UConn Health'teki akış sitometrisi çekirdeğinden Dr. Evan Jellison ve Bayan Li Zhu'ya akış sitometrisi konusundaki yardımları için, UConn Health İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Lynn Puddington'a cihazlara verdikleri destek için, UConn Health'teki klinik araştırma merkezinden Bayan Slawa Gajewska ve Dr. Paul Appleton'a kan örnekleri almadaki yardımları için teşekkür ederiz. UConn Tıp Fakültesi'nden Dr. Christopher "Kit" Bonin ve Dr. Geneva Hargis'e bu makalenin bilimsel yazımı ve düzenlenmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (R01HL145454), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (P20GM121176), ABD, Amerikan Kalp Derneği'nden Kariyer Geliştirme Ödülü (18CDA34110426) ve UConn Health'ten bir başlangıç fonu. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Heparinize tam kan örnekleri, Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun olarak, UConn Health Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandığı üzere, bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra, kimliksizleştirilmiş sağlıklı insan donörlerden elde edildi. Tüm donörlerden bilgilendirilmiş onam alındı. Bu çalışma için dahil etme/hariç tutma kriterleri, katılımcıların uygunluğunu sağlamak ve potansiyel riskleri en aza indirmek için dikkatlice geliştirilmiştir. Uygun katılımcılar 18 ila 65 yaşları arasında, herhangi bir etnik kökene sahip, akıcı İngilizce bilen ve bilgilendirilmiş onam verebilen katılımcılardı. Hariç tutulan katılımcılar arasında, yasal olarak yetkili bir temsilciye ihtiyaç duyanlar, 18 yaşın altındaki veya 65 yaşın üzerindeki bireyler, hapsedilen bireyler ve hamile kadınlar gibi kendileri için bilgilendirilmiş onam sağlayamayanlar yer aldı. Ek olarak, katılımcıların anti-enflamatuar ilaç kullanımından ve enflamatuar koşullardan arınmış olmaları gerekiyordu. Mevcut enfeksiyonlar veya devam eden kronik veya akut inflamatuar durumlar da dışlama kriterleriydi. Son olarak, mevcut veya yakın zamanda COVID-19 enfeksiyonu öyküsü olan kişiler çalışma için uygun değildi. Bu kriterler, çalışma sonuçlarını etkileyebilecek potansiyel kafa karıştırıcı faktörleri en aza indirirken katılımcı güvenliğini ve uygunluğunu sağlamak için tasarlanmıştır.
1. Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Nötrofil ortamı: Fenol kırmızısı olmadan RPMI-1640'a %2 insan serum albümini ekleyerek nötrofil ortamını hazırlayın (bkz.</li>
	<li>fMLP çözeltisi: fMLP çözeltisini, fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640 ile 10 mM fMLP dimetil sülfoksit (DMSO) depolama çözeltisinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) 100 kez seyrelterek hazırlayın, bu da 100 μM fMLP çözeltisi elde edilmesini sağlar.</li>
	<li>Antikor çözeltisi: 120 μL allofikosiyanin (APC) konjuge monoklonal antikor mAb24'ü (mAb24-APC) seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu), 10 mL nötrofil ortamında β2 integrininin yüksek afiniteli konformasyonunu bildirerek 1.2 μg/mL mAb24-APC çözeltisi oluşturur.</li>
	<li>Bileşik kütüphanesi: Sıvı işleyiciyi kullanarak 384 oyuklu plakalarda 5 μL 10 mM kütüphanesi ( Malzeme Tablosuna bakınız) 45 μL DMSO'ya ekleyerek ilk bileşik kütüphaneyi 10 mM ila 1 mM konsantrasyonla seyreltin. Daha sonra, sıvı işleyiciyi kullanarak 1 mM bileşik kitaplığının oyuklu başına 5 μL'yi boş bir 384 oyuklu plakaya aktarın.</li>
	<li>Şekil 1'de gösterildiği gibi, dört sütun ( 1, 2, 23, 24) yalnızca DMSO içeriyordu, ancak taramada pozitif ve negatif kontroller olarak hizmet eden bileşikler içermiyordu. Fenol kırmızısı içermeyen 45 μL RPMI-1640 ekleyerek her bir kuyucuğu daha da seyreltin, bu da tüm bileşikler için 100 μM'lik bir nihai konsantrasyonla sonuçlanır.</li>
</ol>2. İnsan kanından nötrofil izolasyonu
<ol><li>Serolojik bir pipet kullanarak, 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde (Şekil 2A) ticari olarak temin edilebilen bir yoğunluk gradyan ortamının 8 mL üzerine 4 mL kanı dikkatlice katmanlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Kanı 550 × g'da 20 °C'de 30-50 dakika santrifüj edin. Rotoru kademeli olarak yavaşlatın (yavaşlama faktörü 1). NOT: Nötrofillerin ( Şekil 2B'de bant 2) kırmızı kan hücrelerinden başarılı bir şekilde ayrılması donörler arasında değişebilir. Çoğu donör için 30 dakikalık bir santrifüj yeterlidir. Bununla birlikte, bazı donörler için, ayırma başarılı olmazsa 10-30 dakikalık ek bir santrifüjleme gerekebilir (Şekil 2C).</li>
	<li>Plazmayı (üstteki sarı sıvı) ve mononükleer hücreleri (üstteki bulutlu bant; Şekil 2B'deki PBMC bandı) 1 mL'lik bir pipet kullanarak.</li>
	<li>Alt bulutlu banttan ( Şekil 2B'deki nötrofil bandı) ve berrak sıvının yaklaşık 3-4 mL altından nötrofilleri 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Nötrofil süspansiyonunu 2-3 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Süspansiyonu 400 × g'da 20 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı boşaltarak dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Peletleri 5 mL PBS ile nazikçe yeniden süspanse edin ve 20 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı boşaltarak çıkarın ve vakum emiş kullanarak tüp ağzının çevresinde ve tüp duvarında kalan süpernatanı dikkatlice ortadan kaldırın. Peletin 1 mL nötrofil ortamında yeniden süspanse edilmesi.</li>
	<li>Bir hemositometre kullanarak hücre sayılarını sayın. Tipik olarak, 8 mL insan kanından 1 ila 4 × 107 nötrofil elde edildi. NOT: Nötrofil süspansiyonunda kırmızı kan hücresi kontaminasyonu olabilir. Kırmızı kan hücreleri çoğu tahlili önemli ölçüde etkilemez ve nötrofil aktivasyonunu / hazırlamayıönleyebilir 27. Doğru bir nötrofil konsantrasyonu elde etmek için kırmızı kan hücrelerinin sayımdan önce parçalanması gerekir. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için 10-30 saniye boyunca 891 μL deiyonize suya 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin, ardından ozmotik basıncı dengelemek için nötrofillerin parçalanmasını önlemek için 99 μL 10× PBS ekleyin.</li>
	<li>Nötrofil ortamı ekleyerek hücre yoğunluğunu 6.25 × 105 hücre / mL'ye ayarlayın.</li>
</ol>3. 384 oyuklu plakanın hazırlanması
<ol><li>1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 1 μg/mL mAb24-APC çözeltisi oluşturmak için 1 mL antikor çözeltisini (1.2 μg/mL mAb24-APC) 0.2 mL nötrofil ortamı ile birleştirin. Daha sonra, bu karışımdan 25 μL'yi 384 oyuklu bir plakadaki negatif kontrol kuyucuklarına ekleyin ( Şekil 1'deki mavi kuyucuklar).</li>
	<li>15 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 1 μg/mL mAb24-APC ve 200 nM fMLP içeren bir çözelti oluşturmak için 9 mL antikor solüsyonunu 21.6 μL fMLP solüsyonu (100 μM) ve 1.7784 mL nötrofil ortamı ile karıştırın. Daha sonra, bu karışımdan 25 μL'yi 384 oyuklu bir plakadaki pozitif kontrol ve test kuyucuklarına ekleyin ( Şekil 1'deki kırmızı ve mavi kuyucuklar).</li>
	<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak 5 μL'lik 100 μM bileşik çözeltilerini bileşik kitaplık plakasından 384 oyuklu plakaya aktarın.</li>
	<li>Sıvıyı oda sıcaklığında 500 × g'da 1 dakika santrifüjleyin. NOT: Plakaları santrifüjlemek için bir döner kova rotoru ve plaka kovaları gereklidir.</li>
</ol>4. Hücrelerin tedavisi
<ol><li>16 kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 20 μL nötrofil süspansiyonu ekleyin (384 oyuklu plakanın her bir sütunu için 5-50 μL aralığı). Pipeti kullanarak 5-10 kez nazikçe karıştırın ve her pipetleme arasında tutarlı bir zaman aralığı sağlayın. NOT: Kuyucuklardaki nihai konsantrasyonlar aşağıdaki gibidir: nötrofiller 2.5 × 105 hücre/mL (tüm kuyucuklar); mAb24-APC 0.5 μg/mL (tüm kuyucuklar); fMLP 100 nM (pozitif kontrol ve test kuyuları); bileşikler 10 μM (test kuyuları).</li>
	<li>Plakayı bir çalkalayıcı üzerinde 300 rpm'de, oda sıcaklığında (RT) 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>16 kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 3 μL %16 paraformaldehit (PFA) ekleyerek hücreleri sabitleyin (son PFA konsantrasyonu ~%0.91). Ardından, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. NOT: Nötrofiller ve PFA eklerken farklı sütunlar arasında tutarlı bir zaman aralığının korunması önerilir. Bu, her kuyucuktaki nötrofillerin fMLP ve mAb24-APC ile aynı inkübasyon süresine sahip olmasını sağlar.</li>
</ol>5. Akış sitometrisi
<ol><li>Akış sitometresini açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve cihaza bağlı bilgisayarın da açık olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kılıf sıvı kabının dolu olduğundan ve atık kabının boş olduğundan ve cihaza doğru şekilde bağlandığından emin olun.</li>
	<li>384 oyuklu plakayı akış sitometresinin numune yükleyicisine yükleyin. Plakanın A1 kuyusunun yükleyici üzerindeki A1 işaretiyle hizalandığından emin olun.</li>
	<li>Yazılımı açın ve yeni bir deney oluşturun. 384 kuyusunu seçin ve istediğiniz floroforları seçin. Ardından, Plaka kurulumu'na tıklayın, tüm kuyucukları seçmek için sürükleyin ve ardından Örnek'e tıklayın. "Yüksek verim" anahtarını açın ve oran panelinin altında Yüksek'i seçin.<ol><li>Birim kutusuna 50 girin. Tek sayılı sütunlardaki örnekleri seçin ve ardından "Çalkalama" anahtarını etkinleştirin. Son olarak, örnekleri sağ panelde adlandırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Arsa ve kapıya tıklayın. Ardından, Uygula düğmesine (yeşil dolu bir daire üzerinde iki ok) tıklayın ve ardından oynat düğmesine (üçgen şekli) tıklayın. İlk kuyudan bazı hücreleri gözlemlemek için birkaç saniye bekleyin ve ardından duraklat düğmesine tıklayın.<ol><li>Grafikteki hücrelerin uygun şekilde görselleştirilmesini sağlamak için FSC ve SSC voltajlarını ayarlayın. Edinme'ye tıklayın ve ardından testi başlatmak için oynat düğmesine (üçgen şekli) tıklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometresi, her kuyucuktan sırayla ~50 μL 1000-3000 nötrofil örnekleyecektir. 384 oyuklu plakanın tamamının tamamlanması yaklaşık 3 saat sürecektir.</li>
	<li>Tüm örnekleri tamamladıktan sonra, bir sonraki adım için .fcs dosyalarını dışarı aktarın.</li>
</ol>6. Veri analizi
<ol><li>Akış sitometrisi veri analizi yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın). Tüm .fcs dosyalarını içeren klasörü seçin ve yazılım penceresine sürükleyin, ardından verileri yazılıma aktarmak için bırakın.</li>
	<li>Bir örneğe çift tıklayın, Şekil 28,29,30'te gösterildiği gibi, açılan pencerede FSC ve SSC 3'a dayalı tek nötrofiller açın. Geçitli satırları seçin ve klasöre sürükleyin, ardından geçiti bu klasördeki tüm örneklere uygulamak için bırakın.</li>
	<li>Yazılımın tablo düzenleyici işlevini kullanarak her bir kuyucuktan nötrofillerin APC medyan floresan yoğunluğunu (MFI) hesaplayın ve dışa aktarın. Düzenle sekmesi altındaki Sütun Ekle'ye tıklayın. İstatistik sekmesinde Medyan'ı seçin, geçitli popülasyon nötrofillerini seçin ve parametre olarak APC'yi seçin. Tamam düğmesine tıklayın.</li>
	<li>"Tablo düzenleyici" sekmesine dönün, "Grup" sekmesinde Tüm Örnekler'i seçin ve Tablo oluştur düğmesine basın. Oluşturulan tabloyu gösteren yeni bir pencere açılacaktır. Metin, CSV veya Excel dosyası olarak kaydedin.</li>
	<li>Dışa aktarılan tabloyu açın, pozitif ve negatif kontrol numuneleri için APC MFI'nin ortalama değerini ve standart sapmasını hesaplayın (Şekil 4).</li>
	<li>Denklemi kullanarak plakanın Z' faktörünü (Z') hesaplayın: Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn), buradaσ p ve σ n sırasıyla pozitif ve negatif kontrollerin standart sapmalarıdır ve μp ve μn sırasıyla pozitif ve negatif kontrollerin ortalamalarıdır 31. NOT: Z' faktörü, pozitif ve negatif kontrol dağılımlarının ayrıldığını gösterir. 0'lık bir Z' ayrılık olmadığı anlamına gelirken, 0.5'lik bir Z' eşit ayrılmayı gösterir. Daha önceki bir çalışmada31 belirtildiği gibi, Z' > 0.5, bileşik tarama için mükemmel bir testi gösterir. 0,5 ila 0 aralığında bir Z' kabul edilebilir, ancak tahlilde yalnızca ikincil tahlillerde daha fazla doğrulama gerektirecek güçlü isabetleri tanımlayabilir.</li>
	<li>Bileşikle muamele edilmiş nötrofillerin APC MFI'si, pozitif kontrol MFI'sinden çıkarılan pozitif kontrol MFI'sinin standart sapmasının üç katından düşük olduğunda, bileşikleri tarama için "isabet" olarak düşünün (P = 0.0013, Şekil 4'teki noktalı çizgi ile temsil edilir).</li>
</ol>

İnsan Nötrofillerinde β2 İntegrin Aktivasyon İnhibitörlerinin Taranması

<ol>
	<li>Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular &#38; Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).</li>
	<li>Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).</li>
	<li>Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology &#38; Therapeutics. 147, 123-135 (2015).</li>
	<li>Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).</li>
	<li>Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).</li>
	<li>Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).</li>
	<li>Sariba&#351;, A. S., &#214;zdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).</li>
	<li>Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).</li>
	<li>Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Kr&#228;henb&#252;hl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-&#945;L&#946;2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).</li>
	<li>Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin &#945;5&#946;1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).</li>
	<li>Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).</li>
	<li>Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).</li>
	<li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).</li>
	<li>Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent &#946;2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).</li>
	<li>Fan, Z. et al. High-affinity bent &#946;2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).</li>
	<li>Gupta, V. et al. The &#946;-tail domain (&#946;TD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).</li>
	<li>Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, &#945;X&#946;2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).</li>
	<li>Sun, H., Hu, L., Fan, Z. &#946;2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).</li>
	<li>Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of &#946;2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).</li>
	<li>Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the &#946;2 subunit I domain in regulation of integrin &#945;L&#946;2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).</li>
	<li>Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin &#945;L&#946;2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).</li>
	<li>Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin &#946;-subunit I-like domains by one-turn C-terminal &#945;-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).</li>
	<li>Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).</li>
	<li>Torres, M., Hall, F., O&#39;neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).</li>
	<li>Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).</li>
	<li>Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).</li>
	<li>Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).</li>
	<li>Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).</li>
	<li>Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).</li>
	<li>Blanco-Camarillo, C., Alem&#225;n, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).</li>
	<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
	<li>Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the &#946;2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).</li>
	<li>Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and &#946;2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5&#8242;-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).</li>
	<li>Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).</li>
	<li>Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin &#946;2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).</li>
	<li>Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).</li>
	<li>Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).</li>
	<li>Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).</li>
	<li>Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).</li>
	<li>Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel &#946;1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).</li>
	<li>Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common &#946;1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).</li>
	<li>Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-&#946;1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).</li>
	<li>Spiess, M. et al. Active and inactive &#946;1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).</li>
	<li>Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin &#945;5&#946;1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).</li>
	<li>Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).</li>
	<li>Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).</li>
	<li>Carre&#241;o, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).</li>
	<li>Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).</li>
	<li>Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).</li>
	<li>van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).</li>
	<li>Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).</li>
	<li>Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).</li>
	<li>Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).</li>
	<li>Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, &#945;4&#946;1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).</li>
	<li>Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).</li>
	<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar rekabet eden herhangi bir finansal çıkar beyan etmemektedir.

Nötrofil stimülasyonu ve boyamanın başlatılması ve sonlandırılması, nötrofillerin ve fiksatif PFA'nın eklenmesiyle belirlenir. Bu nedenle, nötrofillerin veya PFA'nın her sütuna pipetlenmesi arasında aynı zaman aralığının sağlanması çok önemlidir. Bu, her bir kuyucuktan nötrofillerin uyarılma ve boyama süresinin tutarlı kalmasını sağlar. Nötrofillerin kısa ömrü nedeniyle, donörlerden kan toplanmasından akış sitometrisinin tamamlanmasına kadar tüm deney aynı gün yapılmalıdır. N...

Birçok enflamatuar hastalık, nötrofillerin şişme veya yaralanma bölgesine infiltrasyonu ile karakterizedir1. Bu dokulara sızmak için nötrofiller, endotelin tutuklanmasını, damar duvarı boyunca ekstravazasyonu ve doku2'ye alımını içeren nötrofil alım kaskadını tamamlamalıdır. Dolaşımdaki nötrofiller, özellikle tutuklama aşaması için bu kaskadı tamamlamak için β2 integrin aktivasyonuna ihtiyaç duyar. Bu nedenle, nötrofil yapışmasını, ekstravazasyonu ve işe alımını azaltan integrin inhibe edici ilaçlar, enflamatuar hastalıkları etkili bir şekilde tedavi edebilir 3,4.
β2 integrinleri daha önce inflamatuar hastalıklar için hedeflenmiştir. Doğrudan integrin αLβ2'yi hedef alan bir monoklonal antikor olan Efalizumab, sedef hastalığı5'i tedavi etmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, efalizumab ölümcül yan etkisi nedeniyle geri çekildi - JC virüsü reaktivasyonundan kaynaklanan ilerleyici multifokal lökoensefalopati 6,7. Yeni anti-inflamatuar integrin bazlı tedaviler, yan etkileri en aza indirmek için lökositlerin anti-enfeksiyon fonksiyonlarını sürdürmeyi düşünmelidir. Efalizumabın yan etkileri, kan dolaşımındaki monoklonal antikorların uzun süreli dolaşımına bağlı olabilir ve bu da uzun vadede bağışıklık fonksiyonlarını inhibe edebilir8. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, efalizumabın αLβ2 çapraz bağlanmasına ve α4 integrinlerinin istenmeyen içselleştirilmesine aracılık ettiğini ve yan etkiler için alternatif bir açıklama sağladığını göstermektedir9. Bu nedenle, kısa ömürlü, küçük moleküllü antagonistler bu sorunu önleyebilir.
İnsan nötrofillerini kullanarak küçük moleküllü β2 integrin antagonistlerini taramak için yüksek verimli bir yöntem burada sunulmaktadır. β2 integrin aktivasyonu, ligandına erişmek ve bağlanma afinitesini artırmak için integrin ektodomaininin konformasyonel değişikliklerini gerektirir. Kanonik sustalı modelde, bükülmüş-kapalı integrin ektodomain önce uzatılmış-kapalı bir konformasyona uzanır ve daha sonra başlığını tamamen etkinleştirilmiş uzatılmış-açık konformasyona10,11,12,13 açar. Bükülmüş-kapalıdan bükülmüş-açık ve uzatılmış-açık, sonunda 14,15,16,17,18,19'a kadar uzanan alternatif bir yol da vardır. Konformasyona özgü antikor mAb24, ektodomainin başlığı açık olduğunda insan β2-I benzeri alandaki bir epitopa bağlanır20,21,22,23.
Burada, β24 integrinlerinin aktive edilip edilmediğini belirlemek için mAb2-APC kullanılır. Nötrofilleri ve integrini aktive etmek için, nötrofil β2 integrinlerini24 aktive edebilen bakteri kaynaklı kısa bir kemotaktik peptit olan N-formilmetiyonil-lösil-fenilalanin (fMLP) bu protokolde uyarıcı olarak kullanılır. fMLP, nötrofiller üzerindeki Fpr1'e bağlandığında, G-proteinleri, fosfolipaz Cβ ve fosfoinositid 3-kinaz γ içeren aşağı akış sinyal kaskadları aktive edilir. Bu sinyal olayları nihayetinde içten dışa sinyal yolu18,25 aracılığıyla integrin aktivasyonu ile sonuçlanır. β2 integrinlerine doğrudan bağlanan ve integrin aktivasyonu26'nın konformasyonel değişikliklerini önleyen küçük molekül antagonistlerinin yanı sıra, β2 integrin içten dışa aktivasyon sinyal yolundaki bileşenleri inhibe edebilen bileşikler de bu yöntemle tespit edilecektir. Otomatik akış sitometreleri, yüksek verimli tarama sağlar. Yeni antagonistleri tanımlamak, yalnızca integrin fizyolojisi anlayışımızı derinleştirmekle kalmaz, aynı zamanda integrin bazlı anti-inflamasyon tedavisine translasyonel içgörü sağlayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

Bu protokol, konformasyonel değişiklik bildiren antikorlar ve yüksek verimli akış sitometrisi kullanarak β2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini tanımlamak için bir yöntem oluşturmayı amaçlamaktadır. Yöntem ayrıca diğer antikor bazlı yüksek verimli tarama yöntemleri için bir kılavuz görevi görebilir. β2 integrinler, bağışıklık tepkilerinde çok önemli olan lökositlere özgü adezyon molekülleridir. Nötrofiller, sadece enfeksiyonlarla savaşmak için değil, aynı zamanda çoklu enflamatuar hastalıklara karışmak için kan dolaşımından çıkmak için integrin aktivasyonuna güvenirler. β2 integrin aktivasyonunun kontrol edilmesi, nötrofil ile ilişkili enflamatuar hastalıkların tedavisi için uygun bir yaklaşım sunar. Bu protokolde, izole edilmiş primer insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu ölçmek için β2 integrinlerinin yüksek afiniteli başlığına spesifik olarak bağlanan bir monoklonal antikor olan mAb24 kullanılır. N-formilmetiyonil-lösil-fenilalanin (fMLP), nötrofil β2 integrinlerini aktive etmek için bir uyarıcı olarak kullanılır. Bu çalışmada 384 oyuklu plaka numunelerini otomatik olarak çalıştırabilen yüksek verimli bir akış sitometresi kullanılmıştır. 320 kimyasalın β2 integrin inhibisyonu üzerindeki etkileri 3 saat içinde değerlendirilir. G proteinine bağlı reseptör tarafından başlatılan integrin içten dışa aktivasyon sinyal yolundaki β2 integrinlerini veya hedef molekülleri doğrudan hedefleyen moleküller bu yaklaşımla tanımlanabilir.

Many inflammatory diseases are characterized by the infiltration of neutrophils at the site of swelling or injury1. To infiltrate these tissues, neutrophils must complete the neutrophil recruitment cascade, which involves arrest to the endothelium, extravasation across the vessel wall, and recruitment into the tissue2. Circulating neutrophils need &#946;2 integrin activation to complete this cascade, especially for the arrest phase. Thus, integrin-inhibiting drugs that reduce neutrophil adhesion, extravasation, and recruitment may effectively treat inflammatory diseases3,4.
&#946;2 integrins have been targeted for inflammatory diseases before. Efalizumab, a monoclonal antibody directly targeting integrin &#945;L&#946;2, was developed to treat psoriasis5. However, efalizumab was withdrawn due to its lethal side effect - progressive multifocal leukoencephalopathy resulting from JC virus reactivation6,7. New anti-inflammatory integrin-based therapies should consider maintaining the anti-infection functions of leukocytes to minimize side effects. The side effects of efalizumab might be due to the prolonged circulation of monoclonal antibodies in the bloodstream, which could inhibit immune functions in the long term8. A recent study shows that efalizumab mediates &#945;L&#946;2 crosslinking and the unwanted internalization of &#945;4 integrins, providing an alternative explanation for the side effects9. Thus, short-lived, small-molecule antagonists might avoid this problem.
A high-throughput method to screen small-molecule &#946;2 integrin antagonists using human neutrophils is presented here. &#946;2 integrin activation requires conformational changes of the integrin ectodomain to gain access to and increase its binding affinity to its ligand. In the canonical switchblade model, the bent-closed integrin ectodomain first extends to an extended-closed conformation and then opens its headpiece to a fully activated extended-open conformation10,11,12,13. There is also an alternative pathway that starts from the bent-closed to bent-open and extended-open, eventually14,15,16,17,18,19. The conformation-specific antibody mAb24 binds to an epitope in the human &#946;2-I-like domain when the headpiece of the ectodomain is open20,21,22,23.
Here, mAb24-APC is used to determine whether the &#946;2 integrins are activated. To activate neutrophils and integrin, N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), a bacterial-derived short chemotactic peptide that can activate neutrophil &#946;2 integrins24, is used as a stimulus in this protocol. When fMLP binds to the Fpr1 on neutrophils, downstream signaling cascades involving G-proteins, phospholipase C&#946;, and phosphoinositide 3-kinase &#947; are activated. These signaling events ultimately result in integrin activation via the inside-out signaling pathway18,25. Besides small molecule antagonists that directly bind to &#946;2 integrins and prevent conformational changes of integrin activation26, compounds that can inhibit components in the &#946;2 integrin inside-out activation signaling pathway would also be detected with this method. Automated flow cytometers enable high-throughput screening. Identifying new antagonists may not only deepen our understanding of integrin physiology but also provide translational insight into integrin-based anti-inflammation therapy.

Yazar Spotlight: β2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini tanımlamak için bir yöntemin geliştirilmesi 

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

Temsili bir 384 oyuklu plaka taramasından elde edilen veriler (Şekil 4), negatif kontrollerin MFI'sinin 3236 ± 110 mAb24-APC'ye sahip olduğunu, pozitif kontrollerin ise 7588 ± 858'lik bir mAb24-APC MFI'sine sahip olduğunu ortaya koydu. Bu plaka için Z' faktörü yaklaşık 0.33'tür ve bu kabul edilebilir biraralık 31'dir. Bununla birlikte, Z' ikincil tahlillerde daha fazla doğrulama gerektirir.
Verileri normalleştirmek için, tü...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Method for Identifying Small Molecular Antagonists of Î²2 Integrin Activation at JoVE.com

Bu protokol, insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu inhibe eden küçük moleküllü ilaçları tanımlamak için akış sitometrisi tabanlı, yüksek verimli bir tarama yöntemini açıklar.

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Araştırmamız nötrofil integrin üzerine odaklanmıştır ve bu çalışmada Beta-2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini bulmak için bir yöntem oluşturmayı amaçladık. Bu yöntemle, integrin fizyolojisindeki anlayışımızı derinleştirebilecek yeni antagonistler bulabileceğimize ve ayrıca integrin bazlı anti-inflamatuar tedaviye translasyonel içgörü sağlayabileceğimize inanıyoruz. Gelecekte, yeni anti-enflamatuar ilaçları keşfetmeye ve etki mekanizmalarını incelemeye odaklanacağız.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.1K Görüntüleme.  UConn Health. Araştırmamız nötrofil integrin üzerine odaklanmıştır ve bu çalışmada Beta-2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini bulmak için bir yöntem oluşturmayı amaçladık. Bu yöntemle, integrin fizyolojisindeki anlayışımızı derinleştirebilecek yeni antagonistler bulabileceğimize ve ayrıca integrin bazlı anti-inflamatuar tedaviye translasyonel içgörü sağlayabileceğimize inanıyoruz. Gelecekte, yeni anti-enflamatuar ilaçları keşfetmeye ve etki mekan...

Video: Yazar Spotlight: β2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini tanımlamak için bir yöntemin geliştirilmesi 

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing conformational-change-reporting antibodies and high-throughput flow cytometry. The method can also serve as a guide for other antibody-based high-throughput screening methods. &#946;2 integrins are leukocyte-specific adhesion molecules that are crucial in immune responses. Neutrophils rely on integrin activation to exit the bloodstream, not only to fight infections but also to be involved in multiple inflammatory diseases. Controlling &#946;2 integrin activation presents a viable approach for treating neutrophil-associated inflammatory diseases. In this protocol, a monoclonal antibody, mAb24, which specifically binds to the high-affinity headpiece of &#946;2 integrins, is utilized to quantify &#946;2 integrin activation on isolated primary human neutrophils. N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is used as a stimulus to activate neutrophil &#946;2 integrins. A high-throughput flow cytometer capable of automatically running 384-well plate samples was used in this study. The effects of 320 chemicals on &#946;2 integrin inhibition are assessed within 3 h. Molecules that directly target &#946;2 integrins or target molecules in the G protein-coupled receptor-initiated integrin inside-out activation signaling pathway can be identified through this approach.

This protocol describes a flow cytometry-based, high-throughput screening method to identify small-molecule drugs that inhibit &#946;2 integrin activation on human neutrophils.