Yazarlar Zebra balığı bakımı ve bakım için laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, EA HARVIE Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü A155397 ve Anna Huttenlocher NIH R01GM074827 tarafından desteklenmiştir.

Yetişkin ve embriyonik zebra balığı Wisconsin-Madison Araştırma Hayvan Kaynakları Merkezi Üniversitesi uyarınca tutuldu. 1. Mikroenjeksiyon İğneleri hazırlanması <ol><li> Çekme 5, hava zaman başında, hız 80, zaman 70, hava saati, hava basıncı 200, ısı 502 90 çekin: Aşağıdaki ayarlarla bir mikropipet çektirmesi cihazı kullanılarak ince duvar cam kılcal enjeksiyon iğneler (1.0 OD / 0.75 ID) hazırlayın çekme 5 sonunda. </li><li> Ucu açıklığı yaklaşık 10 mikron bir çapa sahip olacak şekilde çekilmiş iğne ucu kesiyorum, ince cımbız kullanarak. </li></ol> 2. hazırlanması Larva Enjeksiyon Yemekleri <ol><li> Steril su içinde yaklaşık 4-5 mm şerit genişliği ile bir jel tarağı durulayın ve kurumaya bırakın. </li><li> Çözelti berraklaşıncaya kadar E3 orta 19 ve mikrodalgada% 1.5-2, yüksek erime sıcaklığı olan agaroz çözelti hazırlayın. Soğutulmuş sonra, bir Petri kutusu (100 x 15 mm), girdap içine agaroz bazı dökünyeterli agaroz ekleyerek tamamen çanak alt kapsayacak. </li><li> Agaroz tabaka katılaşmış sonra olmayan penye sonu sadece Petri kabı üstünde dinlenme ve penye son agaroz dokunmadan böylece, üstüne durulanır ve kurutulur jel tarağı yerleştirin. Alt agaroz tabakası ile ilgili 30 ° açı oluşturarak, tarak mümkün olduğunca yatay olduğundan emin olun. </li><li> Taze agaroz katman petek kuyuları kapsayacak şekilde tarak ve alt katmanda agaroz arasındaki arayüzde agaroz ek bir miktar dökün. Tarağı çıkarmadan önce tamamen soğumasını bekleyin. Bir pipet ucu kullanarak, kuyulardan agaroz herhangi sarkan parçalarını çıkartın. </li><li> 4 ° C &#39;de enjeksiyon kalıp ve deponun üst E3 orta dökün. </li><li> Her kullanımdan önce, enjeksiyondan önce, en azından bir saat için 28.5 ° C&#39;da taze ortam ve sıcak enjeksiyon rampaları ile değiştirin. </li><li> Hemen önce enjeksiyonları, enjeksiyon rampası E3 yerine200 ug / ml, etil 3-aminobenzoat (tricaine) ihtiva eden E3 ortamı. </li></ol> 3. S. hazırlanması iniae Aşı <ol><li> % 0.2 maya ekstresi ve% 2 proteoz pepton (THY + P) ile takviye edilmiş, Todd Hewitt brotu ortamı hazırlamak ve otoklav: 30 g / L, Todd Hewitt, 2 g / L maya ekstresi, 20 g / L proteoz pepton. Agar plakaları için, 14 g / L agar ekleyin. </li><li> Kapalı bir 15 ml tüp içinde THY + U suyu 10 ml donmuş bakteri stokunun 100 ul kısım pipetleme enfeksiyonlar önce, bakteri kültürleri gece hazırlayın. 37 ° C&#39;de çalkalama olmadan gece boyunca inkübe edin. Büyüme 14-16 saat sonra, derin dondurucu stokları yapmak veya enjeksiyon kullanılmak üzere hazırlamak için ya gecede kültür kullanın. </li><li> 1.7 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içinde% 80 gliserol, 500 ul, gece boyunca kültürün 1 ml yerleştirerek dondurucu stokları olun. , Donma-erime döngülerinden kaçınmak -80 ° C&#39;de bu karışıma ve deposundan 100 ul tek kullanımlık alikotları sağlamak. </li><li> S. iniae infecti kullanılanTHY + U suyu 9.9 ml, gece boyunca kültürün 0.1 mi eklenerek 10 mi kültür toplam hacim 100: ons, gece boyunca kültürün 1 seyreltin. Yaklaşık 4-5 saat boyunca ajitasyon olmadan 37 ° C&#39;de büyür. Nanodrop spektrofotometre kullanılarak 600 nm&#39;de optik yoğunluk (OD) Monitör ve OD600&#39;e nm 0,250-0,500 ulaştığında orta-logaritmik fazda bakteri hasat. 0.250 arasında bir OD600 nm yaklaşık olarak 10 8 koloni oluşturan birim (CFU) / ml sine tekabül eder. </li><li> 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de 1,7 ml santrifüj tüpü içinde bakteri kültürü 1 ml Pelet. Taze PBS ve tekrarın 1 ml süspanse. PBS içinde bakteri OD600 nm ölçün, PBS içinde topak ve tekrar süspansiyon, istenen konsantrasyon elde etmek. </li><li> Mikroenjeksiyon görselleştirilmesine yardımcı% 0.1 bir son konsantrasyona için enjeksiyondan önce bakteriyel süspansiyonlar, kırmızı fenol ekleyin. </li><li> Isı ile öldürülmüş bakterilerin enjeksiyonunu içeren deneyler için, 30 dakika boyunca 95 ° C de PBS içinde bakteri ısıtın.Isı-öldürme işlemi katı THY + U agar plakaları üzerinde bir enjeksiyon hacmi (yaklaşık olarak 1 nl) kaplama ve 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edilerek tespit edilemez seviyelere canlı bakteri sayısını azalttığını emin olun. </li></ol> 4. Etiketleme S. Bir CellTracker kırmızı bir floresan boya ile Inia E <ol><li> Bakteriyel canlı hücreler etiketlemek için, bir CellTracker flüoresan boya veya eşdeğer bir stok solüsyonu hazırlanır. Kullanılan bir boya tozunun 20 x 50 ug parçalar halinde gelir ve DMSO içinde yeniden süspansiyon haline getirildi gereken zamanda, bir 10 mM stok konsantrasyonu elde etmek üzere tüpe ul DMSO 7.3 ekleyin. </li><li> Hücreleri boyayan düşük optimal konsantrasyonunu belirlemek için bakteriler üzerinde boya konsantrasyonları (örneğin, 0,5-25 uM), bir dizi test edin. Hızla bölünen hücreler ve daha uzun deney boyanın daha yüksek bir konsantrasyon gerekebilir. <ol><li> (Bölüm 3) yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj ile 1.7 ml tüp içinde bakteri kültürü 1.0 ml pelet. 1 pelet yeniden süspanseTaze PBS ml ve bakteri kültürüne boya uygun hacim ekleyin. </li><li> 30 dakika süreyle 37 ° C&#39;de çalkalama olmaksızın inkübe edin. Önceden ısıtılmış THY + U suyu, 1 ml bakteri ve tekrar süspansiyon Spin ve 37 ° C&#39;de ek bir 30 dakika boyunca çalkalama olmaksızın inkübe edin. </li><li> Bakterileri aşağı spin ve OD600&#39;e nm ölçme ve (bölüm 3) Yukarıda ayrıntılı olarak mikroenjeksiyon için bakterileri seyreltilmesi önce PBS içinde iki kez yıkayın. Biz genellikle lökosit işe ve fagositoz bizim çalışmaları için 1 nl enjeksiyon hacmi yaklaşık 100 CFU enjekte. </li></ol></li></ol> Enfeksiyonlar için Zebra balığı Larva 5. hazırlanması <ol><li> Önceki gece üreyen kurmak ve enfekte hazır olana kadar 28.5 ° C E3 ortamında Rosen ve ark. 27 inkübe embriyolar tarafından açıklanan embriyolar toplamak. </li><li> Yansıması olacak Zebra balığı için, N-feniltiyoüre (PTU) ekleyerek pigment (melanizm) gelişimini önlemek0.2 nM&#39;lik bir son konsantrasyon için 24 saat sonra fertilizasyon (HPF) ile E3 ortamı. </li><li> Embriyoların içeren enfeksiyonlarında elle ince bir cımbız ile, dechorionate embriyolar 2 dpf yaş. Seçenek olarak ise, E3 ayrılması ve yaklaşık 5 dakika için ya da yumuşak pipetleme kadar Pronaz (2 mg / ml) ile değiştirerek dechorionate embriyolar koryon üzerinden embriyolar keser. Çoğu Larvalar 3 dpf&#39;e tarafından doğal yumurtadan olmalıdır. </li><li> 200 ug / ml tricaine ihtiva E3 ortam içine dechorionated larvaları yerleştirerek enfeksiyon öncesinde zebra balığı birkaç dakika anestezisi. </li></ol> S. 6. Kulakla Vesikül Enjeksiyon Üç Gün Eski Larva içine iniae <ol><li> Mikropüskürtücü açın ve &quot;milisaniye&quot; zaman aralığını ayarlayın. Hattına gaz izin karbondioksit tankı üzerindeki valfi açın. mikropüskürtücü basıncı yaklaşık 20 PSI okumalısınız. Artır siyah tırtıllı topuzu saat yönünde döndürülmesi ile mikropüskürtücü ünitesinde basıncını ayarlayınazalmış basınç dönüm yönünün tersine basınç veya hafifletti. </li><li> Hazırlanan S. vorteks fenol kırmızısı ve PBS ve Microloader ucu kullanın içinde iniae kültür çekti kılcal enjeksiyon iğne içine kültür 2-3 ul yüklemek için. </li><li> İğne mikroskop tabana göre 45-65 ° bir açı yaklaşık şekilde bir stereo mikroskop altında manyetik bir stand ve konum olarak bağlı bir mikromanipülatör yüklü iğne monte edin. </li><li> Mikropüskürtücü ayak pedalına basın iğne ucu üzerine inokulum bir damla dağıtmak için. Mikroskop göz lens ölçek çubuğunu kullanarak damla çapını ölçün. <ol><li> Seçenek olarak ise, bir ölçek çubuğu ile cam bir mikroskop lamı üzerine bir mineral yağ damla bir hacim enjekte edilerek damla çapı tahmin edilmektedir. damla çapı 1 Nl hacmi yaklaşık yaklaşık 0.10 mm olması gerekmektedir. </li><li> Ayarını süresini ayarlayarak damla boyutunu ayarlayınmikropüskürtücü veya ince cımbız ile iğne ucu daha kapalı kırpma yoluyla. Çok fazla doku hasarı oluşmasını önlemek için 35 msn - enjeksiyon süresi 20 arasında olması gerektiğini unutmayın. </li></ol></li><li> Plastik bir transfer pipeti kullanarak, nakil 12 enjeksiyon kalıbın her kuyuya larva anestezi. </li><li> Iyi sol tarafına karşı başları mikroskop ve yumurta sarısı kesesi arkasına doğru işaret böylece hafifçe larvaları konumlandırmak için bir cam çubuk, saç döngü veya plastik ucu kullanın. Tavana doğru larva kadar sol kulağını yöneltin. </li><li> Stereomikroskopta göz merceğinden bakıldığında, her iki görüş aynı alanda böylece otik vezikül ile yüklenen iğne sıraya mikromanipülatör düğmeleri kullanın. Pierce iğne ucu ile otik vezikül dış epitel tabakası böylece iğne ucu sadece vezikül içinde. </li><li> Ayak pedalına basın S. istenen dozu 1 nl enjekte iniae. Bir kullandığınızdan emin olunyeterince düşük basınç boşluğu yırtmak şekilde değil. Enjeksiyon başarılı olursa, kulak vezikül, ancak çevredeki doku, fenol kırmızı inokulum (Şekil 1 Ai) ile doldurmalısınız. Hemen enjeksiyon plakası herhangi bir yanlış enjekte balık çıkarın. </li><li> Dikkatle larva dışarı iğne geri çekin ve bir sonraki larva görünümünde böylece elle enjeksiyon plakasını taşıyın. 5X büyütme altında yapın. Not: iğne geri çekilme hayatta kalma ve lökosit işe sonuçlarını çarpık olabilir otik vezikül dışında bazı bakteri, birikimi neden olabilir. Bunu önlemek için, bu flüoresan boya etiketli bakteriler enjekte etmek ve görsel olarak meydana gelen herhangi bir larva kaldırmak için flüoresan mikroskop altında enjekte larvaları taranması tavsiye edilir. Doğru şekilde enjekte larvası (Şekil 1 &#39;Bi)&#39; de gösterilmiştir. </li><li> Enjeksiyon hacmi / inokulum deney boyunca aynı kalmasını sağlamak için, bakteriyel s damla enjekteHer 48. embriyo sonra steril PBS içinde 100 ul ihtiva eden bir 1.7 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne Askı. Enjeksiyon hacmi içinde CFU&#39;nun saptanması için bir gece boyunca 37 ° C&#39;de THY + U agar plakaları üzerinde 100 ul Plate. </li><li> Enjeksiyon rampası 12 larvaların tüm grup enjekte edildiğinde, dikkatle kuyulardan gelen larva kaldırmak ve yeni bir Petri kabı (35 x 10 mm 2) içine yerleştirmek için plastik bir transfer pipet kullanın. Tricaine çözüm çıkarın ve larva kurtarmak için izin yaklaşık 2 ml taze E3 ortamı ile değiştirin. </li><li> Pipet, 96 oyuklu bir plaka, tekli oyuklar içine larvaları enjekte edildi ve 28.5 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. Bu plakalar hayatta kalmak için zamanla larvaları Monitör veya görüntüleme veya CFU sayımları için daha sonra kaldırın. </li></ol> Nötrofiller 7. Sudan Black Boyama Not: Aşağıdaki adımlar yerine sürece orbital bir karıştırıcı üzerinde küçük bir petri kabının (35 x 10 mm 2) içinde, oda sıcaklığında yapılabilirherwise belirtti. Her bir aşama için kullanılan reaktif miktarı, tam larvaları kaplamak için yeterli miktarda bir sıvı ile tabak başına 2 mi, yaklaşık. <ol><li> Enfekte larva sabitlenmesi E3 orta kaldırmak ve PBS çözeltisi içinde bir buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit ile değiştirmek için bir cam Pasteur pipet kullanın. Hemen ötenazi 4 ° C &#39;de balık yerleştirin. 4 ° C de bir gece düzeltildi. </li><li> 5 dakika her biri için PBS içinde 3 kez yıkanır. </li><li> 5 saat 30 dakika boyunca Sudan Siyahı Leke (% 70 etanol,% 0.1 fenol, 5% 0.18 stok 1 seyreltilmiş). Nötrofil granüller leke almış olmadığını kontrol etmek için bir stereomikroskopta kullanın. </li><li> PBS içinde bir son yıkama olarak% 70 etanol ve PBS 1 oranında bir 1: tek yıkama olarak% 70 etanol içinde tek bir yıkama ile başlayan 5 dakika bir dizi yıkama yapın. </li><li> PBS artı% 0.1 tween (PBT) içine rehydrate. </li><li> Larvaları pigment temizlemek için, yaklaşık 6-10 dakika için% 1 potasyum hidroksit /% 1 hidrojen peroksit yıkayın. Örnek closel Monitöry ve yaklaşık 5 dakika sonra, temizlenmiş ne kadar pigment görmek için bir stereo mikroskop altında larvaları kontrol edin. Çözüm çok uzun kalırsa, yumurta sarısı keseleri şişer ve patlama olacaktır. </li><li> PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez her yıkayın. </li><li> Görüntü hazır olana kadar 1 hafta kadar 4 ° C de PBS veya PBT ya örnekleri saklayın ve sayılır. </li><li> Görüntü Sudan Siyah-lekeli larva için, PBT içine balık transferi ve daha sonra% 80 gliserol içine ve bir tek kavite depresyon slayt üzerine yerleştirin. Pozisyon bir pipet kullanarak bir stereo mikroskop altında larvaları sabit. Bir stereomikroskop üzerine (Şekil 1 Aii-iv) renkli dijital kamerayı kullanarak resim. </li></ol> Enfekte Larvalarına gelen geçerli Bakteri 8. numaralandırma <ol><li> İstenen zaman E3 ortamında tricaine bir buz soğukluğunda 200-300 mg / L, çözelti içinde enfeksiyondan en larvaları ile öldürülür. </li><li> Pipet 1.7 ml santrifüj tüplerine larvaları öldürüldü. Tricaine çözeltisini çıkarın ve% 0.2, 100 ul ile yerinePBS içinde Triton X-100 (PBSTx). </li><li> 27 G iğne ile yukarı ve aşağı 10 kez geçerek larvaları homojenleştirin. </li><li> Steril PBS homojenatlarının seri dilüsyonları hazırlayın. Örneğin, bulaşıcı dozu 100 CFU, pipetle 900 ul steril PBS içine homojenat 100 ul ise. Yeni bir pipet ucu kullanarak, 900 ul steril PBS içinde seyreltilmiş 100 ul homojenat aktarın. </li><li> Levha 100 gram-pozitif bakterilere seçici izolasyonu için Columbia CNA agarı üzerinde seyreltileri ul ve 48 saat süre ile 37 ° C&#39;de inkübe edin. Bu ortam, her ikisi de gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerin büyümesini destekleyecek THY + U agar plakaları, daha fazla seçim sağlar. </li><li> 500&#39;den daha az bireysel koloniler ile plakaları üzerinde, kolonilerin sayısını ve CFU sayısını belirlemek için seyreltme faktörü ile çarpın. </li></ol> Görüntüleme Larva 9. Sabitleme <ol><li> De olduğu gibi, PBS çözeltisi içinde bir buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid içinde larvaları saptamakbölüm 7 tarif. </li><li> Oda sıcaklığında, görüntüleme önce PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez her yıkayın. </li></ol> Canlı Görüntüleme Larvalarına 10. Hazırlanması <ol><li> Çözelti berraklaşıncaya kadar mikrodalga içinde ısıtılarak E3 içinde bir% 1.5 düşük erime noktalı agaroz çözelti hazırlayın. </li><li> Serin ama sertleşmesine etmeyelim için 55 ° C su banyosunda agaroz çözüm yerleştirin. </li><li> 0.016% bir nihai konsantrasyona kadar agaroza tricaine ekleyin. </li><li> Plastik bir transfer pipet kullanarak, bir stereomikroskopta aşamasında bir cam alt çanak 4-5 anestezi larvaları yerleştirin. </li><li> 55 ° C su banyosu tricaine ve agaroz çözüm çıkarın ve 1-2 dakika için oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Agaroz soğurken mümkün olduğu anestezi uygulanmış larvaları kadar sıvıyı ayırın. </li><li> Yüzeyinin yaklaşık yarısı kaplıdır kadar çanak içine agaroz soğutmalı dökün. Agarozun yaymak için çanak girdap. Not agaroz eğerçok sıcak, bu larvaları öldürür. Çok fazla agaroz çanak eklenirse agaroz ile odaklama Ayrıca, mikroskop objektif lens çanak dibe vurmak olabilir. </li><li> Bir transfer pipet kullanarak, yemeğin yüzüne yüzmekte olan larva pick up ve merkeze geri içine pipetlemeyin. </li><li> Saç döngüsü, çok uzun bir pipet ya da bir cam çubuk ile arzu edildiği gibi stereomikroskop altında, yavaşça larvaları yerleştirin. Sol kulak vezikül çanak dibine düz böylece otik vezikül görüntüleme için, larva yerleştirin. </li><li> Çanak taşımadan önce yaklaşık 10 dakika agaroz soğuması. Agaroz katı değilse larva pozisyonları kayabilir. Hafifçe nemli tutmak için agaroz tabakanın en üstüne bir tricaine E3 çözelti pipetleme. </li></ol> Enfeksiyon 11. Konfokal Görüntüleme <ol><li> Bir FV-1000 lazer tarama confoca ile bir ters mikroskop sahneye larvaları ile cam alt çanak yerleştirinl sistemi. </li><li> 200-300 um iğne deliği ayarlayın ve bir sayısal diyaframı 3-6 mikron dilim z-yığınları set 0.75 / 20X objektif lens kullanarak. </li><li> Her kanal için lazer güç ve dedektör kazancını ayarlamak için sürekli çizgili tarama kullanın. </li><li> Her floresan kanal için sıralı çizgi tarama kullanarak (örneğin, 488 ve 543 nm) ve diferansiyel girişim kontrast (DIC), nötrofiller tarafından ilk işe ve fagositoz gözlemlemek için 2-6 saat sol kulak vezikül bir zaman atlamalı film, her 3 dk yapmak ve makrofajlar. Uzun zaman kurslar için, agaroz dışarı buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için Petri kabı bir kapak yerleştirin. </li><li> 20X veya 40X büyütmede (Şekil 2) larvaları hala sabit (Şekil 1B) görüntüler elde veya canlı. </li></ol> Otik vezikül de Dendra2 etiketli lökosit 12. Fotoçevrim Not: Dendra2-kırmızı flüoresans yeşilden photoconverted edilebilir1 dakika faiz (ROI) bölgede bir 405 nm lazer (% 50-70 lazer güç yeterli olmalıdır) odaklanarak. Aşağıda FV-1000 lazer konfokal tarama sistemi için kullanılan adım adım protokol şöyledir: <ol><li> 488 nm ve 543 nm lazerler ile z-yığın tarama kullanarak örnek gözünüzde canlandırın. Lazer gücü ve dedektör kazancını ayarlamak için sürekli çizgili tarama kullanın. Hiçbir yanlışlıkla photoconverted kırmızı floresan olduğundan emin olmak için kontrol edin. </li><li> &quot;Görüntü Alma Denetimi&quot; penceresinde, &quot;Uyaran Setting&quot; altında &quot;Use Tarayıcı&quot; aracını seçin ve &quot;ana&quot; seçiniz. 405 nm lazer seçin ve% 70 güçte ayarlayın. Daire seçeneği kullanarak, otik vezikül içinde yatırım getirisini tanımlar. </li><li> &quot;Uyarıcı Başlat Ayarlama&quot; altında 1 çerçevenin bir önceden etkinleştirilmesi ve 60.000 msn bir aktivasyon süresi ile &quot;serisinin Aktivasyon&quot; seçeneğini seçin. &quot;Başlığı Zaman Scan&quot; altında &quot;Acquisition Ayarı&quot; penceresinde, içinde 2 seçin00:01:00 (ön için ve biri sonrası Fotoçevrim için) ve aralıklarda. Not: Zaman atlamalı serisi Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, Dendra2 kırmızı floresan durumuna photoconverted olmalıdır. </li><li> Photoconverted kırmızı floresan yanı sıra kalan yeşil floresan (Şekil 3) görselleştirmek için 488 nm ve 543 nm lazerler kullanarak z-yığını ile örnek tarayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Agnew, W., Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus+iniae:+An+aquatic+pathogen+of+global+veterinary+significance+and+a+challenging+candidate+for+reliable+vaccination.">Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination.</a> Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).</li><li>Danilova, N., Steiner, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cells+develop+in+the+zebrafish+pancreas.">B cells develop in the zebrafish pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).</li><li>Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+maturation+of+the+immune+system+in+zebrafish,+Danio+rerio:+a+gene+expression+profiling,+in+situ+hybridization+and+immunological+study.">Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study.</a> Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).</li><li>Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hematopoiesis+and+Developing+Lymphoid+Organs+in+the+Zebrafish.">Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish.</a> Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).</li><li>Le Guyader, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+unconventional+behavior+of+neutrophils+in+developing+zebrafish.">Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish.</a> Blood. 111 (1), 132-141 (2008).</li><li>Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+behaviour+of+early+macrophages+in+the+zebrafish+embryo.">Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo.</a> Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).</li><li>Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptococcus-Zebrafish+Model+of+Bacterial+Pathogenesis.">Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis.</a> Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).</li><li>Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+gene+family+and+TIR-domain+adapters+in+Danio+rerio.">Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio.</a> Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).</li><li>Meijer, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+the+Toll-like+receptor+and+TIR+domain+adaptor+families+of+zebrafish.">Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish.</a> Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).</li><li>Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Complement+Factor+B-Like+cDNA+clone+from+the+Zebrafish+(Brachydanio+rerio).">A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio).</a> Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).</li><li>Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+respiratory+burst+assay+using+zebrafish+kidneys+and+embryos.">Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos.</a> J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).</li><li>Yoo, S. K., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+photolabeling+of+neutrophil+trafficking+during+inflammation+in+live+zebrafish.">Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens.">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+High-Throughput+Screen+for+Tuberculosis+Progression.">A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression.</a> PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).</li><li>Veneman, W. J., Mar&#237;n-Juez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+Optimization+of+a+High+Throughput+Setup+to+Study+Staphylococcus+epidermidis+and+Mycobacterium+marinum+Infection+as+a+Model+for+Drug+Discovery.">Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery.</a> J. Vis. Exp. (88), (2014).</li><li>Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+signaling+mechanisms+mediate+neutrophil+attraction+to+bacterial+infection+and+tissue+injury.">Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury.</a> Cell. Microbiol. , (2012).</li><li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+as+a+model+host+for+the+real+time+analysis+of+Salmonella+typhimurium+infections.">Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections.</a> Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).</li><li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+S+Inhibits+Neutrophil+Recruitment+during+the+Early+Stages+of+Streptococcus+pyogenes+Infection.">Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li><li>Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+cells+transplanted+into+zebrafish+proliferate,+migrate,+produce+melanin,+form+masses+and+stimulate+angiogenesis+in+zebrafish.">Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish.</a> Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).</li><li>Davis, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+visualization+of+mycobacterium-macrophage+interactions+leading+to+initiation+of+granuloma+formation+in+zebrafish+embryos.">Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos.</a> Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).</li><li>Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Zebrafish+to+Probe+the+Divergent+Virulence+Potentials+and+Toxin+Requirements+of+Extraintestinal+Pathogenic+Escherichia+coli.">Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli.</a> PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).</li><li>Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+Immune+Response+to+Streptococcus+iniae+Infection+in+Zebrafish+Larvae.">Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae.</a> Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).</li><li>Haddon, C., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Ear+Development+in+the+Embryo+of+the+Zebrafish,+Danio+rerio.">Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio.</a> J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).</li><li>Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+zebrafish+inner+ear.">Development of the zebrafish inner ear.</a> Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J. Vis. Exp. (25), (2009).</li><li>Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+of+professional+phagocytes+in+vivo:+unlike+macrophages,+neutrophils+engulf+only+surface-associated+microbes.">Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes.</a> J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Deng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+bacterial+infection+induces+systemic+activation+of+neutrophils+through+Cxcr2+signaling+in+zebrafish.">Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada kullanılan enfeksiyon yöntemi 2-3 dpf embriyolar ve larvaların bir ilk lokal enfeksiyona konak bağışıklık tepkisinin incelenmesi için yararlıdır. Bu tür kulak kesecik gibi kapalı bir boşlukta enfeksiyon gibi bir enflamatuar uyarıcı, odak nötrofil ve makrofaj kemotaksisi ve fagositoz çalışma sağlar. Otik vezikülleri içine bakteri enjekte bir uyarı nötrofillerin yeteneği etkili bir sıvı dolu boşluklarında fagosite ederler bakteriler, özellikle bir mikrop bağlı olabilir olmasıdır. ...

Streptococcus iniae balık ve insanlarda 1 hem de sistemik hastalığa sebep olup büyük bir su patojendir. S. iken iniae su ürünleri sektöründe büyük kayıplar için sorumlu, aynı zamanda diğer streptokok insan patojenlerin neden olanlara benzer klinik patolojilerin ile bağışıklığı insan konaklarda hastalığa neden yeteneğine potansiyel zoonotik patojen olduğunu. Insan patojenleri ile benzerlikler göz önüne alındığında, bu çalışma S. önemlidir Doğal ev sahibi bağlamında iniae hastalığı patogenezi. S. Bir yetişkin zebrabalıkları modeli iniae enfeksiyonu enfeksiyon lokalize sitede yanı sıra ölümü barındırmak için hızlı bir zaman ev sahibi lökositlerin sağlam infiltrasyonu ortaya, çok kısa bir zaman adaptif bağışıklık sistemini 7 dahil etmek. Kazanmak için bir derinlemesine S. doğuştan bağışıklık yanıtı içine bakmak in vivo enfeksiyon iniae, bu n daha uygun bir model kullanmak için gerekli olanon-invaziv canlı görüntüleme. larva Zebra balığı bu konak-patojen etkileşimleri çalışmak için giderek cazip omurgalı modeli yapmak avantajları bir numarası vardır. Balığı kullanımı ve memeli modellere göre korumak için nispeten ucuz ve kolaydır. Adaptif bağışıklık 4-6 hafta sonrası döllenme kadar işlevsel olgun değil, fakat larva fagositozu ve solunum patlaması 2-6 olmak üzere antimikrobiyal özellikleri ile tamamlayıcısı, Toll benzeri reseptörler, sitokinler, ve nötrofiller ve makrofajlar ile yüksek oranda korunmuş omurgalı doğuştan bağışıklık sistemine sahip, 8-11. Buna ek olarak, genetik izlenebilirliği ve geliştirme embriyonik ve larva aşamalarında optik saydamlık ile floresanla işaretlenmiş bağışıklık hücreleri mümkün in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak konukçu-patojen etkileşimlerine incelemek için yapım kararlı transgenik hatların üretilmesine izin verir. örneğin Den bir photoconvertible proteini kullanılarak bu transjenik nesildra2 enfeksiyonu 12 boyunca bireysel konak hücre kökeni ve kaderi takibi sağlar. Bir Zebra balığı larva enfeksiyon modeli geliştirirken, mikroenjeksiyon seçilen site, enfeksiyon başlangıçta lokalize veya sistemik olup olmadığını belirleyecektir. Kaudal ven veya Cuvier ve Duct içine sistemik kan enfeksiyonları en sık zebrabalıkları mikrobiyal patojenlerin incelemek için kullanılan ve patojen suşları arasında virulenslikte ev sahibi ve mikrobiyal hücrelerin, sitokin yanıtları ve farklılıklar arasındaki etkileşimleri incelemek için yararlı olmaktadır. Yavaş gelişen mikroorganizmalar için, 16-1,000 hücre aşamasında bir embriyo yumurta sarısı kesesinin içine ilk enjeksiyon arasında olduğu bir yavaş büyüyen mikroorganizmaların mikroenjeksiyon için uygun gelişim aşamasında olan, sistemik bir enfeksiyon 13,14 oluşturmak için kullanılabilir 16-128 hücre aşaması 15. Ancak, ev sahibi gelişiminin sonraki aşamalarında birçok mikropların kesesi enjeksiyonları sarısı t öldürücü olma eğilimindedirO lökositler 16-18 sızma mikrop ve eksikliği için besin açısından zengin bir ortamda nedeniyle ev sahipliği. Bir lokalize enfeksiyon genellikle kolayca non-invaziv görüntüleme ile ölçülebilir enfeksiyon sitenin yönelik lökositlerin yönettiği göç sonuçlanır. Enfeksiyon Bu tür lökosit göçünü yanı sıra çeşitli lökosit popülasyonlarının farklı göçmen ve fagositik yetenekleri soruşturma aracılık mekanizmaların diseksiyon için izin verebilirsiniz. Bakteri türleri arasındaki virulenslikte farklılıkları inceleyen yanı sıra fiziksel ana engeller sistemik olmak için yerelleştirilmiş enfeksiyonu için geçti gerekir çünkü mikrop istilası mekanizmaları okuyan zaman lokalize enfeksiyonlar da yararlıdır. Balığı, tipik olarak 25-31 ° C 19 arasındaki sıcaklıklarda yetiştirilir fakat aynı zamanda sıkı bir sıcaklık şartlarına belirli insan patojen invaziflik çalışmaları için 34-35 ° C kadar yüksek bir sıcaklıkta muhafaza edilebilirvirülans 20, 21. Birçok farklı sitelerde Beyin ventrikül 22, sırt kuyruk kas 18, perikardiyal boşluğu 23 ve otik vezikül (kulak) 5, 16, 24 dahil olmak üzere bir ilk lokal bakteriyel enfeksiyonun oluşturmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, lökosit yanıtı 13 araştırılırken sonuçları çarpıtabilir bakteri, doku hasarı ve inflamasyon bağımsız neden olabilir kuyruk kas içine bakteri enjeksiyonunun bulunmuştur. Daha az hasar Beyin içine enjeksiyonu ile ilişkili ve genç embriyoların lökositlerin başlangıçta yoksun olmasına rağmen mikrogliya ikamet almak gibi, Beyin ventrikül giderek zamanla daha bağışıklık hücrelerini kazanır rağmen. Beyin ventrikül da görüntü bir daha zor bir konumdur. otik vezikül damar 25, 26 doğrudan erişimi olan kapalı içi boş boşluktur. Bu leu normal olarak yoksunkocytes ama lökositlerin enfeksiyon gibi iltihap uyarıcıya tepki olarak otik veziküle iyileştirilebilirler. Aynı zamanda, çünkü görüntüleme kolaylığı ve enjeksiyon görselleştirme Zebra balığı yaşlı 2-3 gün sonrası fertilizasyon (dpf) bakteri mikroenjeksiyon tercih edilen bir sitedir. Bu nedenle, biz lokalize bakteriyel enfeksiyon sitemizde olarak otik vezikül seçti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.7 ml eppendorfs</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>AVSS1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27 G x 1/2 in. needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Red</td>
			<td>Molecular Probes, Invitrogen</td>
			<td>C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CNA agar</td>
			<td>Dot Scientific, Inc</td>
			<td>7126A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>MDS</td>
			<td>2292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel comb</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27372-482</td>
			<td>4.2 mm width, 1.5 mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom made by drilling a 16&#8211;18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>G33-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High melt agarose</td>
			<td>Denville Scientific, Inc.</td>
			<td>CA3510-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>with FV-1000 system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melt agarose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP165-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Tritech (Narishige)</td>
			<td>GJ-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection system</td>
			<td>Parker</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader pipet tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Tritech (Narishige)</td>
			<td>M-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>Flaming/Brown P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop spectrophotmeter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td>100 mm x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Ricca Chemoical Company</td>
			<td>572516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P-6310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>165921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease peptone</td>
			<td>Fluka Biochemika</td>
			<td>29185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small cell culture dish</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>430165</td>
			<td>35 mm x 10 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sudan Black</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall glass capillary injection needles</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>TW100-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Todd Hewitt</td>
			<td>Sigma Aldrich/Fluka Analytical</td>
			<td>T1438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)</td>
			<td>Argent Chemical Laboratory/Finquel</td>
			<td>C-FINQ-UE-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Fluka Biochemika</td>
			<td>92144</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-invasive imaging of the innate immune response in a zebrafish larval model of streptococcus iniae infection

su patojen, Streptococcus iniae, su ürünleri sektörü için yıllık kayıpları 100 milyon dolar sorumludur ve balık ve insanlarda hem de sistemik hastalığa neden yeteneğine sahiptir. S. daha iyi anlaşılması iniae hastalığı patogenezinde uygun bir model sistem gerektirir. floresan bağışıklık hücrelerini etiketli ile genetik tractability ve Zebra balığı erken gelişim evrelerinde optik şeffaflık transgenik hatları üretimi ve non-invaziv görüntüleme için izin verir. birkaç hafta döllenme sonrası dek adaptif bağışıklık sistemi tamamen işlevsel değil, ama Zebra balığı larvaları nötrofiller ve makrofajlar hem korunmuş omurgalı doğuştan gelen bağışıklık sistemi var. Böylece, bir larva enfeksiyon modelinin üretimi S. kontrol sırasında bağışıklık özel katkı çalışma sağlar iniae enfeksiyonu. Mikroenjeksiyon site bir enfeksiyon olup olmadığını belirleyeceksistemik ya da ilk olarak lokalize. Burada, biz otik vezikül Zebra balığı yaşlı 2-3 gün sonrası döllenme enjeksiyonu yanı sıra enfeksiyon floresan konfokal görüntüleme için teknikler bizim protokolleri sunuyoruz. Bir lokalize enfeksiyon sitesi ilk mikrop istilası gözlem, konak hücrelerin işe ve enfeksiyon yayılmasını sağlar. S. Zebra balığı larva modelini kullanarak Bulgularımız iniae enfeksiyonu zebra balığı lokalize bakteriyel enfeksiyonların konakçı nötrofil ve makrofajların farklı katkıları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, bağışıklık hücrelerinin photolabeling enfeksiyonun seyri sırasında bireysel konakçı hücre gelişmeyi izlemek için kullanılabilir açıklanmıştır.

S. Mikroenjeksiyon bir ilk lokal yanıtta otik vezikül iniae (Şekil 1 ve Şekil 2) oluşur. Doğru enjekte edildiğinde, bakteriler sadece otik vezikül ve değil çevredeki doku veya kanda görülmelidir. Bu fenol kırmızı boya (Şekil 1A) kullanarak mikroenjeksiyon sırasında görülebilir. Etiketli bakteriler enjekte edilir Alternatif olarak, enfekte larva hızlı bir tarama hemen bakteriler sadece otik vezikül ve değil çevredeki doku <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection at JoVE.com

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Bir Zebra balığı Larva Modeli Doğuştan Bağışıklık Tepki Non-invaziv Görüntüleme<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Enfeksiyon

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

non-invasive-imaging-innate-immune-response-zebrafish-larval-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

10.7K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Madison. Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle. 

Video: Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Yılları arasında sinerjistik Araştırma Bioluminescent Görüntüleme kullanma Streptococcus pneumoniae Bebek Fare ve İnfluenza A Virüsü

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

Zebra balığı Larva yılında Dissemine Kandidiyazis non-invaziv Görüntüleme

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Zebra balığı Doğuştan Bağışıklık Sağlık Bir Göstergesi Olarak Solunum Burst Tepki Kantitasyonu

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. Conversely, viruses have evolved intricate strategies to evade and exploit host immune signaling for survival and propagation. Viral immune evasion, entailing host defense and viral evasion, provides one of the most fascinating and dynamic interfaces to discern the host-virus interaction. These studies advance our understanding in innate immune regulation and pave our way to develop novel antiviral therapies.
Murine &#947;HV68 is a natural pathogen of murine rodents. &#947;HV68 infection of mice provides a tractable small animal model to examine the antiviral response to human KSHV and EBV of which perturbation of in vivo virus-host interactions is not applicable. Here we describe a protocol to determine the antiviral cytokine production. This protocol can be adapted to other viruses and signaling pathways.
Recently, we have discovered that &#947;HV68 hijacks MAVS and IKK&#946;, key innate immune signaling components downstream of the cytosolic RIG-I and MDA5, to abrogate NF&#922;B activation and antiviral cytokine production. Specifically, &#947;HV68 infection activates IKK&#946; and that activated IKK&#946; phosphorylates RelA to accelerate RelA degradation. As such, &#947;HV68 efficiently uncouples NF&#922;B activation from its upstream activated IKK&#946;, negating antiviral cytokine gene expression. This study elucidates an intricate strategy whereby the upstream innate immune activation is intercepted by a viral pathogen to nullify the immediate downstream transcriptional activation and evade antiviral cytokine production.

We describe a protocol to measure the antiviral cytokine production in mice infected with a model herpesvirus, murine gamma herpesvirus 68 (&#947;HV68) that is closely-related to human Kaposi&#8217;s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) and Epstein-Barr virus (EBV). Utilizing genetically modified mouse strains and mouse embryonic fibroblasts (MEFs), we assessed the antiviral cytokine production both in vivo and ex vivo. &#8220;Reconstituting&#8221; the expression of innate immune components in knockout embryonic fibroblasts by lentiviral transduction, we further pinpoint specific innate immune molecules and dissect the key signaling events that differentially regulate the antiviral cytokine production.

Sitokin Üretimi Viral Evasion Doğuştan Bağışıklık Sinyalizasyonu Diseksiyon

In response to a viral infection, the host innate immune response is activated to up-regulate gene expression and production of antiviral cytokines. ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

Neuropathogenic olmayan İnvaziv Modeli<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Yenidoğan Sıçan Enfeksiyon

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

Batı Nil Virüsü Mutant Soy Enfeksiyon MyD88-aracılı Hücresel Bağışıklık Tepki Vitro Analizi

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...