Soru, neden sadece kene ısırıklarına maruz kalan bazı kişilerin alerjik reaksiyonlar geliştirdiğidir. Bizim için, kene tükürüğündeki biyomolekülleri ve bu süreci içeren bağışıklık mekanizmalarını aydınlatmak, bu soruyu ele almanın anahtarıdır. Alfa-Gal sendromunun zebra balığı hayvan modeli, kene tükürüğüne yanıt olarak insan davranış kalıplarını ve alerjik reaksiyonları yeniden üretir.
Bu deneysel yaklaşım, alfa-Gal sendromu ile ilişkili çatışma yaşadığımız kene-konakçı moleküler etkileşiminin ve patojen enfeksiyonuna karşı koruyucu olan alfa-Gal'e karşı antikor yanıtı ile ilişkili işbirliğinin anlaşılmasını ilerletmektedir. Balıkları kene tükürüğü ile tedavi etmek için, yetişkin zebra balıklarını cinsiyet dengeli üç gruba ayırın. Ticari Gala1-3Gal-BSA 3 veya alfa-Gal'i pozitif kontrol olarak ve PBS'yi negatif kontrol olarak kullanın.
Tükürük ekstraksiyonu için, Gine domuzlarında altı ila yedi gün boyunca beslenen yarı engorge, patojen içermeyen, dişi keneler kullanın. Keneyi PBS'de% 2'lik bir pilokarpin hidroklorür çözeltisinin beş mikrolitresi ile pH 7.4'te hemocoel'e 0.33 milimetrelik bir iğne ile 50 mikrolitrelik bir şırınga kullanarak tedavi edin. Bir mikropipet üzerine monte edilmiş 10 mikrolitrelik bir uç kullanarak kene hipostomundan tükürük toplayın.
Tükürüğü buz üzerinde 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Üreticinin tavsiyelerini izleyerek, bir BCA protein tahlil kiti kullanarak balığa enjekte edilecek protein miktarını belirlemek için tükürük protein konsantrasyonunu belirleyin. Zebra balığını, 14 ila 10 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsü ile 27 santigrat derecede akan bir su sisteminde tutun.
Daha sonra, dişilerin erkeklere benzer bir oranına ve enjeksiyon için benzer ağırlığa sahip grup başına 10 balık seçin. Balıkları% 0.02 trikain metansülfonata daldırarak kısaca uyuşturun. Anestezi uygulanan balığı, forseps veya elleri dikkatlice kullanarak, ıslak bir sünger üzerine, lezyonları kontrol etmek için bileşikleri aynı yönde enjekte etmek için kaudal yüzgeci sağ tarafta olacak şekilde yarım tarafına yerleştirin.
Kaudal yüzgecine beş milimetrede bir santimetre, 29 gauge iğne ve balığın vücuduna 45 derecelik bir açı ile donatılmış 100 mikrolitrelik bir şırınga ile kas içine intradermal olarak balık gruplarına enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, tedavi edilen balıkları iyileşme için anestezi olmadan bir tatlı su tankına geri yerleştirin. Balıkları günde iki kez sabah 9: 30'da besleyin.
ve 13:30'da ikinci güne kadar balık başına 50 ila 70 mikrogram kuru balık yemi ile. Ardından, tedavi enjeksiyonundan sonraki ikinci günden sekizinci günde deneyin sonuna kadar balıkları beslemek için köpek mamasını bir harç ve havaneyle ezin.
Numune toplama için, ötenazi yapılmış balıkları pimli bir parafin plakaya sabitleyin. Solungaçlar hala kanla sulandığında, bir santimetrelik, 29 gauge iğne ile donatılmış 0.5 mililitrelik bir şırınga kullanarak serumu balığın solungaç kan damarlarından toplayın. Toplanan serumu kullanıma kadar 20 santigrat derecede 1.5 mililitrelik bir tüpte saklayın.
Balıkları bir neşter bıçağı ile sagittal olarak kesin ve iç lezyonları değerlendirin. Daha sonra her balığın bağırsağını ve böbreğini ayrı 1,5 mililitrelik tüplerde toplayın. Bir RNA saflaştırma kiti kullanarak bağırsaktan ve böbrekten toplam RNA'yı çıkarın.
Üreticinin talimatlarına göre, RT-qPCR için bir ters transkripsiyon karışımı kullanarak kantitatif ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu veya RT-qPCR gerçekleştirerek, bağışıklık tepkisi ile ilgili genlerin ekspresyonunu analiz edin. Zebra balığı GAPDH'ye karşı mRNA cT değerlerini normalleştirin ve eşit olmayan varyansa sahip bir Student t-testi kullanarak gruplar arasında karşılaştırma yapın. ELISA ile serum örneklerinde alfa-Gal'i tanıyan IgM antikor titrelerini belirleyin.
Bir plaka okuyucu kullanarak antikor titrelerini optik yoğunluk 450 nanometre değerleri olarak kaydedin ve eşit olmayan varyanslı bir Student t-testi kullanarak gruplar arasında karşılaştırma yapın. Bu zebra balığı modeli, kene tükürüğüne karşı konakçı yanıtı ve bunların alfa-Gal sendromu veya AGS'deki etkileri nedeniyle çeşitli alerjik reaksiyonların karakterizasyonuna ve değerlendirilmesine izin verir. Ayrıca kontrol balıklarına göre kene tükürüğü ile tedavi edilen balıklarda yavaş yüzme, tankın dibinde yatma, yememe, titreşme veya zikzak çizme hareketi gibi davranışlarda değişiklikler gözlenmiştir.
Kene tükürüğü ile tedavi edilen balıklarda hızlı duyarsızlaşma ve tolerans gösteren önemli bir alerjik reaksiyon insidansı gözlenmiştir. Davranış değişikliği, kene tükürüğü ile tedavi edilen balıklarda sadece alfa-Gal'den daha belirgindi. Temsili immün belirteçlerin ekspresyonunun ek analizi RT-PCR ile gerçekleştirildi.
Sonuçlar, böbrekteki zebra balığı grupları arasında, bağışıklık yanıt belirteçlerinin tükürük ve alfa-Gal ile tedavi edilen balıklarda kontrol grubuna kıyasla aşağı regüle edildiği farklılıklar gösterdi. Ayrıca, tükürük ve alfa-Gal ile tedavi edilen zebra balığı, PBS ile tedavi edilen balıklardan daha yüksek seviyeler gösteren alfa-Gal'e karşı IgM antikorları geliştirdi. Tedavinin enjeksiyonu, alerjik reaksiyonların ve davranışların değerlendirilmesi, alerjik reaksiyonlardan ölü balık sayısının raporlanması protokolün en önemli husustur.
Kene tükürüğüne verilen cevabı karakterize etmek için mRNA, protein ve ayrıca mikrobiyom seviyelerinde omik teknolojileri kullanmak, bu süreçte yer alan anahtar biyomolekülleri tanımlamamızı sağlar.
