Bu eser Fonds voor Wetenschappelijk onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N tarafından desteklenmiştir; Pediatrik Kardiyoloji, UZ Leuven, Belçika &quot;Eddy Merckx Araştırma Bursu&quot; ve &quot;Sporta araştırma Hibe&quot; (JC); Moleküler Biyoloji ve Damar Merkezi Leuven Üniversitesi&#39;nden &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) ve Boehringer-Ingelheim bir araştırma bursu ile, Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014) tarafından desteklenmektedir.

Hayvan deneyleri KU Leuven Etik Komitesi tarafından kabul edildi. İn Vitro perfüzyon ve in vivo deneylerde hazırlanması 1. Bakterilerin <ol><li> Biz S. kullanılan aureus Bu yazıda anlatılan tüm deneyler için suşu Newman. S. aureus Newman -80 ° C&#39;de,% 10 gliserol ile Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) &#39;de depolanmıştır. </li><li> 37 ° C (OD&gt; 3 600) havaalanındaki / N dondurulmuş bakteri kazıyın ve 5 ml Triptik Soy Broth (TSB) Ç aşılamak için steril bir döngü kullanın. </li><li> Santrifüj (2,600 g, RT, 5 dakika) bakterilerin yıkanır ve 5 ml PBS (fosfat tamponlu tuzlu su) bakteriyel pelletini. </li><li> Etanol, 5 (6) -karboksi-floresin N-hidroksisüksinimidil ester (karboksi-floresin) bir 1 mg / ml çözelti hazırlayın. Laboratuvar sınıfı su içinde, 150 ug / ml, 1 mg / ml karboksi-floresin çözeltisi (örneğin, MilliQ su) ile seyreltilir. Işık tüpleri korumak-20 ° C de, alüminyum folyo ve mağaza ile. </li><li> (2.600 xg, RT, 5 dk) bakterileri santrifüj. 800 ul PBS içinde bakteriyel pelet yeniden süspanse edin ve 200 ul veya 150 ug / ml karboksi-floresin çözeltisi 400 ul (nihai konsantrasyon in vivo deneyler için 50 ug / ml) (perfüzyon deneyleri için 30 ug / ml nihai konsantrasyon) ilave edin. Alüminyum folyo ile ışıktan tüpleri korumak ve bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Etiketlemeden sonra, PBS içinde% 6 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi ile bir blok. </li><li> Optik dansitometrisi kullanılarak bakteri (OD), bir OD in vitro deneyler için 0.65, 600 seyreltin (ve bir OD in vivo deneyler için 1.8, 600 (yaklaşık 3 x 10 8 koloni oluşturan birim (CFU) S. aureus / ml&#39;ye karşılık gelir) PBS içinde S. aureus için yaklaşık olarak 1 x 10 9 CFU / mL) karşılık gelir. Alüminyum folyo ile ışıktan koruyunuz tüpler buz üzerinde bırakın. </li></ol> 2. İn Vitro Perfüzyon Deneyleri <ol><li> Cam lameller kaplanması <ol><li> Laboratuvar sınıfı su içinde von Willebrand faktörü (vWF) (Haemate P stok konsantrasyonu 2400 ug / ml) ile seyreltilir, 50 ug / ml nihai konsantrasyona kadar (damıtılmış deiyonize). </li><li> 160 ug / ml bir son konsantrasyona kadar (üretici tarafından sağlanan gibi, SKF çözeltisi, pH 2.7-2.9), izotonik glikoz çözeltisinde kollajen seyreltin. </li><li> Parafilm üzerindeki kaplamanın 200 ul bırakarak ve damlacık üstüne lamel yerleştirin tarafından VWF&#39;nin veya kollajen ile kaplayın cam lamelleri (24 × 50 mm). damlacık lamel yüzeyi boyunca yayılacak. </li><li> Oda sıcaklığında 4 saat boyunca nemlendirilmiş bir kap içinde lamel inkübe edin. Dikkatle künt bir iğne ile parafilm gelen lamelleri kaldırın. Akış odasının alt kısmında lamel monte edin. </li></ol></li><li> Plastik Kaplama Endotel Hücreleri ile Fiş <ol><li> Coat plastik makbuzları(1-çukurlu PCA hücre kültür odası, Sarstedt, Almanya) PBS içinde% 1 jelatin çözeltisi, 1 ml ve 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edilir. Jelatin kaplı plastik makbuzları Tohum insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC&#39;ler), ve 70-80% konfluansa kadar bunları büyür. Akış odasının alt kısmında plastik kayma monte edin. </li></ol></li><li> Perfüzyon Deney Not: In vitro perfüzyon modeli şematik bir genel görünüşü Şekil 1&#39;de gösterilmiştir. <ol><li> Farklı fizyolojik akış koşullarını simüle etmek için 2.5 din / cm2 ve 20 din / cm2 arasında bir laminer kesme stresinde mikro paralel plaka akış odasının in vitro bakteriyel yapışma çalışmaları gerçekleştirin. </li><li> Akış odası (in-house tasarım) bir metal çerçeve ve pleksiglas yapılmış bir perfüzyon odasına (poli (metil) (PMMA)) oluşur. Yüksek doğruluk infüzyon pompası (PHD 2000 İnfüzyon, Harvard Aparatı, ABD) bağlayarak, biz akış ra üretebilir0.0001 ul / dk ve 220,82 ml / dk tes. </li><li> Akış odasının üst kısmına boru bağlayın ve tüp orta enjekte. Yavaşça taban kısmının üst akış bölmesinin üst kısmı yerleştirin ve akış odası monte edin. Hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli olun. Odacık sızıntı olmadığından emin olmak için ve fazla kaplama çözümü kaldırmak için haznesinden orta 1 ml enjekte edilir. Hava kabarcıkları kaçının. </li><li> Bir mikroskop tepsiye 37 ° C&#39;de bir termo-kontrollü ısıtma yastığı fare yerleştirin. Bu, bir terminal işlemi olduğu için, sıkı asceptic işlemleri için bir ihtiyaç vardır. Şahdamarından yakın bir kesi yapmak, nazikçe servikal kas sağ tarafını kaldırın ve çevre dokudan juguler ven izole. </li><li> Infüzyon pompası ve floresan mikroskop ayarlayın. İnfüzyon pompası ayarları şırınga çapı ve istenilen debi (Bölüm 2.4 bakınız) bağlıdır. Şu andan itibaren, karanlık bir odada çalışıyoruz. </li><li> VWF Kaplama: <ol><li> Flüoresan etiketli bakteriler ile bir şırınga doldurun ve giriş borusu bağlayın. Hava kabarcıkları kaçının. 10 dakika infüzyon Pompayı çalıştırın. İnfüzyon süresi kullanılan kesme hızı ve kaplamanın, bakteri ve ortama bağlıdır ve yapışma sürekli durumunu temsil etmelidir. </li><li> 10 dakika sonra, giriş tüpü PBS ile bir şırınga bağlanması ve infüzyon pompası başlayarak bağlanmamış bakterileri uzak yıkayın. </li><li> Yıkama işleminden sonra farklı yerlerde en az 15 fotoğraf veya film çekin. Bakteriler odaklanmak, küçük ve potansiyel güçtür. In vitro olarak akış Deneyden önce, uygun bir odak düzlemi, bir lamel flüoresan etiketli bakteriler bir damlasının yerleştirilmesiyle ve akış odası içinde lamel yerleştirerek elde edilebilir. Ardından, uygun odak düzlemi aramak ve ayarları kaydedin. NOT: in vitro akış deney sırasında, yıkama aşamasında fotoğraf çekimi (başladıktan sonra ± 5 dakika) sağlayan sadeceyapışık bakteriler için sinyal yakalanır. </li></ol></li><li> Kollajen Kaplama: <ol><li> Sadece perfüzyon başlamadan önce floresan etiketli bakteri 60 ug / ml VWF ekleyin. 60 ug / ml ile takviye edilmiş VWF floresan etiketli bakteriler ya da flüoresan etiketli bakteriler ile bir şırınga doldurun ve giriş borusu bağlayın. Hava kabarcıkları kaçının. Tekrarlayın 2.3.5.2 2.3.5.3 adımları </li></ol></li><li> Endotel Hücreleri: <ol><li> Ca + 2 -ionophore A23187 bir 0.1 mM çözeltisi ile perfüzyon ile endotel hücrelerini aktive bir perfüzyon yoluyla, 10 dakika boyunca bakteriyel perfüzyon aynı kesme oranında DMEM (stok çözelti, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülmüştür, 10 mM) 0.1 mM. Tekrarlayın 2.3.5.3 Kalorifer kadar 2.3.5.2 adımları. </li></ol></li></ol></li><li> Aşağıdaki gibi kayma hızı ve kayma gerilmesi hesaplayın. Kayma hızı = 6Q / wh 2 Q: a ml / dak oranı, akış: cm genişlik, H: cm yükseklik Kesme gerilmesi (τ) = kayma sıçanEski viskozite (μ) Nerede μ: Ortam: 0.01 din x sn / cm2, tam kan: 0,04 din x sn / cm2 </li><li> Görüntü analizi <ol><li> Siyah beyaz kamera ile ters bir floresan mikroskop kullanılarak canlı görüntüleri elde etmek ve görüntüleme yazılımı kullanarak geliştirmek. 1.5 sn pozlama süresini kullanın. Rastgele akış odasının kaplanmış yüzeye yayılmış çoklu fotoğraf (en az 15) alın ve uygun dosya biçiminde kaydedebilirsiniz. </li><li> ImageJ ile görüntü analizi yapın. Ve ilgi özelliklerine içine gri tonlu görüntüleri segmentlere, alt ve üst eşik değerlerini ayarlamak için eşiğini tanımlamak - Görüntünün (substract Arkaplan Süreci) pürüzsüz, sürekli arka kaldırmak için arka plan çıkarın. Eşik sınırlı alanı ölçün. </li><li> Bakteriyel yapışma karşılaştırın, istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak, örneğin flüoresan alanı olarak ifade edilir. Tek yönlü ANOVA veya t kullanan gruplar karşılaştırwo kuyruklu Student t testi. Ortalama (SEM) ortalama ± standart hata olarak tüm değerleri bildirin. Önemli &lt;0.05 p değeri düşünün (* p &lt;0.05; ** p &lt;0.01; *** p &lt;0.001). </li></ol></li></ol> Vivo Mezenterik Perfüzyon Modeli 3. <ol><li> Farenin Hazırlama / cerrahi <ol><li> Bağırsak hareketi sınırlamak amacıyla deney gece önce fare Hızlı. </li><li> Buprenorfın bir deri altı enjeksiyon cerrahi öncesi (0.1 mg / kg vücut ağırlığı (BW)) 20-30 dk ile 6-8 haftalık fare (C57Bl / 6) ameliyat öncesi analjezi ver. </li><li> Intra-peritoneal ketamin enjeksiyonu (125 mg / kg BW) ve xylazine (12.5 mg / kg BW) tarafından fare anestezisi. Pedal refleks edin. Kuruluğunu önlemek için veteriner merhem sürün. </li><li> Bir mikroskop tepsiye 37 ° C&#39;de bir termo-kontrollü ısıtma yastığı fare yerleştirin. Bu, bir terminal işlemi olduğu için, sıkı ascepti için bir ihtiyaç vardırc prosedürleri. Şahdamarından yakın bir kesi yapmak, nazikçe servikal kas sağ tarafını kaldırın ve çevre dokudan juguler ven izole. </li><li> Floresan etiketli bakteriler ya da diğer çözeltiler infüzyonu için sağ boyun damarına bir 2 Fransız kateter yerleştirin. Orta hat insizyon aracılığıyla periton boşluğuna açın ve Mezenterium yaymak için pamuklu çubuklarla kullanabilir ve mezenterik arteryolar ve venüler dolaşımını görselleştirmek için. </li><li> Şeffaf bir plaka üzerinde sağ tarafta fare yerleştirin ve bantla kanül sabitleyin. Hipotermi önlemek için sıcak bir takımı kullanınız. Doku kaybını önlemek için, bağırsakların 500 ul% 0.9 NaCl bırakın. </li></ol></li><li> Mezenterik dolaşıma bakteriyel yapışma floresan mikroskopi <ol><li> Karanlık bir odada çalışın. Damarları hareketsiz ve ters bir mikroskop altında görselleştirmek için pamuklu çubuklarla kullanın. </li><li> Topikal bir 10 mM&#39;lik bir çözeltisi, O 5 ul geçerlidirf Ca 2 + -ionophore A23187 DMSO içinde çözülmüştür. 10 saniye sonra, juguler kateter yoluyla bakteri etiketli 100 ul (adım 1) enjekte edilir. Time-lapse fotoğraf çekmek. Deney bittikten sonra, kurumsal onaylı kurallarına göre fare euthanize. </li></ol></li><li> Görüntü Analizi <ol><li> Siyah beyaz kamera kullanarak herhangi bir görüntüleme yazılımı kullanılarak geliştirilen yakalanan bir ters floresan mikroskop kullanarak canlı görüntüleri edinin. Otomatik pozlama süresini ve kullanılan ekipman özel kontrast optimizasyonu uygulayın. </li><li> 1000 images / sn 40 döngü kullanarak - araç çubuğunda &#39;Toplama&#39; aracını (Zaman çok boyutlu Devralmalar) kullanarak time-lapse görüntüleri edinin. Uygun bir görüntü dosyası formatında görüntü kaydetmek. </li><li> Görüntü başına floresan sinyal alanı ölçmek için ImageJ analiz yazılımı kullanılarak işlem ve görüntüler. F içine gri tonlu görüntüleri segmentlere, alt ve üst eşik değerlerini ayarlamak için eşik tanımlayınilgi eatures. Faiz (kan damarı) bölgesini tespit ve eşik ve ilgi bölgeye sınırlı alanı ölçün. Bakteriyel yapışma karşılaştırın, herhangi bir istatistik veya grafik yazılımı kullanarak floresan alan olarak ifade edilmiştir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis.">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li><li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis:+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells.">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor&#8211;binding+protein.">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor&#8211;binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li><li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves.">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li><li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin,+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin.">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li><li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+activated+platelets+assist+THP-1+monocytoid/endothelial+cell+interaction+under+shear+stress.">Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress.</a> Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).</li><li>Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+von+Willebrand+factor-binding+protein+(vWbp)+of+Staphylococcus+aureus+is+a+coagulase.">The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase.</a> FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).</li><li>Friedrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylocoagulase+is+a+prototype+for+the+mechanism+of+cofactor-induced+zymogen+activation.">Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation.</a> Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+formation+by+staphylothrombin+facilitates+Staphylococcus+aureus-induced+platelet+aggregation.">Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+staphylothrombin-mediated+fibrin+deposition+in+catheter-related+Staphylococcus+aureus+infections.">The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections.</a> J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).</li><li>Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kesme gerilmesi damar duvarına erken bakteriyel yapışma ve endovasküler veya endokardiyal vejetasyon ve metastatik enfeksiyonların 4,5 müteakip nesil için çok önemli bir faktördür. Fizyolojik makaslama gerilimi altında endovasküler enfeksiyonların hastalık oluşumunun incelenmesinde, in vitro ve in vivo modellerde tamamlayıcı tarif. Bu modeller bize büyük S. olarak von Willebrand faktör bağlayıcı protein (vWbp) tanımlamak için izin aureus protein VWF 4 açığa yaralı bir damar duvar ile akış altında etkileşim. Endovasküler enfeksiyonları ve özellikle enfektif endokardit, aynı zamanda, çünkü yerel ve uzak (&#39;metastatik&#39;), komplikasyon, çünkü sadece sepsis kaynaklı organ yetmezliği ve ölüm endişe vardır. Enfektif endokardit ve metastatik enfeksiyonlara neden için, bakteri damar duvarına yapışır ve böylece kan akan kayma gerilmesi karşı zorunda. Çoğubakteriler üzerinde çalışmalar faktörleri statik koşullarda yapılmıştır virülansa. Ancak, bu kurulan etkileşimleri bakteri-konak etkileşimi yeni, daha önceden tanınmayan faktörleri ortaya çıkarabilir akış şartlarında kesme kuvvetlerini ve çalışmalar dayanacak olmayabilir. Mikro paralel bir akış odasından kullanarak, ve diğerleri, vasküler yapışma VWF önem taşıdığını göstermiştir. Makaslama stres altında giderek Unfolds dinlenme küresel yapıdan VWF ve onun GPIb reseptörü 6 vasıtasıyla trombositler ile etkileşime A1 alanını ortaya çıkarır. Akış odaları yoğun trombosit fonksiyonu 7 incelemek için kullanılmıştır. Dikkate değer, ayrıca S. akış altında aureus yapışma kesme sırasında maruz A1 etki VWF gerektirir, ve özellikle. Biz vWbp VWF bağlayıcı arabuluculuk belirledi. vWbp S. katkıda bulunan bir koagülaz olduğunu Ev sahibinin protrombini aktive ederek aureus patofizyoloji. Staphylothrombin, resbakteriyel Koagulaz ve protrombin kompleksi ulting, çözünmeyen fibrin 8,9 içine fibrinojen dönüştürür. Çalışmalarımız vWbp sadece protrombini aktive etmediğini göstermiştir, ancak akış 4,10,11 altında kan damarlarının yapışmasını geliştirmek bakteri fibrin-trombosit agrega, oluşumunu tetikler var. in vitro akış odası modeli hücresel veya matris bileşenleri bakteriyel yapışma farklı oyuncuları çalışma sağlar. Bakteriyel virülans faktörleri spesifik yüzey proteinleri ifade mutantlar veya zararsız bakteriler kullanılarak incelenebilir. Seçenek olarak ise, farmakolojik inhibitörleri ya da bloke edici antikorlar, akış odasının ortama ilave edilebilir. gibi hücre dışı matrisin farklı bileşenler olarak ana faktörlerin rolü farklı kaplamalar ile lamelleri kullanılarak incelenebilir. lamelleri da aktivasyon durumu spesifik stimülatörlerinin eklenerek modüle edilebilir olan endotel hücreleri ile kaplı olabilir. Apavasküler duvar RT konakçı kan hücreleri ve plazma proteinlerinin katkısı akan ortam için bu faktörleri eklenerek incelenebilir. Böylece, artan karmaşıklık farklı koşullar bakteri in vivo damar duvarına yapışma sağlayan etkileşimleri çözülmeye laminer akış standart koşullar altında incelenebilir. In vitro modelde tanımlanan etkileşimi, daha sonra, bir organizma içindeki önemini test etmek için bir hayvan modelinde incelenmiştir. Akış altında dinamik etkileşimler üzerinde çalışmak için in vivo modeller tür diğer hamsteri dorsal deri altı bölme 12 ve cremaster modeli 13 olarak tarif edilmiştir. Buna karşılık, burada açıklanan mezenterik perfüzyon modeli, olasılık farelerin genetik arka plan ev sahipliği değişir ve farmakolojik müdahalelerin değerlendirilmesi nedeniyle kullanım kolaylığı ve çeşitli avantajlar sunuyor. Sonuç olarak, modeller tarifS. sadece yüzey proteinleri çalışma imkanı sunuyoruz aureus, ancak farklı konakçı geçmişleri diğer birçok mikroorganizma, daha iyi damar enfeksiyonlarının patogenezi anlamak için.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:192pt">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21878-25MG-F</td>
			<td>fluorescent labeling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roch</td>
			<td colspan="2">10 735 086 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>PL 15036/0010</td>
			<td>VWF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horm collagen</td>
			<td>Takeda</td>
			<td align="right">10500</td>
			<td>collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well PCA cell culture chambers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="center" class="xl63">########</td>
			<td>plastic slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td align="right">283716</td>
			<td>bruprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td>
			<td>Eurovet</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td>ketamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td>
			<td>VMD Arendonk</td>
			<td>BE-V170581</td>
			<td>xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 french intravenous catheter green</td>
			<td>Portex</td>
			<td colspan="2">200/300/010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>W7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>International Medical Product</td>
			<td align="right">300230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-ionophore solution A23187</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C7522-10 MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160; with needle</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300015</td>
			<td>intra-peritoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td colspan="2">5811 000.320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips (24x50)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BB02405A11</td>
			<td>Thickness No, 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Infusion</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">702100</td>
			<td>High-accuracy Harvard infusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-observer DI</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institute of Health</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5,0</td>
			<td colspan="2">Graphpad Software</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss&#160;</td>
			<td>Black and white camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

Endovasküler enfeksiyonları ve infektif endokardit neden olmak için, bakteriler, kan akışı kesme stresine maruz kalma sırasında damar duvarına yapışma mümkün olması gerekmektedir. Mikroorganizmaların damar yapışmasına katkıda bakteriyel ve konakçı faktörleri belirlemek için, fizyolojik kayma koşulları altında bu etkileşimleri çalışmak uygun modeller ihtiyaç vardır. Burada, biz ekstraselüler matriksin farklı bileşenleri bakteriyel yapışma araştırmak ya da endotel hücrelerine sağlayan bir in vitro akış odası modeli tarif ve geliştirilmiş bir intravital mikroskopi modeli doğrudan in vivo splanknik dolaşıma bakterilerin ilk yapışma görselleştirmek için . Bu yöntemler akışı altında bakteri yapışma için gerekli bakteriyel ve ana faktörleri tanımlamak için kullanılabilir. Biz kayma gerilmesi alaka ve staphy yapışması için von Willebrand faktör rolünü göstermektedirlococcus aureus, hem in vitro hem de in vivo modelinde kullanılmıştır.

VWF S. aureus yapışma, subendotelyal matriks ve endotel hücreleri bir kayma gerilmesi bağımlı bir olgudur S. arasındaki etkileşimde kayma gerilmesi rolünü vurgulamak için aureus ve vWF, farklı kayma hızlarında ile kaplanmış kapak sliplerine (in vitro perfüzyon modeli şematik bir genel S. aureus 1. Yapışma 250 sn arasında artan kesme oranlarında arttığı vWF Şekil verilmiştir -1 2.000 VWF fazla perfüzyonunu gerçekleştirilen sn-1 (Şekil 2), yüksek kesme kuvvetleri önleyen fakat VWF bakterilerin yapışmasını güçlendirmek yok olduğuna işaret etmektedir. Kollajen bakteriyel yapışma VWF katkısını araştırmak amacıyla, subendotelyal matrisinin başlıca bileşeni olan biz floresan etiketli S. perfüze VWF varlığında veya yokluğunda kolajen üzerindeki aureus. VWF, S. yapışma yokluğunda birkolajen ureus kesme oranları arttıkça azalmıştır. Bununla birlikte, VWF ortam içinde mevcut olduklarında olduğunu, S. yapışması aureus kayma oranları (Şekil 3) birlikte artmaktadır. In vitro akış modeli aynı zamanda akış altında endotel hücrelerine bakterilerin yapışmasını incelemek için bize izin verir. Biz HUVECler ile floresan S. etiketli perfüze kayma hızlarında 500 ila 2,000 sn aureus -1. Burada, belirtilen HUVECler VWF salınmasına neden olmak için, bir Ca2 + -ionophore ile aktive edildi. Endotel hücre aktivasyonu ve ardından VWF salma, S. artan yapışması Tipik &quot;dizge&quot; gibi desenler oluşturulmuş aureus (Şekil 4A), floresan doğrusal gerilmiş VWF molekülü boyunca bakteri bağlanmasını gösteren kesme kuvveti (Şekil 4B) yönünde hizalanmış bakteriyel kümeler, etiketli. Başlangıç ​​in vivosplanknik damarlarındaki bakteriyel yapışma VWF aracılık eder S. yana in vivo olarak aktif damar duvarına bakteriyel yapışmayı araştırılması - (- / vWF) aureus VWF bağlı mümkün olduğu için, (vWF + / +) ve vWF-eksikli farenin vahşi tipli fare kullanılır. Splanknik venlerin Gerçek zamanlı videomikroskopi floresan S. etiketli dolaşımdaki in vivo görselleştirme izin aureus (in vivo perfüzyon modeli şematik genel görünüşü Şekil 5&#39;de temsil edilmiştir) hazırlandı. Ca + 2 -ionophore tarafından endotelyumun farmakolojik aktivasyonu sonra WT farelerinde damar duvarına tek tek bakteri ve bakterinin agrega hızlı yerel birikimi gözlendi (ek video 1 ve 2). Bakteriler hemen hemen hiç bir yapışma vWF -deficie aktive damar duvarı izlendint fareleri (ek video 3) WT farelerde yapışma ile karşılaştırıldığında (Şekil 6). VWF yokluğu S. yeteneği azalır aureus aktif damar duvarına yapışma. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Şekil 1 in vitro olarak akış modelinin şematik bir temsili., In vitro akışı modeli, subendotelyal matrise bakteriyel yapışma gibi farklı kesme bağımlı mekanizmaların çalışmasını sağlayan bir çok fonksiyonlu bir model, ama aynı zamanda oluşumu trombus. Mikro paralel bir akış odasından proteinleri ve endotel hücrelerinin, farklı kaplamalar ile bir lamel (plastik veya cam) üzerine yerleştirilir. Farklı bakterilerin (turuncu ve siyah nokta) yapışması analiz edilebilir ve plazma proteinleri, trombositler ve tam kan varlığında etkisi değerlendirilebilir. Trombositlerin (mavi oval) ya da fibrinog için fluoresan işaretleyicilertr (mavi şeritler), bakteriyel ve ana faktörleri ayırt farklı önleyicileri (siyah ovaller) ile kombinasyon halinde de kullanılabilir. S. bakteriyel yapışma Temsilcisi görüntüleri VWF&#39;nin varlığı (altta) kollajen kaplama ya da yokluğu (üst) aureus (ölçek çubuğu 100 mikron olan) gösterilmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> S. Şekil 2. Yapışma makaslama oranlarının artırılması ile VWF artar aureus. kaplanmış VWF üzerinde Mikro-paralel akış odası perfüzyon (/ ml 50 ug) ile floresan S. etiketli orta 250 sn -1 (sn -1) 2,000 makaslama oranları (n&gt; 5) de aureus Newman. Tüm sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> S. Şekil 3. Yapıştırma subendotelyuma aureus kayma ve VWF bağlıdır. ile floresan etiketli S. Kaplı kollajen (160 ug / ml) üzerindeki mikro-paralel bir akış odasından perfüzyon orta 250 sn 2,000 -1 makaslama oranları (n&gt; 5) de aureus Newman. Aksi belirtilmediği VWF (60 ug / ml), ortam içinde mevcuttu. Tüm sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. ** P &lt;0.01. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> S. Şekil 4. yapışması aktive endotel hücrelerine aureus endotel hücreleri üzerinde kayma bağımlı. Mikro paralel akış odası perfüzyon olduğunu. (A) insan göbek damar endothelial hücreleri Ca + 2 -ionophore A ile aktive edildiFloresan etiketli S. 10 dakika perfüzyon takiben 23.187 (0.1 mM) orta 500 sn 2,000 -1 makaslama oranları (n&gt; 5) de aureus Newman. Tüm sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. * P &lt;0.05. S ile aktive edilmiş HUVEC üzerinde mikro paralel bir akış odasından perfüzyon (B) Görüntü 1000 saniyelik bir kesme hızında -2. S. de aureus aureus VWF multimerleri yapışma (ölçek çubuğu 100 mikron olan) düşündüren, ± 200 mikron uzunluğunda dizeleri oluşturur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Şekil 5. in vivo mezenterik perfüzyon modelinin şematik bir bakış. Sağ juguler ven kateteri (sarı hat) flor uygulaması için eklenirescently etiketli bakteriler (turuncu nokta) ilave anestetikler ya da farmasötik inhibitörleri ve antikorlar gibi diğer bileşenler. periton boşluğu açıldı ve Mezenterium flöresanlı bir mikroskop altında kan damarları (venöz ve arteriyel) görselleştirmek için yayılır. VWF salınmasını uyaran bir Ca2 + -ionophore tarafından endotelyumun farmakolojik hale getirilmesinden sonra, bakteriler jugular damar kateteri yoluyla enjekte edilebilir. Gerçek zamanlı intravasküler bir video mikroskobu floresan etiketli bakteri dolaşan in vivo görselleştirme ve bakteri-trombosit trombüs çıkan oluşum. Tanır <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Şekil 6. S. ilk yapışma aureus- / - farelerin., in vivo ortamda aktive edilmiş endotele C57BL / 6, vWF + / + ve C57BL / 6-VWF VWF in vivo venöz mezenterik perfüzyon modeli tarafından aracılık etmek. Yapışma floresan etiketli S. / - - fareler yerel aktif damar duvarına aureus vWf anlamlı derecede düşük olduğunu. Tüm sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilmiştir. *** P &lt;0.001, n&gt; 7. <img alt="Video Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Video 1: S. Gerçek zamanlı yapışma aureus vWf + / + farelerde aktive damar duvarına. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Video 2: Gerçek zamanlı toplu oluşumu ve S. embolizasyon aureus vWf + / + farelerde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3, video" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Video 3: S. Gerçek zamanlı yapışma - / - farelerde - / -. vWF + / + ve VWF farelerde in vivo mezenterik perfüzyon modelinde aureus vWF aktif damar duvarına. Bir Ca2 + -ionophore (10 mM) Beş ul başvurunun oldugörüntülenmiştir vasküler yatağın bölgeye ed. Karboksi-floresin etiketli S. içindeki bir aureus, juguler kateter aracılığıyla enjekte edilmiştir. mezenterik dolaşım ters bir mikroskop altında görüntülendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

in-vitro-vivo-model-to-study-bacterial-adhesion-to-vessel-wall-under

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.5K Görüntüleme.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

Video: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Bakteriyel Yapışma Çalışma Kesme Stres Tanıtımı

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Insanlaşmış Fare Modeli mikrovaskülatürde Hedefleme Bakteriyel Enfeksiyonlar Eğitim için

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Vitronectin bakteriyel yapışma ve Serum direnç rolü eğitim için deneyleri

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...