Name: impression cytology of the lid wiper area
Uploaded: 2016-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Impression Cytology of the Lid Wiper Area at JoVE.com

We would like to acknowledge our colleague Dr. Jalaiah Varikooty who provided insight and expertise on the topic of the lid wiper, that greatly assisted this research.

Etik deyimi: Ön insan denekler hücreleri toplamak için, aydınlatılmış onam ve etik onayı alınmalıdır. 1. Leke hazırlayın NOT: Deney günü boya hazırlayın. <ol><li> 15 ml santrifüj tüpü içinde 2.5 ml fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 5 ul Etidyum (veya 4 uM) ve 5 ul Calcein AM (veya 4 uM) ilave et; karıştırın. kullanılana kadar oda sıcaklığında hafif ve deposundan korumak için alüminyum folyo ile sarılır. </li></ol> 2. Toplama Hücreler <ol><li> kendi paketinden hücre kültürü ekler çıkarın ve her göz kapağı numune alınacak için etiket. kalıcı bir kalem kullanarak zar plastik tutucu tarafında hücre toplama Mark yönelimi. Davranış IC geçmesi bölgenin uygun sağlığını onaylamak için orta büyütme (yaklaşık 20X) Lambanın denetim yarık. </li><li> ea alt konjunktival kesesine topikal anestezi (% 0.5 proparacaine hidroklorür) bir damla dağıtınch göz ve gözleri korumak için katılımcıyı talimat bir dakika süreyle kapattı. </li><li> Evert üst göz kapağı ve kirpik tarafından yerinde tutun; kapak silecek alanı ile herhangi bir temastan kaçının. İsteğe bağlı: İkincil araştırmacı yardım Bu adımı gerçekleştirmek gerekebilir. </li><li> minimal basınç ile kapak silecek bölgenin orta kısmında dik olarak membran uygulayın. </li><li> 5 saniye - 3 yerine membran tutun. iletişim alanında saydam hale membran gözlemleyin. Bu noktada, hafifçe membran kaldırmak ve yerine geri &quot;çevirmek&quot; için katılımcının kapağını izin verir. </li><li> Derhal kurumasını önlemek için, örnek PBS bir damla uygulanır. Membran saydam dönecek ve bu kurumayı belirttiği gibi, herhangi bir zamanda opak dönmemelidir. İkincil araştırmacı örneklerinin işlenmesi (bölüm 3) ile hemen devam var. </li><li> konjonktiva bütünlüğünü sağlamak için nihai göz kontrolü yapıyoruz. oküler yağlayıcılar koyun ve katılımcıyı talimatanestetik etki kapalı giyer kadar gözlerini ovuşturarak önlemek için (yakl. 15 dk). </li></ol> 3. Örnek İşleme <ol><li> mikro-makas kullanılarak, dikey hücresi ile toplama ortasından ikiye (alt analizler her biri için bir adet yarım) membran kesti. plastik tutucu ayırmak için bir membran yarısının dış kenarı boyunca kesme; membran kendi üzerine kat etmemesini sağlamak da dahil olmak üzere membran üzerinde toplanan hücreleri ile etkileşimi önlemek. </li><li> tamamen sahibinden ayrılmakta önce cımbız kullanarak membran sabitleyin. % 95 (h / h) ihtiva eden bir 500 ul ihtiva eden ve (Bölüm 4.2) işleme önce 2 saat, en fazla 20 dakika içinde en az düzeltmek için terk etiketli 2 ml santrifüj tüpüne yer membran. </li><li> (Bölüm 3.2&#39;de anlatıldığı gibi) ve derhal bölüm 4.1 ile devam membran hemen ayrı ikinci yarısı. </li></ol> 4. Numune Boyama <ol><li> Immunocytochemical Boyama <ol><li> Dikkatle toplama yüzü aşağı bakacak şekilde 35 mm cam alt kültür çanak membran yerleştirin; Membran düz olduğundan emin olun. </li><li> Pipet zara bölüm 1 monte İmmünositokimyasal leke kompozisyon 20 ul. Örnek bukleler kadar, dikkatle kenarlarını bastırarak membran düzleştirmek için tek kullanımlık pipet uçları kullanın. Hücre toplama alanları ile temastan kaçının. </li><li> Yavaşça cam kapak slip ile membran kapak. Numunenin gereksiz hareketini önlemek. Kapaklı çanak Kapak ve kenarlarda laboratuvar film ile kapatın. çanak (üstte ve altta) ve numunenin görünürlük şeffaflık engellemeyin. laboratuar işaretleyici ile etiketleyin. </li><li> Hemen görüntüleme (bölüm 5.1) ile devam, sonra membran diğer yarısı sitolojik boyama ile devam etmek için bölüm 4.2 dönün. </li></ol></li><li> sitolojik Boyama <ol><li> Yavaş yavaş yavaş tüp u damıtılmış su, 500 ul ekleyerek membran hidratbölüm 3.4 tespiti için sed. pipet içine aspire içeriği defalarca sonra içeriğini kaldırmak, karıştırın. </li><li> damıtılmış su, 500 ul ekle. Birkaç saniye için ayakta Izin, sonra çıkarın. Alcian blue 500 ul ilave edin ve 3 dakika boyunca bırakın. leke çıkarın ve 3 ardışık 500 ul damıtılmış su durular veya sıvı berrak durular kadar gerçekleştirin. </li><li> Hematoksilen 1. leke 500 ul ekleyin ve 3 dakika bekletin. leke çıkarın ve üç ardışık 500 ul distile su durulama gerçekleştirmek veya sıvı berrak durular kadar. berrak bir sıvı aspire (bölüm 4.2.1 tersini) kurutmak. </li><li> Papanicolaou RG-6 leke 500 ul ekleyin ve 3 dakika bekletin. leke çıkarın ve bir 500 ul% 95 (v / v) etanol durulama gerçekleştirin. </li><li> Papanicolaou EA-65 boyasının 500 ul ekleyin ve 3 dakika bekletin. leke çıkarın ve 3 ardışık 500 ul% 95 yerine (v / v) etanol durular. </li><li> Tam üç ardışık 500 ul% 100 etanol durulama kullanarak kurutmak. TWE kullanarakezers, çözeltiden örneği kaldırmak; dokunaklı hücre toplama alanları kaçının. </li><li> cam slayt membran yerleştirin; Bu hücre toplama hattı sağlamak paralel veya görüntüleme sırasında daha kolay uyum için marjını slayt dik olarak ayrılmaktadır. </li><li> % 100 etanol bir damla uygulayın ve cam slip ile kaplayın. Hemen görüntüleme (bölüm 5.2) ile devam edin. </li></ol></li></ol> 5. Numune Görüntüleme <ol><li> Görüntüleme Floresan İmmünositokimyasal Renklendiriciler <ol><li> Bir görüntü elde etme yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlı bir dijital renkli kamera ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) 11 veya floresan mikroskop 12, kullanın. örnekler kültür tabaklarına içinde bulunan kısmi olarak, bir inverted mikroskop gerekli olabilir. </li><li> Etidyum homodimer-1 (DNA&#39;nın mevcudiyetinde 528/617 nm örn / Em maxima) ve kalsein AM absorpsiyon ve emisyon spektrumu (494/517 nm e göre olan mikroskop 11,12 ayarlamax / Em maxima). </li><li> (Örneğin, 2.5X objektif) mikroskop düşük büyütme seçin ve dijital görüntüleme sistemini aktive; bilgisayar ekranında görüntülenen örnek gözlemlemek. </li><li> ilgi hücresel özellikleri için örnek olup olmadığını kontrol edin. </li><li> İstenilen mikroskop büyütme seçin ve görüntüleme yazılımı kullanarak görüntüleri kazanır. </li><li> Yerli mikroskop dosya biçiminde veya sıkıştırılmamış bir dosya biçiminde (örneğin, * .raw, * .tiff) ya dosyaları kaydedin. </li></ol></li><li> Görüntüleme Sitolojik Lekeleri <ol><li> Bir görüntü elde etme yazılımı çalıştıran bir bilgisayara bağlı bir dijital renkli kamera ile donatılmış herhangi bir filtre standart bir laboratuvar parlak alan mikroskobu, kullanın. </li><li> Yeri ve mikroskop sahnede (adım 4.2.8 itibaren) kilit cam slayt. gerektiği gibi tüm görüntüleme işlem boyunca,% 100 etanol ile örnek rehidrate. </li><li> (Örneğin, 2.5X objektif) mikroskop düşük büyütme seçin ve inci etkinleştirmekE dijital görüntüleme sistemi; bilgisayar ekranında görüntülenen örnek gözlemlemek. </li><li> Emin olun hücre toplama mikroskop sahne kontrolü X veya Y ekseni ya uyumludur. kapak kayma kaldırarak ve bir pipet veya cımbız kullanarak örnek çevirerek, gerekirse ayarlayın. </li><li> görüntüleme yazılımı, en düşük mikroskop büyütme ile tüm numunenin yakalama resim (ler) kullanma. </li><li> Orta mikroskop büyütme geçin (örneğin, 10 - 20X objektif) ve mikroskop ışık kaynağı ve yazılım görüntüleme parametrelerinin (pozlama, kontrast, beyaz dengesi, vs.) ayarlayabilir ve onların otomatik yazılım ölçüm devre dışı bırakın. ileride kullanmak için bu ayarları kaydedin. </li><li> Tarama (örneğin, sol üst ve hücre koleksiyonu sağ alt köşelerinde) başlangıç ​​ve bitiş noktalarını belirleyin. </li><li> görüntüleme yazılımı, başlangıç ​​ve bitiş noktaları içinde tüm hücre toplama alanının yakalama resim (ler) kullanma. % 20 yan-yana ve üst-to-alt üst üste betw sağlamaktüm bitişik görüntüleri een. </li><li> Yerli mikroskop dosya biçimini veya sıkıştırılmamış dosya biçimi (örneğin, * .raw, * .tiff) kullanarak dosyaları kaydedin. </li><li> (Örneğin, Adobe Photoshop Elements) seçim otomatik dikiş yazılımını kullanarak nihai panoramik görüntü oluşturun. Son görüntüde otomatik dikiş doğruluğunu onaylamak için adım 5.2.5 alınan referans görüntüleri) kullanın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Barbato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diurnal+variation+in+spontaneous+eye-blink+rate.">Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate.</a> Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).</li><li>Korb, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lid-Wiper+Epitheliopathy+and+Dry-Eye+Symptoms+in+Contact+Lens+Wearers.">Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers.</a> Eye &amp; Contact Lens. 28, 211-216 (2002).</li><li>Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+contemporary+contact+lenses+on+contact+lens+discontinuation.">The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation.</a> Eye &amp; Contact Lens. 39, 93-99 (2013).</li><li>Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friction+measurements+on+contact+lenses+in+their+operating+environment.">Friction measurements on contact lenses in their operating environment.</a> Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).</li><li>Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LIPCOF+and+contact+lens+wearers:+a+new+tool+to+forecast+subjective+dryness+and+degree+of+comfort+of+contact+lens+wearers.">LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers.</a> Contactologia. 22, 74-79 (2000).</li><li>Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+tests+for+successful+contact+lens+wear:+relationship+and+predictive+potential.">Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential.</a> Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).</li><li>Doughty, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+features+of+cells+along+Marx's+line+of+the+marginal+conjunctiva+of+the+human+eyelid.">Morphological features of cells along Marx's line of the marginal conjunctiva of the human eyelid.</a> Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).</li><li>Jalbert, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+the+human+lid+margin+epithelium+using+impression+cytology.">Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology.</a> Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).</li><li>Nelson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology.">Impression cytology.</a> Cornea. 7, 71-81 (1988).</li><li>Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+conjunctival+biopsy.">A simple conjunctival biopsy.</a> Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).</li><li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Confocal microscopy. , 1-64 (1990).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73-76 (1990).</li><li>Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+EyePRIM+Device+for+Conjunctival+Impression+for+Flow+Cytometry.">Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry.</a> Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).</li><li>Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lid+margin+is+an+underestimated+structure+for+preservation+of+ocular+surface+health+and+development+of+dry+eye+disease.">The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease.</a> Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).</li><li>Knop, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lid+wiper+and+muco-cutaneous+junction+anatomy+of+the+human+eyelid+margins:+an+in+vivo+confocal+and+histological+study.">The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study.</a> J Anat. 218, 449-461 (2011).</li><li>Christensen, J. A., Skaarland, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+and+cell+area+measurements+in+the+cytological+evaluation+of+pleural+effusions:+a+study+of+subjective+assessments+and+morphometric+measurements.">Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements.</a> Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).</li></ol>

The authors have no relevant funding or conflicts to disclose.

Gösterim sitoloji genellikle karışık selüloz ester membranlar kullanılarak, konjonktivada üzerinde gerçekleştirilir. Numuneler, dökme malzeme levhalar boyutta kesilir sterilize forseps kullanılarak konjunktival yüzeye uygulanan ve kaldırılır. Aynı membran malzeme kullanarak, bir piston kontrollü IC cihaz son zamanlarda uygulamalar 13 arasında tutarlı bir baskı bulber konjonktiva yüzey geometrisini maç ve korumak için tasarlanmıştır. Bu yaklaşımlar bölge silecek dar, belirgin kavis...

2 mm dar konjonktiva bölge göz küre karşı - insan üst göz kapağı sadece 1 ile 10,000 yanıp her gün yaklaşık 1 yürütür. Yanıp sırasında silme hareketi nedeniyle, göz kapağı kenarında bu bölümü &quot;kapak silecek&quot; bölgesini 2 olarak adlandırılmıştır. Sürtünme yüzünden dünya üzerinde silme kapak, alışılmış kırpma sırasında bu bölgede yüksek olduğu varsayılmaktadır. Bu göz konfor önemli bir rol oynayabilir. Kontakt lens özellikle deneyim göz rahatsızlık kullananlar ve bu mercek 3 giymek durdurması için birincil nedenlerinden biridir. Bir kontakt lens göze yerleştirildiğinde, lens materyali ve göz yüzeyi arasındaki sürtünme katsayısı 4 değiştirme gösterilmiştir. Kuruluk belirtileri bu değiştirilmiş sürtünme 2,5,6 ilişkili olabileceğini gösteren kanıtlar vardır. Bu ilişki aynı zamanda klinik olarak gözlemlenebilir olayların yansıması olabilir, özellikle kapak wiepitelyopati (LWE) da denilen üst kapak marjı boyama (ULMS) 6 başına. LWE oküler irritasyon erken bir belirtisi ve kuru göz hastalığı için potansiyel bir belirleyicisidir. Bu görülen üst ve alt kapak kenarında bölgelerinin önemli bir boyama ile ölçülür. Bu derecelendirme sistemi 2 ve klinik geçerliliği (yani öznel belirtiler ile korelasyon) tartışma halen iken, göz rahatsızlığı, hem doktorlar ve bilim adamları için bir bilmece kalır ve en önemlisi, hastalar için bir rahatsızlık. To-date, küçük kapak silecek alanının 7 (alt), hücresel anatomi ve fizyoloji klinik-alakalı varyasyonları hakkında bilinmektedir ve sadece tek bir rapor sitolojik yöntemler 8 kullanmaktadır. Gösterim sitoloji (IC) bir zar 9,10 uygulanması ile bulber veya tarsal konjonktiva epitel yüzeyinden hücreleri toplamak için 40 yıldır istihdam edilmiştir. çıkarılması üzerine, yapışan hücreler c geçmesiytological boyama ve mikroskopik görüntü. Nedeniyle kapak silecek bölgedeki anatomik ve hücresel farklılıkları, bu teknik optimizasyon gerektirir.

<table><tbody><tr><td>Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid</td><td>Sigma</td><td>B8438-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin, Gill 1</td><td>Sigma</td><td>GHS116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Papanicolaou stain, OG-6</td><td>Sigma</td><td>HT40116-500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Papanicolaou stain, Modified EA</td><td>Sigma</td><td>HT40232-1L</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L-3224</td><td>contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes</td></tr><tr><td>Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Culture Insert, 12&amp;nbsp;mm, hydrophilic PTFE, 0.4&amp;nbsp;&amp;micro;m</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM01250&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Glass Bottom Dishes</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr></tbody></table>

impression cytology of the lid wiper area

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.

plastik tutucu üzerine yayılmış hücre kültürü membran kapak silecek konjonktiva epitel hücrelerinin el toplanması için uygun bir araçtır. Bu yöntem genellikle hazırlamak ve IC membranlar işlemek için kullanılan ek sterilize aletler için gereğini ortadan kaldırır. 1 hücre kültürü eki kullanarak kapak silecek alanının IC tasvir Şekil. Biz yeni bir moda kapak silecek alanından epitel hücreleri karakterize etmek için birbirini...

Watch this Scientific Journal Video about Impression Cytology of the Lid Wiper Area at JoVE.com

Impression Cytology of the Lid Wiper Area

We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.

Kapak Silecek Area izlenim Sitoloji

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The ...

impression-cytology-of-the-lid-wiper-area

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K Görüntüleme.  University of Waterloo. We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort. 

Video: Impression Cytology of the Lid Wiper Area

Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of tissue samples from formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsies has become a key tool for understanding the complexity of tumor immunology and discovering novel predictive biomarkers for cancer immunotherapy. Immunoprofiling analysis of tissues requires the evaluation of combined markers, including inflammatory cell subpopulations and immune checkpoints, in the tumor microenvironment. The advent of novel multiplex immunohistochemical methods allows for a more efficient multiparametric analysis of single tissue sections than does standard monoplex immunohistochemistry (IHC). One commercially available multiplex immunofluorescence (IF) method is based on tyramide-signal amplification and, combined with multispectral microscopic analysis, allows for a better signal separation of diverse markers in tissue. This methodology is compatible with the use of unconjugated primary antibodies that have been optimized for standard IHC on FFPE tissue samples. Herein we describe in detail an automated protocol that allows multiplex IF labeling of carcinoma tissue samples with a six-marker multiplex antibody panel comprising PD-L1, PD-1, CD68, CD8, Ki-67, and AE1/AE3 cytokeratins with 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole as a nuclear cell counterstain. The multiplex panel protocol is optimized in an automated IHC stainer for a staining time that is shorter than that of the manual protocol and can be directly applied and adapted by any laboratory investigator for immuno-oncology studies on human FFPE tissue samples. Also described are several controls and tools, including a drop-control method for fine quality control of a new multiplex IF panel, that are useful for the optimization and validation of the technique.

A detailed protocol for a six-marker multiplex immunofluorescence panel is optimized and performed, using an automated stainer for more consistent results and a shorter procedure time. This approach can be directly adapted by any laboratory for immuno-oncology studies.

IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Continued developments in immuno-oncology require an increased understanding of the mechanisms of cancer immunology. The immunoprofiling analysis of ...

Kanser Araştırmaları

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Nörobilim

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. Choroid plexus epithelial cells (CPECs) covering the surface of choroid plexus tissue harbor multiple unique cilia, but most of the functions of these cilia remain to be investigated. To uncover the function of CPEC cilia with particular reference to their motility, an ex vivo observation system was developed to monitor ciliary motility during embryonic, perinatal and postnatal periods. The choroid plexus was dissected out of the brain ventricle and observed under a video-enhanced contrast microscope equipped with differential interference contrast optics. Under this condition, a simple and quantitative method was developed to analyze the motile profiles of CPEC cilia for several hours ex vivo. Next, the morphological changes of cilia during development were observed by scanning electron microscopy to elucidate the relationship between the morphological maturity of cilia and motility. Interestingly, this method could delineate changes in the number and length of cilia, which peaked at postnatal day (P) 2, while the beating frequency reached a maximum at P10, followed by abrupt cessation at P14. These techniques will enable elucidation of the functions of cilia in various tissues. While related techniques have been published in a previous report1, the current study focuses on detailed techniques to observe the motility and morphology of CPEC cilia ex vivo.

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

In this study, a detailed light microscopic technique was optimized for real-time observation and analysis of the motion of CPEC cilia ex vivo together with an electron microscopic method for ultrastructural analysis.

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like the craniofacial skeleton and the peripheral nervous system. While it is critical to understand NCC migration in the context of a 3D embryo, isolating migratory cells in 2D culture facilitates visualization and functional characterization, complementing embryonic studies. The present protocol demonstrates a method for isolating chick cranial neural folds to generate primary NCC cultures. Migratory NCCs emerge from neural fold explants plated onto a fibronectin-coated substrate. This results in dispersed, adherent NCC populations that can be assessed by staining and quantitative morphological analyses. This simplified culture approach is highly adaptable and can be combined with other techniques. For example, NCC emigration and migratory behaviors can be evaluated by time-lapse imaging or functionally queried by including inhibitors or experimental manipulations of gene expression (e.g., DNA, morpholino, or CRISPR electroporation). Because of its versatility, this method provides a powerful system for investigating cranial NCC development.

This versatile protocol describes the isolation of premigratory neural crest cells (NCCs) through the excision of cranial neural folds from chick embryos. Upon plating and incubation, migratory NCCs emerge from neural fold explants, allowing for assessment of cell morphology and migration in a simplified 2D environment.

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

Gelişim Biyolojisi

Oküler Yüzey Skuamöz Neoplazisinin Ön Segment HR-OCT ile Değerlendirilmesi

Anterior High-Resolution Optical Coherence Tomography in the Diagnosis and Therapeutic Monitoring of Ocular Surface Squamous Neoplasia

Ocular surface squamous neoplasia (OSSN) is the most common tumor of the ocular surface, ranging from mild dysplasia to invasive squamous carcinoma. Traditionally, the diagnosis of OSSN relies on histopathological confirmation followed by a full-thickness biopsy. However, in the past two decades, the therapeutic approach to OSSN has shifted from surgical intervention to topical chemotherapy regimens in clinical settings. This shift emphasizes the need for less invasive or non-invasive methods to diagnose ocular surface pathologies. Among various imaging devices, commercially available high-resolution optical coherence tomography (HR-OCT) has emerged as a powerful tool for the characterization of OSSN. HR-OCT provides an in vivo, cross-sectional view of ocular surface lesions, offering an "optical biopsy" for OSSN with high sensitivity and specificity. It provides valuable information in differentiating intraepithelial or invasive OSSN from other benign lesions. Additionally, HR-OCT can be used to monitor the response to topical chemotherapy and to detect subclinical OSSN during follow-up visits. In this article, the scanning protocol for image acquisition is presented, and image interpretation for OSSN is outlined. This standardized, practical, and reproducible approach is recommended in clinical workflows and is expected to assist clinicians in the management of OSSN.

Yazar Spotlight: Oküler Yüzey Skuamöz Neoplazisini Karakterize Etmek İçin Non-İnvaziv Bir Araç Olarak Anterior HR-OCT

Anterior segment high-resolution optical coherence tomography (HR-OCT) is a promising non-invasive modality for the diagnosis and therapeutic evaluation of ocular surface squamous neoplasia (OSSN). Here, the system setup, scanning technique, and representative diagnostic results are presented.

Oküler Yüzey Skuamöz Neoplazisinin Tanı ve Tedavi Amaçlı İzleminde Anterior Yüksek Çözünürlüklü Optik Koherens Tomografi

Ocular surface squamous neoplasia (OSSN) is the most common tumor of the ocular surface, ranging from mild dysplasia to invasive squamous carcinoma. ...

Mühendislik

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is that they may induce traumatic lesions on the surface of the eye, which can progress to scarring, eyelid deformity, limbal stem cell deficiency and in some cases, cause great discomfort to the subject. To avoid these clinical problems, impression cytology (IC) was developed to diagnose dry eye disease and later neoplasia, atopic disease, vernal keratoconjunctivitis and keratoconjunctivitis sicca. Typically, clinicians manually cut filter papers into required shapes and apply these to the ocular surface. Here, we describe how to perform IC using a commercially available medical device. This technique is explained here followed by immunophenotyping by flow cytometry. This technique requires less manual handling and causes less injury to the ocular surface.

The exposed normal ocular surface consists of cornea and conjunctiva. Epithelial cells, goblet cells and immune cells are present in the conjunctiva. Here, a non-invasive, technique of impression cytology is described using an impression cytology device and flow cytometry to analyze immune cells in the conjunctiva.

Conjunktiva&#39;dan Hücreleri İzole Etmek ve Fenotip Hedeflemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &ndash; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed due to challenges with different diagnostic modalities. Ciliary videomicroscopy, using Digital High-Speed Videomicroscopy (DHSV), one of the diagnostic tools for PCD, is considered the optimal method to perform ciliary functional analysis (CFA), comprising of ciliary beat frequency (CBF) and beat pattern (CBP) analysis. However, DHSV lacks standardized, published operating procedure for processing and analyzing samples. It also uses living respiratory epithelium, a significant infection control issue during the COVID-19 pandemic. To continue providing a diagnostic service during this health crisis, the ciliary videomicroscopy protocol has been adapted to include adequate infection control measures.
Here, we describe a revised protocol for sampling and laboratory processing of ciliated respiratory samples, highlighting adaptations made to comply with COVID-19 infection control measures. Representative results of CFA from nasal brushing samples obtained from 16 healthy subjects, processed and analyzed according to this protocol, are described. We also illustrate the importance of obtaining and processing optimal quality epithelial ciliated strips, as samples not meeting quality selection criteria do now allow for CFA, potentially decreasing the diagnostic reliability and the efficiency of this technique.

Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy &#8211; Adaptation for the COVID-19 Pandemic

To guarantee a successful and high-quality ciliary functional analysis for PCD diagnosis, a precise and careful method for respiratory epithelium sampling and processing is essential. To continue providing PCD diagnostic service during the COVID-19 pandemic, the ciliary videomicroscopy protocol has been updated to include appropriate infection control measures.

Dijital Yüksek Hızlı Siliyer Videomikroskopi Kullanarak Burun Fırçalama Örneklemesi ve İşleme – COVID-19 Pandemisine Adaptasyon

Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is a genetic motile ciliopathy, leading to significant otosinopulmonary disease. PCD diagnosis is often missed or delayed ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Kapak Silecek Area izlenim Sitoloji

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

Oküler Yüzey Skuamöz Neoplazisinin Tanı ve Tedavi Amaçlı İzleminde Anterior Yüksek Çözünürlüklü Optik Koherens Tomografi

Oküler Yüzey Skuamöz Neoplazisinin Tanı ve Tedavi Amaçlı İzleminde Anterior Yüksek Çözünürlüklü Optik Koherens Tomografi

Oküler Yüzey Skuamöz Neoplazisinin Tanı ve Tedavi Amaçlı İzleminde Anterior Yüksek Çözünürlüklü Optik Koherens Tomografi

Conjunktiva'dan Hücreleri İzole Etmek ve Fenotip Hedeflemek İçin İnvaziv Olmayan Bir Yöntem

Dijital Yüksek Hızlı Siliyer Videomikroskopi Kullanarak Burun Fırçalama Örneklemesi ve İşleme – COVID-19 Pandemisine Adaptasyon

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü