Bernard Kulemaka ve onların yararlı yorumlar ve reaktif rehberlik, Sam Connell ve Brent Redford, Zebra balığı bakımı için görüntüleme sorular ve Deborah Bang, Karen Heed ve Kay Stewart fielding için 3i Smith laboratuara üyeleri teşekkür ederiz. Bu eser Zebra balığı araştırma Üniversitesi Notre ve kök hücre Merkezi ve Notre Üniversitesi, Rejeneratif Tıp Üniversitesi, Notre Dame, Elizabeth ve Michael Gallagher aile, Alfred P. Sloan Vakfı, Merkezi tarafından desteklenmiştir Dame. Tüm hayvan çalışmaları Notre Dame Üniversitesi ile uyumlu IACUC Dr Cody Smith için yapıldı.

Tüm hayvan çalışmaları Üniversitesi Notre Dame kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. Zebra balığı numune hazırlanması
<ol><li>Bir yetişkin erkek ve bir yetişkin kadın Tg (Cabrio protein) Standart prosedürler13başına bir çiftleşme odasına koyun. Bu makale, access ancak photoconvertible proteini transgenic diğer çizgilerle nedeniyle balık9 -ebilmek var olmak kullanılmış aynı derecede Tg(sox10:eos) kullanın. Balık yatıyor musun diye birden fazla odasını ayarlayın. Balık odasında gece kalmak izin verir.</li>
	<li>Ertesi sabah, 100 mm Petri yemeklerinde yumurta toplamak. 24 saat sonrası döllenme (hpf) olgun yumurta daha önce tarama sağlar.</li>
	<li>Hayvanlar yukarıdaki heterozygotes transgene için olsaydı, diseksiyon mikroskop setlerinde Ekran 24 hpf yemekleri Tg(sox10:eos) + embriyo 488 nm ışık kaynağı ve GFP için filtre. TG(sox10:EOS) + embriyolar izole ve 48 olarak olgun için izin hpf.</li>
	<li>Dechorionate embriyo bir iğne veya cımbız ile elle.</li>
	<li>Hazırlamak ve 5 mL % 0.8 düşük erime noktası özel çözüm de mikrodalga.<ol>
<li>Özel soğukluk kez 3-4 imzalat Tg (sox10:eos) + 48 yerleştirin hpf balık bir 10 mm cam-coverslip merkezinde alt Petri kabına.</li>
		<li>Coverslip, yaklaşık 1 mL yüzey karşılamak için yeterli özel ekleyin. Bir sonda iğne balık üzerinde yan yana düzenlemek için kullanın. Hayvanların montaj sağlamak için kuvvetlendirmek özel izin. Sürekli Zebra balığı agar14katılaşır kadar yeniden düzenlemek için gerekli olabilir. Katılaşma yaklaşık 2 dakika sürer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Özel için 2 dk katılaşmış sonra yavaş yavaş %0.02 aminobenzoic asit ester agar ve çanak alt yüzeyinin batık kadar yemek için (Tricaine) içeren embriyo orta ekleyin. Bu yaklaşık 3 mL olmalıdır.</li>
</ol>2. mikroskop montaj ve öncesi dönüşüm görüntüleme
<ol><li>Confocal yazılımını açın ve yakalama ve odak windows [şekil 1] seçin. Yakalama penceresi altında laboratuvar özgü dönüşüm görüntüleme ayarı sekmesi [şekil 1] açılır ayarlama yakalama altında seçin. Burada, laboratuvar özgü ayarı "balık Imaging." denir</li>
	<li>Numune confocal etki alanına yerleştirin ve ders ve hassas ayar düğmeleri kullanarak odak haline getirmek.</li>
	<li>Odak penceresini açın ve istediğiniz bölgenin ilgi (yani dorsal kök gangliyon) bulun.</li>
	<li>C488 lazer filtresi ayarla menüsünden seçin. 300 MS pozu ayarlamak, 5 güç lazer ve 75 [Şekil 2] yoğunlaştırmak.</li>
	<li>Türü yakalama bölümünün altında 3D kutuyu işaretleyin. 3D yakalama bölümünde geçerli konumu kullan ' ı seçin ve çevresinde geçerli aralığınıdenetleyin. Aynı bölümünde, 35, 36 uçak ve adım boyu 1 sayısı aralığı ayarlayın. Aralığın artırılması veya azaltılması için görüntüleme alanını derinliği karşılamak için. Omurilik için 35-40 yığınları arasında bir aralık değeri genellikle yeterli [şekil 5] ' dir.</li>
	<li>Geçerli konumunu [şekil 5] seçin.</li>
	<li>Görüntü elde etmek için yakalama penceresinin altındaki Başlat'ı tıklatın.</li>
</ol>3. tek hücreli Photoconversion
<ol><li>Confocal yazılımını açın ve yakalama ve odak windows [şekil 1] seçin. Yakalama penceresi altında laboratuvar özgü dönüşüm görüntüleme ayarı sekmesi [şekil 1] açılır ayarlama yakalama altında seçin. Burada, laboratuvar özgü ayarı "Balık tam çip ablate." denir</li>
	<li>C488 ve c541 lazer filtresi ayarla menü altında seçin. Değil istimal aynı mikroskop bilgisayar yazılımı farklı lazerler ve seçin 488 nm ve 541 nm lazerler seçmek için menüyü bulun. 300 MS Etkilenmeler ayarla, 5 güç lazer ve 75 [Şekil 2] yoğunlaştırmak. Bu lazer ayarları photobleaching ya da toksisite neden olmadan floresan yeterli sinyal üreten göre seçilir. Toksisite veya photobleaching görselleştirildiği, lazer güç veya pozlama azaltın.</li>
	<li>Odak penceresini açın ve odak penceresindeki photomanipulation sekmesinde tıklatın. Lazer parametreleri uygun şekilde ayarlayın. Lazer yığın güç 2 olarak değiştirin ve sonra devam' ı tıklatın. Raster blok boyutu 1 olarak değiştirin ve ayarla' yı tıklatın. Çift tıklatma boyutu 4 olarak değiştirin. Lazer çizgi v405 için değiştirmek [şekil 3].</li>
	<li>Gelişmiş yakalama ayarlarını Yakalama penceresi içinde açın. Photomanipulation sekmesini seçin ve çift tıklatma tekrar 2 olarak değiştirin. [Şekil 4] Tamam'ı tıklatın.</li>
	<li>XY sekme odağı penceresinde seçin. Çift lazer parametreleri adım 2 [şekil 3, şekil 4] photomanipulation sekmesinde kontrol edin. Photoconvert hücre photoconversion çevreleyen hücre olmadan ilgi için lazer ayarlarını ayarlayın.<ol>
<li>Photoconversion bitişik hücre varsa, lazer gücü düşür. Photoconversion hücre oluşmazsa, lazer gücü arttırılabilir. En iyi şekilde, lazer güç photoconvert faiz ve çevresinde değil yalnızca bölgenin ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Türü yakalamakaltında timelapse kutuyu işaretleyin. Sonra [şekil 6A] Başlat ' ı tıklatın.</li>
	<li>Bir kez canlı timelapse pencere açık, üst araç çubuğunda [Şekil 7] daire aracını seçin</li>
	<li>Hücrenin ortasındaki bölgede bir daire çizin. Doğru tıkırtı çizilmiş daire, sıkı BAĞLAMAK bölgeyiseçin ve 3 saniye bekleyin. Seçili alanı dimmer olacaktır [şekil 8]. Yakalama durdur' u tıklatın.</li>
	<li>Eğer birden fazla hayvan Imaging, geri odak menüsü ve seçme pozisyonu 2 XY sekmesine gidin. Daha sonra adımları 4.1-4,6 yineleyin.</li>
	<li>Hücreleri nüfusu dönüştürmek için bölgenin ilgi sıkı BAĞLAMAK, Çizgi aracını kullanmak için bir daire çizim yerine adımları 4.1-4.4 Protokolü ve lazer parametrelerini izleyin. Faiz bölge üzerinde bir çizgi çizin ve yukarıda listelenen aynı parametreleri kullanarak bölge sıkı BAĞLAMAK.</li>
</ol>4. mesaj-photoconversion görüntüleme
<ol><li>Bir kez tüm noktaları photoconverted. Adım 3 görüntüleme precoversion açıklanan ayarlama laboratuvar özgü standart görüntü yığını seçin. Bu yakalama Yakalama penceresinde [şekil 5] sekmesi açılır ayarlama altında bulunur.</li>
	<li>C488 lazer seçin ve 300ms maruz ayarla, 5 güç lazer ve 75 [Şekil 2] yoğunlaştırmak.</li>
	<li>C488 lazer olarak aynı menü altında bulunan c541 lazer seçin. 500 MS pozu ayarlamak, güç 10 lazer ve 75 [Şekil 9] yoğunlaştırmak.</li>
	<li>Türü yakalama bölümünün altında 3D kutuyu işaretleyin. 3D yakalama bölümünde geçerli konumu kullan ' ı seçin ve çevresinde geçerli aralığını denetleyin. Aynı bölümünde, 35, 36 uçak ve adım boyu 1 sayısı aralığı ayarlayın. Aralık sayı istediğiniz görüntüleme derinliği [şekil 5] karşılamak için azaltabilir veya artırabilirsiniz.</li>
	<li>XY odak sekmesinde birden çok nokta varsa, çok noktalı Listele seçeneğini yakalama penceresinde seçin. Eğer değilse, geçerli konumunu seçin.</li>
	<li>Görüntü elde etmek için yakalama penceresinin altındaki Başlat'ı tıklatın.</li>
</ol>

<ol><li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li>
<li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1996.10050935.x/abstract">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li>
<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li>
<li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li>
<li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BFluorescent+timer%26%2334%3B%3A+protein+that+changes+color+with+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">&#34;Fluorescent timer&#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li>
<li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li>
<li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).</li>
<li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li>
<li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li>
<li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Karmaşık dokularda, farklı hücre tipleri belirli etki alanlarına düzenleyin. Son zamanlarda teknikleri bu büyük doku yapıları1,2,3içinde etiket tek tek hücreler için kullanılması. Burada benzer şekilde tek hücre etkileşimleri ve karmaşık dokularda hücre nüfus etkileşimleri görselleştirmek için kullanılması gereken iki teknikleri göstermektedir. Photoconversion tekniği belirgin bir hücre etiketlemek...

Birden çok farklı hücre oluşturmak ve karmaşık hayvan ve bitki dokularında korumak için etkileşim. Bu hücrelerin çoğu kez ara ve yüksek çözünürlüklü mikroskobu olmadan bir tek hücre düzeyinde doku fiksasyon gerektiren komşulardan ayırt etmek zor. Ancak, nasıl bu doku formu anlamak, muhafaza ve hastalıklı olmak için nasıl tek içinde doku hücreleri araştırmak için gerekli oldu zaman içinde etkileşim vardır. İdeal olarak, bu deneyler tek hücre içinde bir doku fiksasyon zorunluluğu olmadan non-invaziv bir şekilde etiketleme gerektirir. Bilim adamları şimdi bu görev1,2,3,4gerçekleştirmek için çeşitli teknikler geliştirdik.
Keşif ve denizanası yeşil flüoresan protein (GFP) uygulanması ayrı hücre doku çevre1etiketleme için izin verilen bir heyecan verici bir yaklaşım oldu. Hücre özel Organizatör kullanarak, genetik olarak1etiketli hücre alt grubunu seçmek mümkündür. Alternatif olarak, GFP viral indüklenen ifade-ebilmek var olmak kullanmak için kullanıcı tarafından seçilen ifade GFP3,4. Her ne kadar tamamen yararlı, GFP genetik aracılı ifade kullanıcı tarafından seçilen ifade içinde bir alt doku hücrelerinin izin vermez; ve her ne kadar avantajlı, GFP, viral ifade invaziv olabilir. GFP türevleri ve farklı floresan proteinler doku içinde daha seyrek hızlı Brainbow gibi akıllı teknikleri ortaya çıkmasıyla, tek hücre ve karmaşık doku2, aralarında etkileşimleri görselleştirmek mümkün oldu 5. ancak, bu yaklaşımların bir rasgele moda hücrelerde etiket. İstenen deney görüntülenmesini tek bir hücre veya hücre deneyci tarafından tanımlanan nüfus gerektiriyorsa, bu nedenle sınırlıdır. Bu tür deneyler, bu, bir tek hücre biçimde ayırt etmek için manipüle edilebilir bir genetik olarak ifade edilen floresan protein için avantajlı olur diğer ve floresan floresan hücreleri ondan.
Bu hedefe ulaşmak için ve hücre biyolojisi karmaşık canlı bir doku içinde tek hücre görselleştirmek için tek hücre photoconversion farklı floresan proteinler6,7,8bilimsel topluluk kullanır. Genetik olarak kullanarak kontrol ifade bir yeşilden için UV maruz kalınca kırmızı floresan durumu geçişleri photoconvertible protein (Yani, eos, kaede, vb) (488 nm) ışık, biz tek bir hücre fluorescently etiketli ayırt edebilirsiniz Komşular6,7,8. Bu yaklaşım bizim confocal mikroskop lazer yığın ışıktan ilgi bir kırınım-sınırlı bölgesine doğrudan bağlı bir aparat kullanır. Bu teknik ile biz de tek hücre veya bir kullanıcı tarafından tanımlanan şekilde9,10,11daha büyük nüfus etiketleyebilirsiniz. Viral GFP tek hücre enjeksiyonlari karşılaştırıldığında minimal invasif tekniktir. Kavramının bir kanıtı olarak, biz bir gangliyon periferik sinir sistemi ve spinal kord9,10ventral tarafında bulunan hücreler gibi photoconvert daha büyük nüfus içindeki photoconvert tek hücreleri elimizden göstermek, 11,12. O zaman onların hareket ve farklılaşma geliştirme sırasında bir anlayış kazanmak için bu photoconverted hücre popülasyonlarının 24 saat sonra görselleştirebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>&lt;font class=&quot;font5&quot;&gt;Tg(&lt;em&gt;sox10:eos&lt;/em&gt;)&lt;/font&gt;&lt;font class=&quot;font0&quot;&gt; zebrafish animals&lt;/font&gt;</td><td></td><td></td><td>Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame</td></tr><tr><td>100 X 15 mm petri dish</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium</td><td></td><td></td><td>Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.</td></tr><tr><td>0.8% Low Melting Point Agarose</td><td>dot scientific inc</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14021-20</td><td></td></tr><tr><td>Needle dissecting probe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)</td><td>Fluka analytical</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters</td><td>Zeiss Axiozoom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets</td><td>3i spinning disk confocal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV light source (laser) for photoconversion</td><td>405 nm laser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slidebook software</td><td>3i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Kordon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell photoconversion in living intact zebrafish

Hayvan ve bitki dokusu hücrelerinin farklı nüfus oluşur. Bu hücreler oluşturmak ve doku korumak için zaman içinde etkileşim ve bozulduğu zaman hastalığa neden olabilir. Bilim adamları özellikleri ve bu hücreler sağlam doku içinde doğal dinamikleri floresan proteinler hücre alt kümeleri arasında ifade ederek araştırmak için akıllı teknikleri geliştirdik. Ancak, zaman zaman, deneyler hücreleri tek hücre veya hücreleri nüfus şekilde, bazen doku içinde daha fazla seçili görselleştirme gerektirir. Bunu başarmak ve hücreleri nüfusu içindeki tek hücreleri görselleştirmek için bilim adamları tek hücreli photoconversion floresan proteinlerin kullanılan. Bu tekniği göstermek için biz burada nasıl UV ışığı bozulmamış bir ilgi bir Eos ifade hücreye doğrudan için Zebra balığı yaşayan gösteriyor. O zaman doku nasıl değiştirdiler belirlemek için bu photoconverted Eos+ hücreleri 24 saat sonra görüntü. Biz iki teknik tarif: tek hücre photoconversion ve hücre nüfusun photoconversions. Bu teknikler hücre-hücre etkileşimleri, hücre-kader ve farklılaşma ve hücre geçişleri, yapım o çok sayıda biyolojik sorularda uygulanabilir bir teknik görselleştirmek için kullanılabilir.

Photoconversion floresan proteinlerin bir doku6farklı hücrelerde etiketlemek için kullanılabilir. Bunu göstermek için Tg(sox10:eos) balık9 kullanılan sox10düzenleyici dizileri altında photoconvertible protein Eos ifade etmek için. Tg(sox10:eos) hayvanların 48 hpf olduğunu ilk monte edilmiş ve daha sonra oluşmuş olabilir herhangi bir non-spesifik photoconversion tespit etmek için yansıma. Dönüşt...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish at JoVE.com

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Burada, nasıl hücre photoconversion floresan protein, Eos, yaşayan hayvanlarda ifade belirli alanlara UV Işınlarına maruz kalma yoluyla elde edilir göstermek için bir iletişim kuralı mevcut.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

single-cell-photoconversion-in-living-intact-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.0K Görüntüleme.  University of Notre Dame. Burada, nasıl hücre photoconversion floresan protein, Eos, yaşayan hayvanlarda ifade belirli alanlara UV Işınlarına maruz kalma yoluyla elde edilir göstermek için bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Gelişim Biyolojisi

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrange Sistemi kullanılarak GFP transgenik zebrafish hücreleri izleme

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

Konfokal Mikroskop Zebra balığı Embriyonik Beyin Görüntüleme Canlı

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Biyoloji

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling processes of excitable neuronal and muscular cells and many other biological processes, such as embryonic developmental patterning. However, there is a need for in vivo electrical activity monitoring in vertebrate embryogenesis. The advances of genetically encoded fluorescent voltage indicators (GEVIs) have made it possible to provide a solution for this challenge. Here, we describe how to create a transgenic voltage indicator zebrafish using the established voltage indicator, ASAP1 (Accelerated Sensor of Action Potentials 1), as an example. The Tol2 kit and a ubiquitous zebrafish promoter, ubi, were chosen in this study. We also explain&#160;the processes of Gateway site-specific cloning, Tol2 transposon-based zebrafish transgenesis, and the imaging process for early-stage fish embryos and fish tumors using regular epifluorescent microscopes. Using this fish line, we found that there are cellular electric voltage changes during zebrafish embryogenesis, and fish larval movement. Furthermore, it was observed that in a few zebrafish malignant peripheral nerve sheath tumors, the tumor cells were generally polarized compared to the surrounding normal tissues.

Here, we show the process of creating a cellular electric voltage reporter zebrafish line to visualize embryonic development, movement, and fish tumor cells in vivo.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Canlı Zebra balığı Embriyolar iki-Foton-Tabanlı fotoaktivasyon

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Multicolor Time-lapse Imaging of Transgenic Zebrafish: Visualizing Retinal Stem Cells Activated by Targeted Neuronal Cell Ablation

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound transgenic fish which express different fluorescent reporters in neighboring cell types provide a means of following cellular interactions 2 and/or tissue-level responses to experimental manipulations over time. In this video, we demonstrate methods that can be used for imaging multiple transgenically labeled cell types serially in individual fish over time courses that can span from minutes to several days. The techniques described are applicable to any study seeking to correlate the "behavior" of neighboring cells types over time, including: 1) serial 'catch and release' methods for imaging a large number of fish over successive days, 2) simplified approaches for separating fluorophores with overlapping excitation/emission profiles (e.g., GFP and YFP), 3) use of hypopigmented mutant lines to extend the time window available for high-resolution imaging into late larval stages of development, 4) use of membrane targeted fluorescent reporters to reveal fine morphological detail of individual cells as well as cellular details in larger populations of cells, and 5) a previously described method for chemically-induced ablation of transgenically targeted cell types; i.e., nitroreductase (NTR) mediated conversion of prodrug substrates, such as metronidazole (MTZ), to cytotoxic derivatives 3,5.
As an example of these approaches, we will visualize the ablation and regeneration of a subtype of retinal bipolar neuron within individual fish over several days. Simultaneously we will monitor several other retinal cell types, including neighboring non-targeted bipolar cells and potential degeneration-stimulated retinal stem cells (i.e., M&#971;ller glia). This strategy is being applied in our lab to characterize cell- and tissue-level (e.g., stem cell niche) responses to the selective loss and regeneration of targeted neuronal cell types.

In this video, techniques for multicolor confocal time-lapse imaging and targeted cell ablation are provided. Time-lapse imaging is used to monitor the behavior of multiple cell types of interest in vivo. Targeted cell ablation facilitates the study neural circuit function and cell-specific neuronal regeneration paradigms.

Transgenik Zebra balığı Multicolor Time-lapse Görüntüleme: Hedefli Nöronal Hücre Ablasyon aktifleşir görselleştirme Retina Kök Hücreler

High-resolution time-lapse imaging of living zebrafish larvae can be utilized to visualize how biological processes unfold (for review see 1). Compound ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Zebra balığı Geliştirme Sırasında Photoconvertible Proteinler kullanma Cep Takip

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

In Vivo Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

Zebrafish larvae are a promising vertebrate model system for studying the neural mechanisms of behavior. Their translucence and relatively simple neural circuitry facilitate the use of optogenetic techniques in cellular analyses of behavior. Fluorescent indicators of in vivo neural activity, such as GCaMP6s, have been widely used to study the neural activity associated with simple behaviors in larval zebrafish. Here, we present a protocol for detecting sensory-induced activity in semi-restrained zebrafish larvae using the transgenic line Tg(elav3:GCaMP6s). In particular, we use the chemical agent allyl isothiocyanate to induce a robust, reproducible fluorescent response in a brain region at the border of the hindbrain and spinal cord. We discuss the potential uses of GCaMP6s for optical monitoring of neural activity during a range of behavioral paradigms and the limitations of this technique. Our protocol outlines an accessible approach for monitoring dynamic, behavior-related in vivo neural activity in the larval zebrafish brain.

Here, we present a detailed protocol to examine neural activity in brain regions of transgenic zebrafish that express GCaMP calcium indicators using confocal microscopy.

In vivo (İn canlı) Kısmen Kısıtlanmış Larva Zebra Balıklarında Duyusal Stimülasyonla İndüklenen Nöral Aktivitenin Konfokal Floresan Görüntülemesi

Zebrafish larvae are a promising vertebrate model system for studying the neural mechanisms of behavior. Their translucence and relatively simple neural ...