Bu protokol, nispeten hızlı ve uygun maliyetli bir yöntemin yanı sıra otomatik bir edinme ve analiz sunar, böylece yaygın bir epigenetik biyobelirteç olan 5-Metilsitozinin düşük hassasiyetli taramasını üretir. Bu tekniğin temel avantajı, kullanıcıların modellerine ve gelişim aşamalarına göre optimize edebilecekleri deneysel bir tasarım sunma esnekliğidir. Bu teknik, kimyasal maruziyetin, gelişmekte olan bir organizma içindeki 5-Metilsitozin'in göreceli bolluğunu nasıl değiştirdiğini tespit etmek için kullanılabilir; bu, normalde sadece dizileme gibi pahalı yüksek trpA yöntemleri ile yapılabilir.
Bu yöntem, çevresel uyaranlara yanıt olarak 5-Metilsitozinin epigenetik değişikliklerini anlamak için NCG yöntemlerini kullanmayı amaçlayan herhangi bir araştırma için yararlıdır. Toplama sabahı taze bir maruz kalma çözeltisi hazırlayarak başlayın. 60 milimetrelik cam Petri kabına beş mililitre partikülsüz sistem suyu ekleyin.
Daha sonra 10 mikrolitre dimetil sülfoksit veya kimyasal stok çözeltisini sistem suyuna aktarmak için 10 mikrolitrelik mikro kılcal cam pipet kullanın. Stok çözeltisinin dağılmasını sağlamak için cam Petri kabını döndürün. Cam Petri kabına beş mililitre daha sistem suyu ekleyin ve maruz kalma çözeltisini homojenize etmek için kabı döndürün.
Buharlaşmayı en aza indirmek için cam tabakları cam kapaklarla kapatın. Daha sonra, embriyoları balık ağından 100 milimetrelik bir kaba aktarmak için RO su dolu bir fışkırtma şişesi kullanın. Döllenmeden 0.75 saat sonra 50 canlı embriyoyu rastgele sıralayın ve fazla RO suyunu çıkarın.
Maruziyet süresi sona erdikten sonra, embriyoları inkübatörden çıkarın. Tüm canlı embriyoları 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Herhangi bir embriyoyu aspire etmeden artık maruz kalma solüsyonunu aspire edin.
500 mikrolitre soğutulmuş% 4 paraformaldehit ekleyin ve embriyoları birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Embriyoların sabitlenmesine ve% 4 paraformaldehitin gece boyunca dört santigrat derecede sabitlenmesine izin verin. Embriyoları sabitledikten sonra% 4 paraformaldehit aspire edin, embriyoları 1X PBS'de tekrar harcayın ve 30 saniye boyunca nazik pipetleme ile karıştırın.
Bir cam pipet kullanarak, sabit embriyoları RO su dolu bir cam kaba dikkatlice aktarın. 30 saniye boyunca yavaşça döndürün ve bu yıkamayı bir kez tekrarlayın. Beş kat büyütme ile ayarlanmış bir stereo mikroskop altında, şırınga iğneleri kullanarak embriyoları süsleyin.
İğne ucunu kullanarak, koryonu delin ve yavaşça yumurta sarısı ve hücre kütlesinden uzaklaştırın. Embriyolar süslendikten sonra, 25 adede kadar bozulmamış embriyoyu bir immünohistokimya sepetine aktarmak için bir cam mikro kılcal pipet kullanın. IHC sepetini 24 delikli bir tabağa yerleştirin.
Sonra suyu her kuyudan aspire edin. Embriyoları kuyu başına 500 mikrolitre bloke tamponunda askıya alın, plakayı ışıktan korumak için paraform ve alüminyum folyo ile sarın. Plakayı 100 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda dört saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Kuluçkadan sonra, bloke edici tamponu her bir kuyucuktan aspire edin. 500 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ile değiştirin. Arka plan gürültüsünü hesaba katmak için araç kontrol embriyolarının bir alt kümesini bloke edici tamponla inkübe etmeyi unutmayın.
Plakayı ve paraform ve alüminyum folyoyu yeniden sarın ve plakanın yörüngesel bir çalkalayıcıda gece boyunca dört santigrat derecede inkübe olmasına izin verin. Ertesi gün birincil antikor çözeltisini her bir kuyucuktan çıkarın ve 1x PBST ile değiştirin. Her bir kuyuyu, yörüngesel bir çalkalayıcıda yıkama başına beş dakika boyunca 1x PBST ile üç kez yıkayın.
Her kuyudan 1x PBST'yi aspire edin ve IHC sepetini RO suyuyla dolu bir cam Petri kabına yerleştirin. Standart bir stereo mikroskop altında, bozulmamış embriyoları rastgele 96 kuyucuklu bir plakaya ayırarak kuyu başına bir embriyo sağlar. Ardından tüm RO suyunu ayrı ayrı kuyulardan çıkarın ve 200 mikrolitre 1x PBS ekleyin.
Plakayı bir G.Görüntüde üç dakika boyunca santrifüj edin, embriyoları iletilen ışık ve FITC altında iki kat objektif olarak görüntüleyin. Fotoğraf makinesinin netlemesinin plakanın altında olduğundan ve alt kalınlıkla dengelendiğinden emin olmak için otomatik netlemeyi seçin. Pozlama süresi 100 milisaniye olan bir FITC dalga boyu seçin ve otomatik odağı Z ofseti ile lazere ayarlayın.
Plaka alımına başlamadan önce uygun görüntü alımını ve birkaç kuyuyu gözlemleyin ve onaylayın. Görüntü alımından sonra, yüksek içerikli tarama sistemini ve özel bir otomatik görüntü analizi prosedürünü kullanarak veri analizi yapın. Toplam alan ve entegre floresan yoğunluğu için analiz edilecek 96 kuyu plakasındaki her embriyoyu seçin.
Ardından, veri noktalarını tablolaştırın ve verileri bir elektronik tabloya aktarmak için açık veri günlüğünü ölçüp seçerek yüksek içerikli tarama sisteminden dışa aktarın. Her kuyu için verileri sıralamak ve toplamak ve kuyu numarasına göre filtrelemek için dışarı aktarılan elektronik tabloyu dağıtıcı paketine yükleyin. Ardından, toplanan verileri bir elektronik tabloya aktarmak için doğru Excel paketini kullanın.
5-Metilsitozin spesifik toplam alanın dağılımı ve entegre yoğunluğu, döllenmeden altı saat sonra Zebra balığı embriyoları için değerlendirildi. X ekseni, bir araç olarak DMSO'ya veya pozitif kontrol olarak TDCIPP'ye maruz kalmayı gösterir. Y ekseni göreceli floresanı gösterir.
Eşikler, embriyolarda tespit edilen toplam 5-Metilsitozin alanı ve aynı alandaki entegre yoğunluk ile gösterildiği gibi, araçla tedavi edilen embriyolardan önemli ölçüde farklıydı. Doğru IHC tespiti için boyunduruğun ve hücre kütlesinin bütünlüğünü korumak son derece önemlidir. Bu yöntem nispeten duyarsızdır ve yalnızca göreli bolluk RFU verisi sunar.
Niceleme gerekiyorsa, daha hedefli bir yaklaşımla takip edilebilir.
