlı olarak, çiçek tomurcukları mutlaka tam olarak sap (Şekil 2A) gibi yönlendirilmiş değildir gibi hafif, örnek yatırmak için gerekli olabilir. </li><li> Gerekirse numune boyama geçin. boyama ve / veya hemen numuneyi görüntüleme Değilse, su ekleyin ve su kaybını önlemek için görüntüleme tabak kapatın. Devrik bir mikroskop kullanarak ise şeffaf bir plastik kutu içinde görüntüleme tabak yerleştirin ve kapatın. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig1.jpg" /> Şekil 1: Canlı eş odaklı görüntüleme için sürgün uçları hazırlanması. (A - E) arasında Diseksiyongörüntüleme için apeks ateş. Çiçek önce (A) ve siliklerden ve yaşlı çiçekler (B) çıkarıldıktan sonra. (Cı - D) sürgün ucuna ucunun (C) sıkışmış bir hava kabarcığı ile, diseksiyon çanak içinde suya daldırılır ve hava kabarcığı (D) çıkarılmasından sonra. Bir (G) (F) dik ve ters çevrilmiş odaklı mikroskobun üzerinde, görüntüleme tabak sürgün uçları arasında Görünüm - (E) evre 5. (G F) daha eski çiçek tomurcukları diseksiyon sonra, diseksiyon çanak içinde apeks vur . (F) &#39;de, bir 40X suda daldırma objektif suya batırılmış objektif ucuyla, fidanların biri üzerine yerleştirilir. (G) &#39;de, Sürgün ucu lensin ucuna görüntüleme ortamının bağlayan bir su sütunu ile, ters 40X suda daldırma objektif üstünde konumlandırılmıştır. (F) daha küçük panel HIG göstermektedirgörüntüleme ortamında yerleştirilen bir sürgün ucuna kırmızı dikdörtgen alanın, onu büyütme görünümü; Kırmızı ve mavi hatları sırasıyla orta ve su yüzeyini göstermektedir. (H - I) &#39;su daldırma objektif ucundaki su ekleyerek izin ısmarlama cihazların örnekleri: a parmak yapılmış bir buji önyükleme (H) hazırlanan bir silikon kauçuk kovan ve geçici bir manşon tozsuz lateks eldiven (G) gösterir. Ölçek çubukları = 0.5 (A) cm ve (B), (C) &#39;de 0.1 cm ve (D), ve 100 um (E). Bu şekil, ilk olarak referans 14 yayınlanmıştır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> 4. Boyama Not: hücre duvarları veya plazma membranları propidyum iyodür veya FM4-64 ile boyanmış olabilir, sırasıyla hücre çözünürlük elde etmek içingörüntüleme sırasında. Alternatif olarak, plazma membranı etiketli floresan proteinleri ile raportör hatları, 16 6 kullanılabilir. <ol><li> Görüntüleme çanak su çıkarın ve orta boya seyreltilmesi önlemek için kuru bir yüzey sağlamak. </li><li> stereomikroskop altında, 20, 10 uL pipetle kesilmiştir apekse ya 1 mg / ml propidyum iyodid solüsyonu boyalı ya da 80 ug / ml FM4-64 çözeltisi uL 30 için de geçerlidir. Bütün numune homojen bir lekeleme sağlamak için boya kaplı olduğundan emin olun. </li><li> FM4-64 kullanılıyorsa propidyum iyodür, ya da 20 dk kullanılarak halinde 2 dakika boyunca leke. </li><li> Steril, deiyonize su ile iki kez durulayın. </li></ol> 5. Sepal Ablasyon NOT: evre 4 anda, çanak yaprağı taslakları FM kapsayan başlar. bunlar büyüdükçe, altta uzanan doku floresans filtre ve görüntüleme işlemi engellemektedir. Çanak bir metal pim Mounte kullanılarak el ile çıkarılabilirBir pin mengene d veya çanak yaprağı Primordia yükselen üzerine lazer ablasyon kullanarak büyümeye engelledi. Bazı durumlarda, çanak eksik veya çiçeğin merkezi kısmı, normal olarak (Şekil 2F) 17 gelişirken FM örtmeyen yaprak benzeri organları ile ikame edildiği, böyle apetala1-1 gibi mutantların, kullanmak için Alternatif olarak, mümkündür. <ol><li> Çiçek tomurcuklarının aşama 5 ve daha büyük bir düz metal iğne tutan bir pim-mengene ile ilgili Sepal ablasyon (Şekil 2, E1-E2) <ol><li> stereomikroskop altında disseke apeks ile diseksiyon tabağına yerleştirin ve maksimum büyütme ayarlayın. sepals diseksiyon sırasında düzenli sürgün ucuna kadar su uygulamak için 1.000 mcL pipet kullanın alternatif steril, deiyonize su içinde tepe sürgünü batırın ya. </li><li> pin mengene ile, sürgün ucuna kadar teğet şekilde abaxial sepal üstündeki pimi, yerleştirin. uzak kopana kadar yavaşça sürgün ucuna uzak sepal itmekçiçek tomurcuğundan. </li><li> adaxial sepal ile benzer Devam fakat sürgün ucuna doğru sepal itin. </li><li> Yanal sepals ile benzer Devam fakat sürgün ucuna kadar radyal nispi pimini konumlandırmak ve çiçek tomurcuğu uzak, yanına sepals itin. </li><li> su kaybını önlemek için birkaç dakika için steril, deiyonize su içinde tepe sürgünü batırın. </li></ol></li><li> Aşama 3-4 de çanak yaprağı primordia lazerli ablasyon (Şekil 2, C5-D5) <ol><li> konfokal mikroskop sahnede lekeli dissekte tepe noktası ile görüntüleme tabağına yerleştirin. Bulun ve görüntünün o (bölüm 6, &quot;görüntüleme ayarları&quot; bölümüne bakınız) hazırlanıyor sanki apeks odaklanır. </li><li> Lazer ablasyon sistemi yazılımı kullanarak, eksen dışı ve maddede aks çanak yaprakları için evre 3, tepesi ve gelişmekte olan çanak yaprağı primordia ucu tipik olarak çiçek meristemi (kaplama başlamadan önce tekabül ablasyon bölgesini tanımlar ve geç evre 3 / erken de yan se aşama 4sarsak). </li><li> Set lazer güç ve uygun parametrelere bekleme süresi alttaki dokulara çok fazla hasar verir olmadan da yeterince hücreleri çıkarmak için. Tipik olarak, kullanılan lazer ablasyon sistemine bağlı olarak uygun parametreler başlangıçta çiçeğin geri kalanını etkilemeden, daha sonra FM üzerinde büyümeye sepals önlenmesi amacıyla kaldırılmıştır yeterli hücrelerini sağlamak için bir deneme-yanılma süreci içerisinde tanımlanmalı gerekir tomurcuk. Çok fazla lazer gücünü kullanarak ve büyümesini ve / veya hayatta kalmasını etkileyen, çiçeğin merkezinde zararın süresi sonuçlarını konut. Uygun parametreler belirlendikten sonra, bunlar daha sonraki deneyler için yeniden kullanılabilir. Not: ilk ablasyon yetersiz olursa, bu takip eden günlerde ikinci ablasyonu (Şekil 2, C4 ve D2) devam etmek mümkündür. </li></ol></li></ol> 6. Görüntüleme Kur <ol><li> Dik bir mikroskop kullanın. <ol&gt; <li> Orta yüzeyi 2.5-5 mm su sütunu (Şekil 1F) kaplıdır, böylece, steril, de-iyonize su ile kesilmiş uçları dışa ile görüntüleme çanak doldurun. Tamamen örnekleri daldırın. NOT: dik bir mikroskop ile görüntüleme, çeşitli uçları aynı görüntüleme çanak yerleştirilebilir. Görüntüleme işlemi, bir saat daha devam eder, ancak, propidyum iyodür seyreltilerek eğilimindedir ve bazı örnekler görüntüleme öncesi yeniden lekeleme gerekebilir. </li><li> Bir mikroskop kademesine (Şekil 1F) ile görüntüleme tabağına yerleştirin. Su daldırma lens indirin ve lens ucu suya dalan böylece sahne yükseltmek. disseke dorukları ezmek veya görüntüleme ortamı içine lens daldırma etmemek için dikkatli devam edin. </li><li> bir hava kabarcığı lensin ucunda sıkıştırılmazsa, 1000 uL pipetle su jetleri çıkarmak için olun. </li><li> Epifloresans aydınlatma, pozisyon altında mercek alanına disseke fidanların biri XY con kullanaraktroller. eyepieces bakın ve Z kumandasını kullanarak numunenin odaklanır. örneği parçalamak vermemek için dikkatli hareket edin. </li><li> konfokal mikroskop yazılımı kullanarak, görüntülenecek çiçek tomurcuğu yakınlaştırma, ve numune görüntüleme geçin. </li></ol></li><li> Ters bir mikroskop kullanın. <ol><li> 1.000 mcL pipet kullanarak lensin ucunda steril, deiyonize su bir damla koymak. </li><li> görüntüleme çanak alt üst tutun ve 1.000 mcL pipet ile, disseke apeksine steril deiyonize su bir damla ekleyin. </li><li> Bir mikroskop kademesine (Şekil 1G) ile görüntüleme bulaşık baş aşağı yerleştirin. örneği parçalamak etmemek için dikkatli devam edin. </li><li> epifloresans aydınlatma altında, XY denetleyicisi kullanarak lens ucu üzerinde disekte tepe pozisyon. örnek lens ucundaki su damla ulaşıncaya kadar, Z kontrolör ile dikkatli bir şekilde evresini. Bir su sütunu betw oluşturmalıdırlens ve ortamın ucu een. </li><li> Su sütunu oluşturmadığı takdirde, dikkatle 1.000 mcL pipet ile örnek bir damla su ekleyin. Su sütunu (Şekil 1 H ve 1 H) oluşturulması ve sürdürülmesi için kolaylaştırmaktadır ucunda, daha fazla su ilave etmek için lens geçici kovanları ekleyin. </li><li> Epifloresans aydınlatma altında, göz mercekleri ile bakmak ve Z kumandasını kullanarak numunenin odaklanır. örneği parçalamak etmemek için dikkatli devam edin. </li><li> konfokal mikroskop yazılımı kullanarak, görüntülenecek çiçek tomurcuğu yakınlaştırma ve örnek görüntüleme geçin. </li></ol></li><li> zaman atlamalı deneyler, görüntüleme çanak dışına su dökün ve zaman noktaları arasında yer su kaybını önlemek için kapatın. Uzun gün (16 saat ışık) ya da sürekli günde numuneler, 16-22 ° C koşulları görüntüleme tabağına yerleştirin. Her bir zaman noktasında önceki yeniden leke örnekleri. NOT: iken develo hücrelerping çiçek organları iki günde bir veya iki kez çiçek meristem bölmek, daha hızlı hücrelerini bölebilirsiniz ve hücre soyları zaman noktalarında her 24 saat ile izlemek kolaydır. eğer gerekirse Ancak, görüntüye altı saatte numuneler mümkündür. </li></ol> Görüntüleme Parametreleri 7. Hususlar NOT: görüntüleme parametrelerini ayarlamak için nasıl kullanılır konfokal sistemine çok bağlıdır. Aşağıda herhangi konfokal mikroskop ile kullanılabilen bu parametrelerin bazıları için öneriler. Görüntüleme parametreleri üzerine daha değerlendirmeler için, Tartışma bölümüne bakın ve 14 referans. <ol><li> XY çözüm için: iyi bir hücresel çözünürlük için x 1,024 1.024 kullanın. Alternatif olarak, çözünürlük pahasına, görüntüleme süresini azaltmak için 512 x 512 kullanın. </li><li> Z, çözünürlük için: 0.5-1.5 um adım boyutunu ayarlamak. üvey boyutunu düşürmek de Z çözünürlüğü ancak görüntüleme süresi artar. </li><li&gt; Iğne deliği için: 1-1,5 havadar birimlerine iğne deliği ayarlayın. iğne deliği artan sinyalin yoğunluğu, aynı zamanda sigara odak düzlem gürültü arttırır. </li></ol> Konfokal Verilerin 8. Görselleştirme <ol><li> Filme hala çiçek gelişiminin zaman noktalarının görüntüleri çevirin. <ol><li> Yazılımın (örneğin, Fiji) içinde (jpeg ya tif formatında) hareketsiz görüntüleri açın. </li><li> Stack Görüntü&gt; Yığınlar&gt; Görüntüler gidin. açık görüntüleri yığınında gruplandırılır. </li><li> yığınında görüntülerin sırası kronolojik karşılık vermezse, bunları yeniden düzenlemek için Yığın Sıralayıcısı eklentisi (Eklentiler&gt; Yığınlar&gt; Yığın Sorter) kullanın. </li><li> Filme yığını açmak için&gt; Farklı Kaydet&gt; AVI Dosya gidin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Prunet, N., Jack, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flower+Development+in+Arabidopsis:+There+Is+More+to+It+Than+Learning+Your+ABCs.">Flower Development in Arabidopsis: There Is More to It Than Learning Your ABCs.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 3-33 (2014).</li><li>Stewart, D., Graciet, E., Wellmer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+regulatory+mechanisms+controlling+floral+organ+development.">Molecular and regulatory mechanisms controlling floral organ development.</a> FEBS J. , (2016).</li><li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+auxin+transport+and+gene+expression+during+primordium+development+revealed+by+live+imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem.">Patterns of auxin transport and gene expression during primordium development revealed by live imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Curr. Biol. 15 (21), 1899-1911 (2005).</li><li>Reddy, G. V., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-cell+homeostasis+and+growth+dynamics+can+be+uncoupled+in+the+Arabidopsis+shoot+apex.">Stem-cell homeostasis and growth dynamics can be uncoupled in the Arabidopsis shoot apex.</a> Science. 310 (5748), 663-667 (2005).</li><li>Yadav, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WUSCHEL+protein+movement+mediates+stem+cell+homeostasis+in+the+Arabidopsis+shoot+apex.">WUSCHEL protein movement mediates stem cell homeostasis in the Arabidopsis shoot apex.</a> Genes &amp; Dev. 25 (19), 2025-2030 (2011).</li><li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana.">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (17), 4225-4237 (2004).</li><li>Chandler, J. W., Jacobs, B., Cole, M., Comelli, P., Werr, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DORNROSCHEN-LIKE+expression+marks+Arabidopsis+floral+organ+founder+cells+and+precedes+auxin+response+maxima.">DORNROSCHEN-LIKE expression marks Arabidopsis floral organ founder cells and precedes auxin response maxima.</a> Plant Mol. Biol. 76 (1-2), 171-185 (2011).</li><li>Urbanus, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+localisation+patterns+of+MADS+domain+proteins+during+floral+development+in+Arabidopsis+thaliana.">In planta localisation patterns of MADS domain proteins during floral development in Arabidopsis thaliana.</a> BMC Plant Biol. 9, (2009).</li><li>Hong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+Cell+Growth+Yields+Reproducible+OrganDevelopment+through+Spatiotemporal+Averaging.">Variable Cell Growth Yields Reproducible OrganDevelopment through Spatiotemporal Averaging.</a> Dev. Cell. 38 (1), 15-32 (2016).</li><li>Roeder, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+the+control+of+cell+division+underlies+sepal+epidermal+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Variability in the control of cell division underlies sepal epidermal patterning in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 8 (5), e1000367 (2010).</li><li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem.">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1110, 431-440 (2014).</li><li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Lineage+Analysis+to+Study+Cell+Division+Orientation+in+the+Arabidopsis+Shoot+Meristem.">Real-Time Lineage Analysis to Study Cell Division Orientation in the Arabidopsis Shoot Meristem.</a> Methods Mol. Biol. 1370, 147-167 (2016).</li><li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+flower+development+in+Arabidopsis.">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li><li>Prunet, N., Jack, T. P., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds.">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Dev. Biol. , (2016).</li><li>Fernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+plant+growth+in+4D:+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution.">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. , (2010).</li><li>Cutler, S. R., Ehrhardt, D. W., Griffitts, J. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+GFP::cDNA+fusions+enable+visualization+of+subcellular+structures+in+cells+of+Arabidopsis+at+a+high+frequency.">Random GFP::cDNA fusions enable visualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a high frequency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97 (7), 3718-3723 (2000).</li><li>Irish, V. F., Sussex, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+of+the+apetala-1+gene+during+Arabidopsis+floral+development.">Function of the apetala-1 gene during Arabidopsis floral development.</a> Plant Cell. 2 (8), 741-753 (1990).</li><li>Vernoux, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auxin+signalling+network+translates+dynamic+input+into+robust+patterning+at+the+shoot+apex.">The auxin signalling network translates dynamic input into robust patterning at the shoot apex.</a> Mol. Systems Biol. 7, 508 (2011).</li><li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators.">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li><li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MorphoGraphX:+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D.">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864 (2015).</li><li>Barbier de Reuille, P. B., Robinson, S., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+cell+shape+and+gene+expression+in+the+shoot+apical+meristem+using+MorphoGraphX.">Quantifying cell shape and gene expression in the shoot apical meristem using MorphoGraphX.</a> Methods Mol. Biol. 1080, 121-134 (2014).</li></ol>

Yazar ifşa hiçbir şey vardır.

Burada, bir konfokal mikroskop ve bir su-daldırma lens ile canlı, gelişmekte Arabidopsis çiçek tomurcukları görüntüleme için bir protokol sağlar. Bu dik veya ters bir mikroskop ya ile yapılabilir iken, daha kolay ve eski kullanımı hızlıdır. Farklı konfokal sistemleri dalga boylarını ayırmak için hız, hassasiyet ve yetenek açısından anlamlı farklılıklar gösterdiğini belirtmek gerekir. Aynı örneklerde, en iyi konfokal mikroskop artık görüntü birkaç farklı kanallar (Şekil 2G örneğin, GFP, YFP, DsRed ve propidyum iyodür) izin verir. Bazı konfokal mikroskop aynı anda birkaç fluorophores floresans toplamak ve daha sonra bunları ayırmak için bir spektral dedektörü ile donatılmıştır. normal bir detektör kullanılarak, ancak, lazerler ve bir filtre grubu heyecan ve farklı flüorofor floresans ayırmak için kullanılmalıdır. Bazı floroforlar tamamen farklı emisyon spektrumları (örn CFP bird YFP), ve aynı zamanda görüntülenebilir. Başka fluoroforlar, kısmen üst üste emisyon spektrumunu (örneğin, GFP ve YFP) olabilir ve genellikle görüntüleme süresini arttırır, ayrıca görüntülü gerekir. yakın florofor Görüntüleme aynı zamanda sık sık bir kanal içine sızmasını bir florofor floresans önlemek için, her bir kanal için toplanır ne spektrumunun çok kısıtlayıcı gerektirir. Bu lazer güç ve kazanç bir artışla telafi edilebilir toplanan sinyalin, yoğunluğu kaybına neden olur. Bununla birlikte, uzun süreli görüntüleme zamanı ve daha yüksek lazer gücü ağartıcı ve / veya örnek zarar verebilir. Artan lazer güç ve / veya kazanç da arka plan gürültüsünü artabilir. Sinyal yoğunluğu, çözünürlük ve her bir numune için görüntüleme sürelerini kısaltıyor deneme-yanılma sürecinden yapılır ve kalıcı dengeler müdahalesi içermez. Bu protokol bir disseke sürgün ucuna yamaçlarında gelişen çiçek tomurcukları canlı konfokal görüntüleme gerçekleştirmek açıklar. OSürgün ucu bitkinin geri kalanına bağlı olan ve olmayan olması SAM ve çiçek gelişimini etkileyebilecek cytokinins içeren bir ortamda yetişen iddia edilebilir. Ancak, bu orta apikal meristemler, normal plastochron yeni çiçek tomurcukları üretmek ve bu çiçek tomurcukları normalde 15 geliştirdiğini disseke ateş sağlamak için bir deneme-yanılma süreci ile ampirik olarak tasarlanmıştır. Benzer şekilde, çanak yaprağı diseksiyon gen ekspresyonu veya çiçeğin kalanı gelişimini etkilediği görünmüyor. SAM canlı confocal görüntüleme gerçekleştirme başka protokoller detaylı halen (örneğin 11 referans) bitkinin geri kalanına bağlanmış. Bu protokoller üzere uyarlanmış ve özellikle oksinle ilgili süreçler üzerinde çalışılması sırasında, çiçek geliştirme görüntüleme için yararlı bir alternatif sunmaktadır edilebilir. kök uzayarak katlanmış, ve çiçek tomurcuklarının yönünü değiştirir;: Bunlar çeşitli dezavantajları mevcut birbitkinin geri kalanına bağlı bir tepe sürgünü görüntüleme dik bir mikroskop ile iyi çalışır iken nd, bir ters mikroskop ile bunu çok daha karmaşıktır. Daldırma lensler &quot;kuru&quot; lens sistemi (hava ile numuneden ayrılır yani lensler) daha iyi bir sayısal açıklık (NA) sahiptir ve bu yüzden bir konfokal mikroskop kullanılarak zaman kritik numune, daha ince bir çözünürlüğü sağlar. Görüntüleme işlemi sırasında dehidrasyon gelen tepe sürgünü önlerken su daldırma lens kullanarak böylece kuru lens çok daha iyi NA sağlar. gliserin ve yağ lensler su lensler daha da yüksek NA sahip olsa da, bir numunede de zaman atlamalı deneyler sırasında büyüyen tutan bir sürgün ucuna, büyüklüğü ile çok kullanışsız olduğu bir lamel, kullanımını gerektirebilir. Numunelerin boyutu göz önüne alındığında, uzun bir çalışma mesafesi olan bir lens kullanmak da önemlidir (çiçek kademelerine bağlı olarak, yığın boyunca 150 um kalınlığında olabilir). Bu tipik olarak 1 bir NA ve 1.7-2.5 mm arasında bir çalışma mesafesi ile bir 20 ya da 40 kat lens kullanımı. Konfokal mikroskop yazılım üç boyutlu rekonstrüksiyon (Şekil 2, B1, B2 ve B4) ve dilim görüntüleme (Şekil 2, B3) de dahil olmak üzere konfokal verileri görselleştirmek için çeşitli yöntemler sunar. En yaygın olarak kullanılan üç boyutlu görüntüleme konfokal Z yığınlar (Şekil 2, B1 ve B4) bazı yazılım maksimum yoğunluğu çıkıntıları iken (örneğin, Zen ve Imaris), aynı zamanda, derin kısımlarında sinyali süzer şeffaflığı manzarası sunar epidermal tabaka olarak ifade yer alan süreçlerin veya gen bakarken yararlı olabilir numunesi (Şekil 2, B2). Sinyal yoğunluğu, ya piksel inte kullanılarak, tek bir renk (Şekil 2, B1) ile kodlanabilirnsity ya da bir renk kodu (Şekil 2, B4) kullanılarak. Canlı konfokal görüntüleme sadece çiçek gelişimi için değerli kalitatif irdeliyoruz, aynı zamanda potansiyel olarak nicel veri zenginliği ile gelişimsel biyologlar sağlar. Farklı yazılım (örneğin Imaris, Fiji, Mars-ALT, MorphographX 15, 20, 21) sayısına ya da bir ya da daha muhabir ya da farklı hücrelerde bir raportör ekspresyon seviyesini gösteren hücrelerin hacim ölçümü için izin verir. Bu tür yazılımlar da, otomatik hücre segmentasyon gerçekleştirme hücre soylarından izlemek ve büyümeyi ölçmek için kullanılabilir. Bu, farklı yazılım benzer araçlar sunar, aynı zamanda birçok yönden farklıdır. Mars-ALT MorphoGraphX Imaris a farklı olarak, bitki 15, 20, 21 için özel olarak tasarlanmıştırnd Fiji. Imaris ve Mars-ALT bütün örneğin bölümlere ve analiz için izin verirken MorphoGraphX ​​sadece epidermal tabakasının parçalara ve analiz edilmesine izin vermektedir. Bununla birlikte, Mars ALT üç farklı açılardan 15 aynı örnek önceden görüntüleme gerektirir ve Imaris yalnızca tek bir yığın gerektirir. nicel bilgiye erişim çiçek gelişiminin anlayışımızı ilerletmek için kritik öneme sahiptir.

ya meristeme - - Filiz ve köklerin bitki gövdesinin çoğu kök ucundaki veya yakınında hücrelerin gruplardan post-embriyonik oluşturur. Vejetatif aşamasında bırakır ve çiçek meristemler (FMS) üreme faza geçiş yapar sonra: yetişkin bitkinin toprak üzerinde kalan tüm yapıların sürekli olarak yanları lateral organ üreten sürgün apikal meristem (SAM) türer. sırayla Dışişleri bakanları çiçeklerin içine gelişir. Arabidopsis SAM zamanda yan organların bir üretirken, yinelemeli bir, yay örgüsü içinde FMS birden fazla gelişim programları aynı anda çözülüyor ile, kısmen eş zamanlı bir şekilde, dört kıvrımları olan çiçek organları dört tip üretir. Farklı çiçek organlarının kimlik şartname altında yatan genetik ağların kısmen çiçek developme ki, ama pek çok açıdan (yorumlara, referanslar 1, 2 bakınız) deşifre edilmişnt, örneğin bitkisel, organ konumlandırma ve kıvrımları arasındaki sınırların tanımı olarak, yeterince anlaşılamamıştır. Bitki gelişiminin erken moleküler genetik çalışmalar daha çok gen ekspresyonunu analiz etmek için in situ hibridizasyon ve GUS muhabir gibi teknikler dayanıyordu. Bu yöntemler bilgi hazinesi sağlanan ve büyük ölçüde bitki büyüme ve çiçek gelişimi anlayışımıza katkıda bulunmuş olsa da, önemli sınırlamalar vardır: onlar iyi hücresel çözünürlük eksikliği, aynı birden fazla genlerin ifade örneğinin kolay gözlem için izin vermez numuneler, ve daha da önemlisi, sadece ölü sabit dokular için uygulanabilir. Konfokal mikroskopi son gelişmeler bu sınırlamaları aşmak ve işlemesi ile altta yatan bitki morfogenetiğine araştırmak için güçlü bir araç ile gelişimsel biyologlar sağlamak var. Özellikle, konfokal mikroskopi c bunların oluşum boyunca canlı doku ve organların gözlem sağlarTamamen böyle bir gelişme olarak bir özünde dinamik süreci anlamak için ritical. Canlı konfokal görüntüleme yoğun, (mesela referanslar 7, 8 (örneğin 3 başvuran 4, 5, 6), ancak birkaç raporların haricinde SAM tarafından bitkilerin havadan büyüme ve yanal organlarının üretimini analiz etmek için kullanılmıştır 9, 10), bu yaygın çiçek gelişimini çalışmaya uygulanmamıştır. SAM canlı eş odaklı görüntüleme için protokoller (örneğin 12 11 başvuran) kullanılabilir ve SAM çevreleyen nasıl görüntüye gelişmekte çiçek tomurcukları için iyi bir temel sağlar. Ancak, görüntüleme çiçek tomurcukları belirli zorluklar ortaya: Örneğin,Çiçek tomurcukları hızlı SAM daha büyük hale gelir ve aşama 4&#39;te, çanak yaprakları (referans 13&#39;de tarif edildiği gibi aşamaları), FM kapsayan ve bu dokular (Şekil 2A) altta yatan floresans karartma başlar. Burada, dik ya da ters bir mikroskop ve bir su-daldırma lens kullanarak Arabidopsis çiçek tomurcukları geliştirmeye canlı eş odaklı görüntüleme gerçekleştirmek için nasıl açıklayan ayrıntılı bir protokol sağlar. Daha önce referans 14&#39;de bu protokolü yayınladı.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Forceps&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72701-D</td>
			<td style="width:325px;">Dumont Style 5 Inox, for apex dissection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Pin Vise</td>
			<td style="width:143px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13560</td>
			<td>80 cm long, for sepal ablation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Straight Stainless Steel Needles&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">13561-50</td>
			<td>0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Round plastic boxes</td>
			<td style="width:143px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">64332</td>
			<td>transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rectangular hinged boxes</td>
			<td>Durphy Packaging Co.&#160;</td>
			<td style="width:119px;">DG-0730</td>
			<td>transparent, 2-7/8&#8221; long, 2&#8221; wide, 1-1/4&#8221; deep, to use as imaging dishes with an upright microscope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:272px;">Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">25382-064</td>
			<td>transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P10 and P1000 pipettes&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>with corresponding filter tips</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>with an 80-90 x maximum magnification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser ablation system</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>for sepal ablation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Laser scanning confocal microscope system</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20 or 40 x water-dipping lens</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Agarose</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murashige and Skoog basic salt mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5524</td>
			<td>without vitamins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Myo-inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7508</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Nicotinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N0761</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyridoxine hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6280</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiamine hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1270</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G8790</td>
			<td>vitamin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N6-Benzyladenine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B3408</td>
			<td>BAP, a cytokinin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">Propidium iodide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4864</td>
			<td>1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:272px;">FM4-64</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F34653</td>
			<td>dilute in water to 80 &#956;g/mL, to stain the plasma membranes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live confocal imaging of developing arabidopsis flowers

Bitki büyüme ve gelişme çalışması uzun zaman önce ölmüş, sabit dokuları kullanılarak ve uygun hücresel çözünürlük eksik deneysel teknikler güvenmiştir. sayısız floroforların gelişimi ile kombine eş odaklı mikroskopi son gelişmeler, bu sorunları aşmak ve canlı örneklerde, iyi bir hücresel çözünürlükte, aynı anda birkaç genlerin ifadesini çalışma imkanı açtı. Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç ile bitki biyologlar sağlar ve yoğun kök büyümesi ve sürgün apikal meristem yamaçlarında yanal organlarının oluşumunu incelemek için kullanılmıştır. Ancak, yaygın nedeni böyle çiçek meristem üzerinde büyümeye sepals olarak çiçekler, görüntülenmesi ve bu altta kalan dokulardan floresan filtre özgü zorluklara kısmen, çiçek gelişimini çalışmaya uygulanmamıştır. Burada, Arap gelişmekte canlı canlı eş odaklı görüntüleme gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol mevcutDik veya ters bir mikroskop kullanılarak idopsis çiçek tomurcukları.

Şekil 2, farklı floresan haberci genleri ifade canlı Arabidopsis çiçek tomurcuklarının konfokal Z yığınlarının farklı görünümlerini göstermektedir, ve ya da propidyum iodid (Şekil 2, A-C5 ve G) ya da FM4-64 (Şekil 2, E1-F) ile boyanmıştır net bir hücresel çözünürlük sağlamaktadır. En konfokal sistemleri propidyum iyodür veya FM4-64 (- 2F Şekil 2A) ile birlikte ya GFP ya da YFP çakışmayan emisyon spektrumu ile iki florofor görüntüleme için izin verir. En iyi konfokal sistemleri, aynı zamanda, GFP ve YFP ve DsRed ve propidyum iyodür (Şekil 2G) ile aynı numunelerde kısmen üst üste binen emisyon spektrumları, birden fazla fluorophores ayırmak mümkündür. Zaman atlamalı deneylerin üç örnek Şekil sunulmuştur2 ve çanak yaprağı eritme lazer ablasyon sistemi ile ya da gerçekleştirilmiştir sonra çiçek tomurcukları normal gelişim göstermektedir (Şekil 2, C1-C5 ve D1-D5) ya da el ile bir pim-mengene ve bir metal pim ile (Şekil 2, E1-E2). Şekil 2&#39;de gösterilen çiçek tomurcuğu, E1-E2 karpel primordia çiçek tomurcuğu çıkan çanak yaprağı primordia aşama 7. lazer ablasyonunun de tomurcuk merkezinde gözlenmez nedenle Süpermen-1 mutant bitkiden olduğuna dikkat edin Şekil 2&#39;de gösterilen, C1-C5 yine aşama 5 (Şekil 2, C5) görüntülenebilir FM, kaplama engeller. Tersine, Şekil 2&#39;de gösterilen çiçek tomurcuk halinde, D1-D5, lazer ablasyon sadece çanak yaprağı büyüme gecikmiş, ancak çanak sonunda sahneye 5 (Şekil 2, D5 tarafından FM çoğunu kapsayacak şekilde büyüdü </strong&gt;). Çok fazla lazer gücü ve konut zaman lazer ablasyon sırasında kullanılırsa Aksine, hasar çiçeğinin orta kesiminde yayılır ve büyümesini etkiler ve bazen bütün çiçek tomurcuğu müteakip ölümle sonuçlanır. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55156/55156fig2.jpg" /> Şekil 2: canlı çiçek tomurcuklarının konfokal Z-yığınlarının Görselleştirme. A ve B2 şeffaflık görüntülerdir; B1 ve B4-G, maksimum yoğunluk tahminleridir; B3 ortogonal bir dilim görünüşüdür. (A - E2) APETALA3 geni (yeşil) için Venüs muhabiri ifade eden çiçekler; Hücre duvarları (yeşil, B4 haricinde kırmızı) propidyum iyodid ile boyanmıştır. (A) Çiçek; sayılar çiçek aşamalarını göstermektedir; 4. aşamada çanak yaprakları ve 5 çiçek normal fo Venüs habercisinin floresan, filtrebir halka rms. Bazı çiçek tomurcukları çiçeklenme kıyasla eğik görünen unutmayın. (B1 - B4), bir aşama 5 çiçek tomurcuğu aynı konfokal Z yığının Dört farklı görünümler: azami kesafetin çıkıntılar yeşil renkte (B1), piksel şiddeti ile kodlanmış Venüs sinyal yoğunluğu (B1 ve B4) veya yangın renk kodu ile (B4; renk kodu panelin alt kısmında gösterilir); saydamlık görünüşüdür (B2) ve dik kesit görünüşüdür (B3, dilimlerin XY XZ ve YZ yönlendirme paneli belirtilir). (C1-- C5) aşaması 5&#39;e aşama 3&#39;ten bağımsız bir çiçek tomurcuğu 4 günlük bir zaman atlamalı; (beyaz özellikleri olarak işaretlenmiş), lazer ablasyonlar gün 1 üzerinde gerçekleştirilen ve 3. günde 5 kademesine (D1 - D5) de çiçek tomurcuğu merkezi kapsayan gelen çanak yaprakları önlemek için yeterli olan bir tek çiçek tomurcuğu 4 günlük bir zaman-yanılmasından evreaşama 5-3; günde 1, 2 ve 3 üzerinde yapılan lazer ablasyonlar çiçek tomurcuğu merkezi kapsayan gelen çanak yaprakları önlemek için yetersizdir. (E1 - E2) abaxial ve adaxial sepals (E1) elle çıkarılması sonrasında Bireysel çiçek tomurcuğu ve tüm sepals (E2); beyaz ok başları kalan çanak yaprakları göstermektedir; Beyaz yıldız çanak yaprakları uzaklaştırılması sonucu izleri gösterir. (F) aşaması bir DR5-3xVenusN7 Reporter 18 (yeşil) eksprese eden 7 apetala1-1 çiçek; plazma membranları FM4-64 (kırmızı) ile boyanmıştır; mavi ok başları sepals yerini ve çiçek tomurcuğu örtmeyen yaprak benzeri yapılar göstermektedir. (G) Dornröschen-7 gibi (yeşil), SUPERMAN (kırmızı) için bir Venüs raportör bir floresan GFP raportör ifade Aşama 4 çiçek tomurcuğu ve CLAVATA3 19 (mavi) bir DsRed muhabir; hücrelerDuvarlar propidyum iyodür (gri) ile boyanmıştır. D: gün; st: aşama. Ölçek çubukları 25 um =; ölçek C1-C5 ve D1-D5, B1, B2 ve B4 aynıdır. Bu şekil, başvuru 14 modifiye edilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55156/55156fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers at JoVE.com

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

live-confocal-imaging-of-developing-arabidopsis-flowers

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

14.7K Görüntüleme.  California Institute of Technology.  Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut. 

Video: Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

Vitro Zigot polarizasyon, Live-hücre görüntüleme ve Arabidopsis thaliana embriyo desenlendirme için ovule ekimi

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic development. The activity and morphology of SAMs determine important agronomic traits, such as shoot architecture, size and number of reproductive organs, and most importantly, grain yield. Here, we provide a detailed protocol for analyzing both the surface morphology and the internal cellular structure of the living SAMs from different species through laser scanning confocal microscope. The whole procedure from the sample preparation to the acquisition of high resolution three-dimensional (3D) images can be accomplished within as short as 20 minutes. We demonstrate that this protocol is highly efficient for studying not only the inflorescence SAMs of the model species but also the vegetative meristems from different crops, providing a simple but powerful tool to study the organization and development of meristems across different plant species.

This protocol presents how to live image and analyze the shoot apical meristems from different plant species using laser scanning confocal microscopy.

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Canlı-görüntüleme