Biz mGFP fareler için S. Arber ve kağıt eleştirel okuma ve teknik yardım sağladı Zervas laboratuar üyelerine teşekkür ediyoruz. A. Brown Beyin Bilim Kaplan Yaz Lisansüstü Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir. E. Normand Beyin Lisans Programı Lisansüstü Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir. Bu araştırma aynı zamanda başlangıç ​​araştırma fonları (MZ) tarafından finanse edildi.

Tamoksifen hazırlanması ve ağızdan sonda Prosedürü (E8.5) <ul><li> Önceden ısıtılmış mısır yağı tamoksifen eriterek tamoksifen bir 20 mg / ml stok solüsyonu hazırlayın. </li><li> 37 ° çözüm inkübe ° C nutator ve aralıklı olarak vorteks üzerinde 2 saat. </li><li> 4 ışık, mağaza ° C tamoksifen stok koruyun ve bir aya kadar kullanabilirsiniz. </li><li> Bir genin özel CreER T alleli ve bir muhabir aleli taşıyan bir erkek; kaderi haritalama deneyler için, Swiss Webster kadın (Taconic satın wild tip) oluşan bir üreme çifti kurmak. MGFP erkek (Ellisor 2009); gösteri amaçlı Wnt1-CreER T kullanıyorsanız. </li><li> İsviçre Webster kadın, vajinal bir fiş görünüm için her sabah kontrol edin. Vajinal fiş 0.5 gün sonrası cinsel birleşmede olarak görülüyor günün sabahı (0900) belirleyin ve bu başlangıç ​​noktasına göre tamoksifen tarihini hesaplamak. (Bu deneme için, kullanılan embriyonik gün 8,5). </li><li> Tamoksifen stok solüsyonu (4 mg tamoksifen) 200 ul yukarı çekmek için bir hayvan besleme iğne (20G x 1-1/2) ile 1 ml şırınga kullanın. </li><li> Boynun ense tutarak sıkıca zaman hamile Swiss Webster kadın dizginlemek ve başın arka tarafında hareketsiz ve ventral yüzü yukarı bakacak şekilde ters çevirin. </li><li> Vücudu düz bir çizgide tutmak için ücretsiz parmaklar arasında kuyruk tutun. </li><li> Beslenme iğne ağız köşeye yerleştirin ve yavaşça ağız çatı boyunca iğne kılavuzu. </li><li> Vücuda paralel olacak şekilde aynı anda baş eğerek geri boynun düz tutmak için ise, iğne döndürün. </li><li> Mide doğru, yemek borusu aşağı iğne Kılavuzu. Trakea girmek için dikkatli olun. Iğne, hayvan öğürme refleksi yürütmektedir veya fare mücadeleleri ise, iğneyi hemen çıkarın ve sonda tekrar deneyin direnç varsa. </li><li> Besleme iğne midede sonra mideye tamoksifen yönetmek ve diseksiyon tarihe kadar kadın evine kafesine geri dönmek. </li></ul> Kraniotomi: <ul><li> Intrakardiyak yetişkin kaderi% 4 PFA eşlenen fare serpmek ve omuzlar üzerinde omuriliğe ile kesme makası ile baş kaldırmak. </li><li> Kesilmiş ve kafa derisi ile kafatası açığa çıkarmak için kafa (kaudal için rostral) dorsal orta hat boyunca bir neşter çalıştırın. </li><li> Neşter kullanarak, kafatası yan ve arka boyunca herhangi bir aşırı doku veya kas kazınması gerekir. </li><li> Ponksiyon forseps, sadece koku ampuller rostral ve ince makas ipuçları karşılamak için küçük bir delik oluşturmak orta hatta kafatası. </li><li> Ince makas, bu deliğin içine yerleştirin ve yaklaşık uzunluğu koku ampuller lateral medial bir kesi yapmak. Bu kesim, burun kemik ve frontal kemik kesiştiği kafatası kırmak ve makas için iyi erişim sağlayacak. </li><li> Altta yatan doku zarar görmesini önlemek için, beyin uzak açılı makas ipuçları tutmak için emin olun kafatası (dorsal orta hat) sagital sütür boyunca kesin. </li><li> Beyin yavaşça ortaya çıkarmak için medial insizyon boyunca kemik forseps ve uzakta kabuğu kafatasını kavramak. Kafatası, küçük parçalar halinde kapalı çip ya da daha büyük bölümlerde uzak kırılabilir. Frontal, parietal interparietal ve oksipital kemiklerin tümünü kaldırmak için forseps kullanarak devam edin. </li><li> Paraflocculi (beyincik seviyesinde beynin lateral kenarlarında bulunan) her iki tarafta küresel kemikleri kısma encasing kemikleri Crack. Kemikler yavaşça çekin. </li><li> Baş baş aşağı çevirin (dorsal yüzü aşağı) ve kraniyal sinirlerin sever ve kafatası beyin çıkarmak için forseps kullanabilir. </li></ul> Tüm Mount Mikroskopi: Yetişkin Beyin <ul><li> GFP işaretlemesi yetişkin beyin floresan diseksiyon kapsamı kullanarak değerlendirin. </li><li> PBS ve diğer uygun yazılım kullanarak PictureFrame veya fotoğraf içeren bir Petri çanak beyin aktarın. </li></ul> Tüm Mount Mikroskopi: E12.5 Embriyolar <ul><li> GFP işaretlemesi için tüm montaj embriyolar floresan diseksiyon kapsamı kullanarak değerlendirin. </li><li> PBS ve diğer uygun yazılım kullanarak PictureFrame veya fotoğraf içeren bir Petri kabı bütün montaj pozitif GFP bu aktarın. </li><li> Forseps kullanımı, her embriyo küçük bir parça kuyruk çimdik PCR tüp içinde her parçanın yeri ve genotip tüm montaj analizi ile görülen sonuçları doğrulamak için, her iki allel için PCR (Ellisor 2009) kullanarak doku. </li></ul> Mikro-disseksiyon ve eksplant hazırlama E12.5 embriyolar ventral mezensefalon <ul><li> Diseksiyonu takiben rahim zinciri ve idbütün montaj floresan, buz gibi bir hücre kültürü çanak steril PBS transfer embriyolar kader eşlemeli embriyoların entification. </li><li> Rhombomere 1 kaudal enine kesme embriyonun baş kısmı, ince makas kullanarak, çıkarın. </li><li> Sonra, diensefalon aracılığıyla koronal kesilmiş baş rostral bölümü çıkarın. Bu bir tüp benzeri yapı mezensefalik vezikül dorsal ve ventral dokular arasında bir kanal ile 4. ventrikül gösterecektir </li><li> Makas ipuçlarını dikkatli bir şekilde, dorsal orta hat boyunca rostral için kaudal 4. ventrikül ve snip, tam bir &quot;açık-kitap&quot; hazırlanması oluştururken, tüp açma takın. Mezensefalon iki dorsal yarısı yanal bulunacağı ventral mezensefalon mediale maruz olacaktır. </li><li> Ventral doku için daha kesin bir dille yatıyordu mezensefalon altında kalan non-nöral doku çıkarın. Eğer gerekirse, eksplant dorsal &quot;kanatlarını&quot; de düz koymak olacağını rostral ve kaudal yönleriyle çentikler olun. Eksplant &quot;dorsal mezensefalon kanatları temsil eden bir kelebek, ve rhombomere 1 kuyruk benzer. </li><li> Ventral mezensefalon FACS analiz veya hücre kültürü deneyleri için daha fazla izole etmek için, doku lateral (dorsal) çıkarın. </li></ul> Temsilcisi Sonuçlar: Bu GIFM deneyde, Wnt1-ifade hücreleri kalıcı ve heritably E8.5 Wnt1-CreERT tamoksifen idare tarafından embriyogenez sırasında belirgin mGFP embriyolar. Daha sonra bu işaretlenmiş hücreler hücreleri sinir yapılarının gelişme karşısında nasıl katkıda Wnt1-kökenli belirlemek için tüm montaj floresan ve bölüm immünhistokimya ile görüntülendi. Tüm montaj floresan mGFP muhabiri membran bağlı GFP bileşeni dayanmaktadır ve bu nedenle hücresel bilgilerin yanı sıra, Wnt1-kaynaklı nöral projeksiyonlar görüşünü sağlar . Örneğin, öncelikle, orta beyin, arka arka beyin ve omurilik (Şekil 1A) E12.5 sergi GFP floresan E8.5, Wnt1 CreERTmGFP embriyolar tamoksifen . Yüksek büyütmede, ince nöronal projeksiyonları, orta beyin, vücut duvar, kol, bacak ve kraniyofasiyal bölge innerve görülür. Bu gelişimsel aşamada, embriyo şeffaf ve iç GFP etiketleme kolayca ayırt edilir. Ancak, beyin geliştikçe, olgun doku yoğunluğu iç beyin yapıları kaynaklanan GFP floresan gizler. Bu nedenle, E8.5 tamoksifen, sadece küçük GFP etiketleme tüm montaj floresans (Şekil 1C, içerlek) yetişkin üstün colliculi görülmektedir. Buna ek olarak, bazı aksonal projeksiyonlar Beyin ventral yüzeyi boyunca akan (gösterilmemiştir) görülmektedir. Buna karşılık, tamoxifen E9.5 verildiğinde, önemli GFP etiketleme tüm inferior colliculi (Şekil 1B, içerlek) boyunca oluşur. Bütün montaj floresan Bu artış gösterebilir Wnt1 ifade E9.5 az hücreler dorsal orta beyin yüzeysel bölgelere daha E8.5 gelen Wnt1 ifade hücrelerden daha önemli ölçüde katkıda bulunan veya bu bölgede daha fazla süreçleri uzatmak . Ne olursa olsun, tüm montaj floresan bu fark gelişimi sırasında Wnt1 ifade dinamik doğasını yansıtır ve GIFM olgun yetişkin içine embriyo farklı hücre popülasyonlarının izlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyor. Wnt1-CreERT immünohistokimya, kader eşlenen doku kesitlerinde; mGFP hayvanlar hücresel düzeyde analiz edilmektedir. GFP ve β-galaktosidaz (β-gal) karşı antikorlar, sinir yapıları ve hücre tipleri Wnt1 soy ince çaplı hücresel katkısını belirlemek için çeşitli doku spesifik biyobelirteçleri bir ile birlikte kullanılır . E12.5 az E8.5 tamoksifen ve doku analizleri ile çift pozitif hücrelerin (GFP + ve β-gal +), ventral orta beyin (Şekil 1B) dolaşmakta projeksiyonları ile orta beyin ve arka boyunca gözlenir. E8.5 işaretlenmiş Wnt1 soy yetişkin beyin superior ve inferior colliculi yanı sıra, ventral tegmental alan ve substantia nigra (Şekil 1D) dopaminerjik hücre popülasyonlarının çevresinde (bkz. dahil olmak üzere pek çok orta beyin yapıları doğurur 2004) Zervas. Buna karşılık, E9.5 işaretlenmiş Wnt1 soy aşağı colliculi dopaminerjik hücre popülasyonlarının (Şekil 1F) çevresinde nöronların yanı sıra yol açmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/1687/1687fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 Wnt1-kaderi haritalama Temsilcisi Sonuçları: Wnt1-CreERT tüm montaj ve immünhistokimya sonuçları Örnekler; mGFP embriyo ve yetişkin beyinlerini kaderi E8.5 (AD) eşlenen (işaretli)E9.5 (EF). A. Wnt 1-CreER, öncelikle orta beyin E12.5 sergi GFP floresan (Mb), arka arka beyin (Hb) ve spinal kord (Sp) mGFP embriyolar. B. İşaretli hücreleri görüntülendi ve bu 1 mikron kalınlığında optik bölümü (40x amacı, z-serisi satın alma) gösterildiği gibi immünohistokimya ile hücresel düzeyde analiz. Nükleer β-galaktosidaz (nβ galon) antikor etiketleme (kırmızı) ve GFP antikor etiketleme (yeşil), ventral orta beyindeki gösterilen kaderi eşleşmiş hücrelere gösterir. Burada yeniden birleştirilmesi, hücreleri koşullu mGFP muhabiri doğası nedeniyle (nβ-gal + / GFP +) çift pozitif. C. Tüm montaj floresans mikroskopisi yetişkin üstün colliculi (SC) (inset) soluk GFP floresan ortaya koymaktadır. (C) düşük büyütme yetişkin bölümlerde E8.5 işaretlenmiş Wnt1 soy Değerlendirilmesi (5X) mikroskopi Wnt1 soyu (SC), üstün ve aşağı (IC) colliculi de dahil olmak üzere orta beyin yapıları sebebiyet verdiğini ortaya koymaktadır. D. A nβ-gal + hücreleri ve zengin bir GFP + aksonal pleksus dopaminerjik nöronların çevresinde ventral orta beyin alınan 40x, 1 mm optik bölüm. E. kolayca bütün montaj floresan (inset) tarafından Ortabeyin inferior colliculus gözlenen önemli GFP etiketleme E9.5 sonuçları Markalama. Düşük büyütme (5X) mikroskobu (E) görüldüğü gibi yetişkin bölümler (β-gal +, kırmızı) E9.5 işaretlenmiş Wnt1 soy inferior colliculus (dorsal-arka orta beyin) yoğunlaşmıştır. F. A nβ-gal + hücreleri ve zengin bir GFP + aksonal pleksus dopaminerjik nöronların çevresinde ventral orta beyin alınan 40x, 1 mm optik bölüm. E8.5 karşı E9.5 işaretlenmiş Wnt1-türevli nöronlar ventral orta beyin katkıda Wnt1 soy devam ederken, kademeli olarak, dorsal orta beyin katkıda sınırlı .

<ol>
	<li>Ellisor, D., Koveal, D., Hagan, N., Brown, A., Zervas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+conditional+reporter+alleles+in+the+developing+embryo+and+embryonic+nervous+system.">Comparative analysis of conditional reporter alleles in the developing embryo and embryonic nervous system.</a> Gene Expr Patterns. 9, 475-489 (2009).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li></ol>

Tüm yazarlar eşit olarak bu çalışmaya katkıda bulundu ve alfabetik olarak sıralanmıştır. Veya video makalede onun katılımı ile her bireyin katkısı açıktır.

Olduklarını ortaya koyduk GIFM sistemi geniş bir yelpazede hücresel süreçlerin çeşitli soruları cevaplamak için kullanılacak. Örneğin, farklı Cre sürücüleri ile mühendislik fareler, herhangi bir hücre tipi, doku veya ilgi genetik soy hedef kullanılabilir. Buna ek olarak, tamoksifen embriyonik ya da doğum sonrası herhangi bir zaman noktasında idare olabilir, çünkü, rekombinasyon, ilgili herhangi bir gelişme aşamasına hedef olabilir. Bu sistemin mekansal ve zamansal kontrol belirli genleri ifa...

a practical approach to genetic inducible fate mapping: a visual guide to mark and track cells in vivo

Kader haritalar atalarıdır, gelişmekte olan ve yetişkin doku özel yapılar ve hücre tiplerinin nasıl katkıda belirlemek için, in vivo hücre işaretleme ve izleme tarafından üretilir. Bu kavramı bir ilerleme genetik soy dayalı kaderi haritaları oluşturmak için, F, M aritalandırma (GIFM) gen ekspresyonu, hücre kaderi, ve in vivo hücre davranışları birbirine bağlayan yedik nducible, G enetic. GIFM patlatır X-CreER hatları burada X, değiştirilmiş bir bakteriyofaj protein, Cre recombinase (CreER T) mekansal ifade bahşeder gen ya da gen düzenleyici elemanlar bir set. CreER T, T CreER kılan bir değiştirilmiş bir e strogen r eceptor ligand bağlayıcı etki alanı içeren ilaç tamoksifen yokluğunda sitoplazma saklamış. LoxP siteleri tarafından çevrili DNA dizilimleri arasındaki çekirdek ve aracılık rekombinasyon translocates tamoksifen bültenleri CreER T, bağlayıcı değildir. LoxP bir muhabir gibi GFP geninin önceki kaset Dur çevrili arasında GIFM, rekombinasyon genellikle oluşur. Fare, bir bölge veya hücre tipine özgü CreER ve koşullu bir muhabir aleli içeren cins vardır . Muhabir Durdur kaset muhabir gen transkripsiyonu önler, çünkü tedavi görmeyen farelere işaretleme olmayacaktır. CreER T serbest bırakılması ve muhabir Durdur kaset çıkarmadan çekirdeğine sonraki translokasyon zamansal kontrolü sağlar zamanlı hamile kadın, ağızdan sonda ile tamoksifen yönetmek. Rekombinasyon sonra, muhabir allel yapısal ve heritably ifade. Bu olaylar dizisi, bu tür hücrelerin genetik geçmişi silinmez kayıtlı olduğunu işaret ediyor. Recombined muhabiri, böylece, bir kez, başlangıçta CreER T sürmek için kullanılan gen ekspresyonu çözüldükten bir yüksek sadakat genetik soy tracer olarak hizmet vermektedir. Biz genetik soy, yetişkin hücre tipleri ve dokuların normal gelişimini ve katkısını tespit çalışma fare GIFM geçerlidir. Ayrıca hücreleri mutant genetik kökenden insan genetik bozukluklar göze çarpan özellikleri taklit karmaşık fenotipleri daha iyi anlamak için takip etmek GIFM kullanabilirsiniz. Deneysel yöntemlerle kılavuzları Bu video makalede araştırmacılar başarıyla GIFM uygulamak için. Biz iyi karakterize Wnt1-CreER T yöntemi kullanarak göstermek; E12.5 diseksiyon ve Epifloresans stereomicroscopy analiz ağızdan sonda ile embriyonik gün (E) 8.5 tamoksifen idare tarafından mGFP fareler. Ayrıca eksplant hazırlama veya FACS analiz kaderi eşlenen etki alanı mikro-incelemek ve tüm montaj floresan görüntüleme için yetişkin kader eşlenen beyinleri teşrih nasıl göstermektedir. Toplu olarak, bu işlemler, araştırmacılar, gelişim biyolojisi ve hastalık modelleri kritik soruları yanıtlamak için izin verir.

Watch this Scientific Journal Video about A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo at JoVE.com

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama (GIFM) işaretleri ve ince, mekansal ve zamansal kontrolü ile parça hücreleri<em&gt; In vivo</em&gt; Ve belirli bir genetik soy hücreleri, gelişmekte olan ve yetişkin dokularda katkıda bulunmak nasıl izah etmektedir. Epifluorescent ve eksplant analizi için kader haritası E12.5 fare embriyoları için gerekli teknikleri burada gösterdi.

Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama Pratik Bir Yaklaşım: Hücreler Mark ve Track Görsel Bir Rehberi In Vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

a-practical-approach-to-genetic-inducible-fate-mapping-visual-guide

Research

JoVE Journal

Biology

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

16.7K Görüntüleme.  Brown University. Genetik Đndüklenebilir Kader Haritalama (GIFM) işaretleri ve ince, mekansal ve zamansal kontrolü ile parça hücreleri In vivo Ve belirli bir genetik soy hücreleri, gelişmekte olan ve yetişkin dokularda katkıda bulunmak nasıl izah etmektedir. Epifluorescent ve eksplant analizi için kader haritası E12.5 fare embriyoları için gerekli teknikleri burada gösterdi.

Video: A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Biyoloji

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Also, the recent deluge of research on the neurophysiology and neurobehavioral genetics of olfaction in Drosophila has motivated ever more technically sophisticated and quantitative behavioral assays. Here, we modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. A fly is glued to a small steel pin and suspended in a magnetic field that enables it to yaw freely. Small diameter food odor plumes are directed downward over the fly s head, eliciting stable tracking by a hungry fly. Here we focus on the critical mechanics of tethering, aligning the magnets, devising the odor plume, and confirming stable odor tracking.

Here we describe how to tether a fly in an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We describe how to align the rare-earth magnets and odor ports, and how to set mass flow rates for both the stimulus delivery and vacuum suction to achieve optimal odor tracking.

Drosophila Görsel ve Koku aracılığı ile Uçuş Kontrol Araştırma Manyetik Tether Sistemi

It has been clear for many years that insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals track odors carried in the wind. ...

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In the zebrafish model, effective reverse genetic techniques have been developed using microinjection of gene-specific antisense morpholinos. Morpholinos target an mRNA through specific base-pairing and block gene function transiently by inhibiting translation or splicing for several days during embryogenesis (knockdown). However, in vertebrates such as mouse or zebrafish, some gene functions can be obscured by these approaches due to the presence of another gene that compensates for the loss. This is especially true for gene families containing sister genes that are co-expressed in the same developing tissues. In zebrafish, functional compensation can be tested in a relatively high-throughput manner, by co-injection of morpholinos that target knockdown of both genes simultaneously. Likewise, using morpholinos, a genetic interaction between any two genes can be demonstrated by knockdown of both genes together at sub-threshold levels. For example, morpholinos can be titrated such that neither individual knockdown generates a phenotype. If, under these conditions, co-injection of both morpholinos causes a phenotype, a genetic interaction is shown. Here we demonstrate how to show functional redundancy in the context of two related GATA transcription factors. GATA factors are essential for specification of cardiac progenitors, but this is revealed only by the loss of both Gata5 and Gata6. We show how to carry out microinjection experiments, validate the morpholinos, and evaluate the compensated phenotype for cardiogenesis.

Gene function can be obscured in loss-of-function experiments if there is compensation by another gene. The zebrafish model provides a relatively high-throughput means to reveal such functional redundancy in living embryos.

Embriyo sırasında Fonksiyonel Artıklık Test Ters Genetik Yaklaşım

Gene function during embryogenesis is typically defined by loss-of-function experiments, for example by targeted mutagenesis (knockout) in the mouse. In ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

Nonexperts için Phylogenetics İçin Pratik Kılavuz

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...