조정의 많은 예에도 불구하고, 대부분의 연구는 액틴 또는 미세 소관 단백질을 개별적으로 검사합니다. 이 방법은 단일 반응에서 두 동적 중합체의 시각화를 허용합니다. 이 기술을 통해 사용자는 액틴 및 미세 소관의 동적 버전에서만 볼 수있는 창발적 특성에 대한 다양한 조절 단백질을 평가할 수 있습니다.
이 기술은 합성 세포를 구축하는 데 더 가까워지도록 지질 또는 추출물을 포함하도록 확장될 수 있다. 먼저 PEG-실란 및 비오틴-PEG-실란 분말의 분취량을 해동하고, PEG 분말을 80% 에탄올에 용해시켜 밀리리터 당 10밀리그램의 mPEG-실란 및 밀리리터당 두 내지 네 밀리그램의 비오틴-PEG-실란의 코팅 스톡 용액을 생성한다. 포셉을 사용하여 에탄올 저장고에서 깨끗한 커버 슬립을 제거하십시오.
질소 가스로 건조시키고 깨끗한 페트리 접시에 보관하십시오. 커버 슬립을 100 마이크로리터의 코팅 용액으로 코팅하고 적어도 18시간 동안 또는 사용 전까지 섭씨 70도에서 배양합니다. 양면 테이프 12 스트립을 24mm 길이로 자릅니다.
테이프 백킹의 한쪽면을 제거하고 깨끗한 이미징 챔버에있는 여섯 개의 홈에 인접한 테이프 조각을 고정하십시오. 테이프 백킹의 두 번째 조각을 제거하여 각 챔버 홈을 따라 테이프의 끈적끈적한 면을 노출시키고 챔버 테이프 측면을 깨끗한 표면에 위로 놓습니다. 작은 계량 보트에 에폭시 수지와 경화제 용액을 일대일로 혼합하고 P1000 팁을 사용하여 각 이미징 챔버 홈의 끝에 테이프 스트립 사이에 혼합 에폭시 방울을 놓습니다.
그런 다음 챔버, 테이프 또는 에폭시 측면을 위로 올려 깨끗한 표면에 놓습니다. 코팅된 커버 슬립을 섭씨 70도 인큐베이터에서 제거하고 커버 슬립의 코팅 및 코팅되지 않은 표면을 이중 증류수로 여섯 번 헹구십시오. 여과 된 질소 가스로 건조 한 다음 커버 슬립 코팅면을 테이프쪽으로 이미징 챔버에 부착하십시오.
P200 또는 P1000 피펫 팁을 사용하여 테이핑 유리 인터페이스에 압력을 가하여 테이프와 커버 슬립 사이에 양호한 씰을 보장합니다. 조립된 챔버를 실온에서 적어도 다섯 내지 10분 동안 인큐베이션하여 에폭시가 사용 전에 챔버 웰을 완전히 밀봉할 수 있도록 한다. 관류 챔버는 조립 후 12 ~ 18 시간 이내에 만료됩니다.
관류 펌프를 사용하고 1%BSA의 50 마이크로리터를 흘려서 관류 챔버 내의 컨디셔닝 용액을 순차적으로 교환하여 이미징 챔버를 프라이밍한다. 루어 잠금 피팅 저장소에서 과도한 버퍼를 제거합니다. 이어서, 밀리리터 당 0.005 밀리그램의 50 마이크로리터의 스트렙타비딘을 유동시키고, 실온에서 하나 내지 두 분 동안 인큐베이션한다.
저장소에서 과도한 버퍼를 제거하십시오. 50 마이크로리터의 1%BSA를 유동시켜 비특이적 결합을 차단하고 10 내지 30초 동안 인큐베이션한다. 저장소에서 과도한 버퍼를 제거하십시오.
다음에, 50 마이크로리터의 따뜻한 1x TIRF 완충액을 유동시킨 다음, 1x TIRF 완충액에 희석된 50 마이크로리터의 안정화 및 50% 비오티닐화 미세소관 종자를 흘려라. 첫 번째 생화학적 반응을 영상화하기 전에 30분 동안 섭씨 35 내지 37도의 온도를 유지하도록 스테이지 또는 대물 히터 장치를 설정한다. 그런 다음, 획득 간격을 15~20분 동안 5초마다 설정한다.
다음으로, 488 및 647 레이저 노출을 5% 내지 10% 전력에서 50 내지 100 밀리초로 설정하고, 먼저 중합 반응을 조정하여 액틴 필라멘트 어셈블리를 개시한다. 647 나노미터에서 이미지를 획득하고 적절한 조정을 수행합니다. 이어서, 중합 반응을 초컨디셔닝 관류 웰로 조정하여 미세소관 조립을 개시한다.
488나노미터로 시각화하고 적절한 조정을 수행합니다. 10 마이크로몰 488 튜불린의 3 마이크로리터를 사용 전 15분 이내에 형광으로 표지되지 않은 튜불린인 100 마이크로몰의 7.2 마이크로리터 분취량과 결합한다. 이어서, 희석된 비오틴 관련 액틴 3 마이크로리터를 형광적으로 표지되지 않은 적절한 부피의 액틴과 표지된 액틴에 조합하여, 최종 혼합이 10% 내지 30%형광 표지와 함께 12.5 마이크로몰 총 액틴이 되도록 한다.
12.5 마이크로몰 액틴 믹스 스톡의 두 마이크로리터를 이미징 15분 전에 튜불린 스톡 믹스와 조합함으로써 세포골격 믹스를 제조하였다. 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 2x TIRF 완충액, 항표백제, 뉴클레오티드, 완충제 및 부속 단백질을 포함한 다른 모든 실험 성분과 단백질을 조합하여 단백질 반응 믹스를 준비한다.
세포골격 믹스와 단백질 반응 믹스를 별도로 섭씨 37도에서 30 내지 60초 동안 인큐베이션한다. 반응을 개시하기 위해 단백질 반응 믹스의 내용물을 세포골격 믹스에 첨가하고 이를 혼합한다. 15 마이크로몰 유리 튜불린, 1 밀리몰 GTP, 0.5 마이크로몰 액틴 단량체, 및 적절한 부피의 완충액 제어로 보충된 1x TIRF 완충액을 함유하는 반응 믹스의 50 마이크로리터를 관류 챔버로 유동시킨다.
현미경 소프트웨어를 사용하여 타임랩스 동영상을 녹화하여 15~20분 동안 5초마다 획득합니다. 새로운 관류 우물을 조건화하고 완충액 부피를 관심있는 조절 단백질 및 완충액 조절로 대체한다. 액틴 미세소관 기능에 대한 조절 단백질을 평가하기 위해 획득한다.
미세소관 및 액틴 필라멘트 역학의 예시적인 측정치가 이들 이미지에 도시되어 있다. 튜불린 채널의 평균 시간 투영은 Kymograph 플롯을 생성하는 데 사용되는 라인 스캔에 대한 총 미세 소관 길이를 효율적으로 시각화합니다. 검은 점선은 동적 미세 소관의 두 가지 예 Kymographs에 해당합니다.
미세 소관의 성장 및 분해 단계는 각 Kymograph에 표시됩니다. 활발하게 중합하는 단일 액틴 필라멘트를 묘사하는 두 가지 예의 타임랩스 이미지 몽타주가 여기에 도시되어 있다. 연신율은 마이크로몰 액틴 당 시간에 따른 액틴 필라멘트의 길이에 대한 플롯의 기울기로서 계산된다.
따라서, 하나의 마이크로몰 액틴 농도에서 전형적으로 결정된 속도를 비교하기 위해 두 개의 보정 인자가 0.5 마이크로몰 액틴 반응에 적용되어야 한다. 다섯 필라멘트의 예가 여기에 나와 있습니다. 250 나노몰 타우의 부재 또는 존재 하에 중합되는 액틴 필라멘트에서의 동적 미세소관의 총 내부 반사 형광, 또는 TIRF 이미지가 여기에 제시된다.
파란색 점선과 화살표 마크는 각 조건에 대응하는 라인 스캔 플롯에 대해 선을 그렸다. 액틴 영역 내의 미세소관 사이의 중첩은 영역당 설정된 시점에 스코어링될 수 있다. 세포 골격 단백질, 특히 액틴, 미세 소관 및 그 조절제는 동결 / 해동 사이클에 매우 민감합니다.
일관성과 성공을 위해서는 매우 순수하고 적절하게 저장된 단백질을 사용하십시오.
