Birçok koordinasyon örneğine rağmen, çoğu çalışma aktin veya mikrotübül proteinlerini ayrı ayrı inceler. Bu yöntem, her iki dinamik polimerin tek bir reaksiyonda görselleştirilmesine izin verir. Bu teknik, kullanıcının sadece aktin ve mikrotübüllerin dinamik versiyonlarında görülebilen ortaya çıkan özellikler için çeşitli düzenleyici proteinleri değerlendirmesini sağlar.
Bu teknik, sentetik bir hücre oluşturmaya yaklaşmak için lipitleri veya ekstraktları içerecek şekilde genişletilebilir. PEG-Silan ve Biotin-PEG-Silan tozlarının alikotlarını çözerek ve mililitre mPEG-Silan başına 10 miligram ve mililitre Biotin-PEG-Silane başına iki ila dört miligram kaplama stok çözeltileri üretmek için PEG tozlarını% 80 etanol içinde çözerek başlayın. Forseps kullanarak temiz kapak kaymasını etanol deposundan çıkarın.
Azot gazı ile kurutun ve temiz bir Petri kabında saklayın. Kapak kaymalarını 100 mikrolitre kaplama çözeltisi ile kaplayın ve en az 18 saat veya kullanıma kadar 70 santigrat derecede inkübe edin. 12 şerit çift sırtlı çift taraflı bandı 24 milimetre uzunluğa kadar kesin.
Bant desteğinin bir tarafını çıkarın ve temiz bir görüntüleme odasında bulunan altı oluğa bitişik bant parçalarını sabitleyin. Bandın yapışkan tarafını her bir oda oluğu boyunca ortaya çıkarmak için ikinci bant desteğini çıkarın ve oda bandı tarafını temiz bir yüzeye yerleştirin. Epoksi reçine ve sertleştirici çözeltilerini küçük bir tartım teknesinde bire bir karıştırın ve her görüntüleme odası oluğunun sonundaki bant şeritleri arasına bir damla karışık epoksi yerleştirmek için bir P1000 ucu kullanın.
Ardından, hazne, bant veya epoksi tarafı yukarıya, temiz bir yüzeye yerleştirin. Kaplamalı bir kapak kaymasını 70 santigrat derece inkübatörden çıkarın ve kapak kaymalarının kaplanmış ve kaplanmamış yüzeylerini altı kez çift damıtılmış suyla durulayın. Filtrelenmiş azot gazı ile kurutun ve ardından kapak kayma kaplama tarafı banda doğru olacak şekilde görüntüleme odasına yapıştırın.
Bant ile kapak kayması arasında iyi bir sızdırmazlık sağlamak amacıyla bantlı cam arabirime basınç uygulamak için bir P200 veya P1000 pipet ucu kullanın. Epoksinin kullanımdan önce oda kuyularını tamamen kapatmasına izin vermek için monte edilmiş odaları oda sıcaklığında en az beş ila 10 dakika boyunca inkübe edin. Perfüzyon odalarının süresi montajdan sonraki 12 ila 18 saat içinde dolar.
Bir perfüzyon pompası kullanın ve görüntüleme odasını hazırlamak için 50 mikrolitre %1 BSA akıtılarak perfüzyon odasında koşullandırma çözeltilerini sırayla değiştirin. Fazla tamponu cazibe kilidi bağlantı haznesinden çıkarın. Daha sonra, mililitre streptavidin başına 50 mikrolitre 0.005 miligram akıtın ve oda sıcaklığında bir ila iki dakika inkübe edin.
Fazla tamponu rezervuardan çıkarın. Spesifik olmayan bağlanmayı engellemek ve 10 ila 30 saniye boyunca inkübe etmek için 50 mikrolitre% 1 BSA akışı sağlayın. Fazla tamponu rezervuardan çıkarın.
Daha sonra, 50 mikrolitre ılık 1x TIRF tamponu ve daha sonra 1x TIRF tamponunda seyreltilmiş 50 mikrolitre stabilize ve% 50 biyotinile mikrotübül tohumu akıtın. İlk biyokimyasal reaksiyonu görüntülemeden önce 30 dakika boyunca 35 ila 37 santigrat derece sıcaklığı korumak için sahne veya objektif ısıtıcı cihazı ayarlayın. Ardından, edinme aralığını 15 ila 20 dakika boyunca her beş saniyede bir olacak şekilde ayarlayın.
Daha sonra, 488 ve 647 lazer maruziyetini% 5 ila% 10 güçte 50 ila 100 milisaniyeye ayarlayın, önce polimerizasyon reaksiyonunu aktin filament tertibatını başlatacak şekilde ayarlayın. Görüntüleri 647 nanometrede elde edin ve uygun ayarlamaları yapın. Daha sonra, mikrotübül düzeneğini başlatmak için polimerizasyon reaksiyonunu ikinci bir şartlandırılmış perfüzyon kuyusunda ayarlayın.
488 nanometrede görselleştirin ve uygun ayarlamaları yapın. Üç mikrolitre 10 mikromolar 488 tübülin, kullanımdan en fazla 15 dakika önce 100 mikromolar floresan olarak etiketlenmemiş tübülinin 7.2 mikrolitre alikotu ile birleştirin. Daha sonra, üç mikrolitre seyreltilmiş biyotin ile ilgili aktini, uygun hacimlerde floresan olarak etiketlenmemiş ve etiketlenmiş aktin içinde birleştirin, böylece nihai karışım% 10 ila% 30 floresan etiketli 12.5 mikromolar toplam aktin olacaktır.
12.5 mikromolar aktin karışımı stoğunun iki mikrolitresini, görüntülemeden en fazla 15 dakika önce tübülin stok karışımıyla birleştirerek sitoiskelet karışımını hazırlayın. Kullanana kadar buz üzerinde saklayın. 2x TIRF tamponu, anti ağartıcı, nükleotidler, tamponlar ve aksesuar proteinler dahil olmak üzere diğer tüm deneysel bileşenleri ve proteinleri birleştirerek protein reaksiyon karışımını hazırlayın.
Hücre iskeleti karışımını ve protein reaksiyon karışımını 30 ila 60 saniye boyunca 37 santigrat derecede ayrı ayrı inkübe edin. Reaksiyonu başlatmak için, protein reaksiyon karışımının içeriğini sitoiskelet karışımına ekleyin ve karıştırın. 15 mikromolar serbest tübülin, bir milimolar GTP, 0.5 mikromolar aktin monomerleri ve uygun hacimlerde tampon kontrolleri ile desteklenmiş 1x TIRF tamponu içeren reaksiyon karışımının 50 mikrolitresini perfüzyon odasına aktarın.
15 ila 20 dakika boyunca her beş saniyede bir elde etmek için mikroskop yazılımını kullanarak bir hızlandırılmış film kaydedin. Yeni bir perfüzyonu iyice koşullandırın ve tampon hacmini ilgilenilen düzenleyici protein ve tampon kontrolleri ile değiştirin. Acil aktin mikrotübül fonksiyonları için düzenleyici proteinleri değerlendirmek için edin.
Bu görüntülerde mikrotübüllerin ve aktin filament dinamiklerinin örnek ölçümleri gösterilmiştir. Tübülin kanalının ortalama zaman projeksiyonu, Kymograph grafiklerini oluşturmak için kullanılan çizgi taramaları için toplam mikrotübül uzunluklarını verimli bir şekilde görselleştirir. Siyah noktalı çizgiler, dinamik mikrotübüllerin iki örnek Kymograph'ına karşılık gelir.
Mikrotübüllerin büyüme ve sökme aşamaları her Kymograph'ta gösterilmiştir. Burada aktif olarak polimerize olan tek aktin filamentlerini gösteren iki örnek hızlandırılmış görüntü montajı gösterilmektedir. Uzama oranları, mikromolar aktin başına zaman içinde aktin filamentlerinin uzunluğunun grafiklerinin eğimi olarak hesaplanır.
Bu nedenle, tipik olarak bir mikromolar aktin konsantrasyonunda belirlenen oranları karşılaştırmak için 0.5 mikromolar aktin reaksiyonlarına iki düzeltme faktörü uygulanmalıdır. Beş filamentten örnekler burada gösterilmiştir. 250 nanomolar Tau'nun yokluğunda veya varlığında polimerize olan aktin filamentlerindeki dinamik mikrotübüllerin toplam iç yansıma floresansı veya TIRF görüntüleri burada gösterilmiştir.
Mavi noktalı çizgiler ve oklar işareti aşınır ve her koşula karşılık gelen çizgi tarama grafikleri için bir çizgi çizilir. Aktin bölgelerindeki mikrotübüller arasındaki örtüşme, alan başına belirli bir zaman noktasında puanlanabilir. Sitoiskelet proteinleri, özellikle aktin, mikrotübüller ve düzenleyicileri donma / çözülme döngülerine karşı çok hassastır.
Tutarlılık ve başarı için, son derece saf ve uygun şekilde depolanmış proteinler kullanın.
