UConn Health'teki akış sitometrisi çekirdeğinden Dr. Evan Jellison ve Bayan Li Zhu'ya akış sitometrisi konusundaki yardımları için, UConn Health İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Lynn Puddington'a cihazlara verdikleri destek için, UConn Health'teki klinik araştırma merkezinden Bayan Slawa Gajewska ve Dr. Paul Appleton'a kan örnekleri almadaki yardımları için teşekkür ederiz. UConn Tıp Fakültesi'nden Dr. Christopher "Kit" Bonin ve Dr. Geneva Hargis'e bu makalenin bilimsel yazımı ve düzenlenmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (R01HL145454), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (P20GM121176), ABD, Amerikan Kalp Derneği'nden Kariyer Geliştirme Ödülü (18CDA34110426) ve UConn Health'ten bir başlangıç fonu. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Heparinize tam kan örnekleri, Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun olarak, UConn Health Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandığı üzere, bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra, kimliksizleştirilmiş sağlıklı insan donörlerden elde edildi. Tüm donörlerden bilgilendirilmiş onam alındı. Bu çalışma için dahil etme/hariç tutma kriterleri, katılımcıların uygunluğunu sağlamak ve potansiyel riskleri en aza indirmek için dikkatlice geliştirilmiştir. Uygun katılımcılar 18 ila 65 yaşları arasında, herhangi bir etnik kökene sahip, akıcı İngilizce bilen ve bilgilendirilmiş onam verebilen katılımcılardı. Hariç tutulan katılımcılar arasında, yasal olarak yetkili bir temsilciye ihtiyaç duyanlar, 18 yaşın altındaki veya 65 yaşın üzerindeki bireyler, hapsedilen bireyler ve hamile kadınlar gibi kendileri için bilgilendirilmiş onam sağlayamayanlar yer aldı. Ek olarak, katılımcıların anti-enflamatuar ilaç kullanımından ve enflamatuar koşullardan arınmış olmaları gerekiyordu. Mevcut enfeksiyonlar veya devam eden kronik veya akut inflamatuar durumlar da dışlama kriterleriydi. Son olarak, mevcut veya yakın zamanda COVID-19 enfeksiyonu öyküsü olan kişiler çalışma için uygun değildi. Bu kriterler, çalışma sonuçlarını etkileyebilecek potansiyel kafa karıştırıcı faktörleri en aza indirirken katılımcı güvenliğini ve uygunluğunu sağlamak için tasarlanmıştır.
1. Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Nötrofil ortamı: Fenol kırmızısı olmadan RPMI-1640'a %2 insan serum albümini ekleyerek nötrofil ortamını hazırlayın (bkz.</li>
	<li>fMLP çözeltisi: fMLP çözeltisini, fenol kırmızısı içermeyen RPMI 1640 ile 10 mM fMLP dimetil sülfoksit (DMSO) depolama çözeltisinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) 100 kez seyrelterek hazırlayın, bu da 100 μM fMLP çözeltisi elde edilmesini sağlar.</li>
	<li>Antikor çözeltisi: 120 μL allofikosiyanin (APC) konjuge monoklonal antikor mAb24'ü (mAb24-APC) seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu), 10 mL nötrofil ortamında β2 integrininin yüksek afiniteli konformasyonunu bildirerek 1.2 μg/mL mAb24-APC çözeltisi oluşturur.</li>
	<li>Bileşik kütüphanesi: Sıvı işleyiciyi kullanarak 384 oyuklu plakalarda 5 μL 10 mM kütüphanesi ( Malzeme Tablosuna bakınız) 45 μL DMSO'ya ekleyerek ilk bileşik kütüphaneyi 10 mM ila 1 mM konsantrasyonla seyreltin. Daha sonra, sıvı işleyiciyi kullanarak 1 mM bileşik kitaplığının oyuklu başına 5 μL'yi boş bir 384 oyuklu plakaya aktarın.</li>
	<li>Şekil 1'de gösterildiği gibi, dört sütun ( 1, 2, 23, 24) yalnızca DMSO içeriyordu, ancak taramada pozitif ve negatif kontroller olarak hizmet eden bileşikler içermiyordu. Fenol kırmızısı içermeyen 45 μL RPMI-1640 ekleyerek her bir kuyucuğu daha da seyreltin, bu da tüm bileşikler için 100 μM'lik bir nihai konsantrasyonla sonuçlanır.</li>
</ol>2. İnsan kanından nötrofil izolasyonu
<ol><li>Serolojik bir pipet kullanarak, 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde (Şekil 2A) ticari olarak temin edilebilen bir yoğunluk gradyan ortamının 8 mL üzerine 4 mL kanı dikkatlice katmanlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
	<li>Kanı 550 × g'da 20 °C'de 30-50 dakika santrifüj edin. Rotoru kademeli olarak yavaşlatın (yavaşlama faktörü 1). NOT: Nötrofillerin ( Şekil 2B'de bant 2) kırmızı kan hücrelerinden başarılı bir şekilde ayrılması donörler arasında değişebilir. Çoğu donör için 30 dakikalık bir santrifüj yeterlidir. Bununla birlikte, bazı donörler için, ayırma başarılı olmazsa 10-30 dakikalık ek bir santrifüjleme gerekebilir (Şekil 2C).</li>
	<li>Plazmayı (üstteki sarı sıvı) ve mononükleer hücreleri (üstteki bulutlu bant; Şekil 2B'deki PBMC bandı) 1 mL'lik bir pipet kullanarak.</li>
	<li>Alt bulutlu banttan ( Şekil 2B'deki nötrofil bandı) ve berrak sıvının yaklaşık 3-4 mL altından nötrofilleri 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. Nötrofil süspansiyonunu 2-3 kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Süspansiyonu 400 × g'da 20 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı boşaltarak dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Peletleri 5 mL PBS ile nazikçe yeniden süspanse edin ve 20 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı boşaltarak çıkarın ve vakum emiş kullanarak tüp ağzının çevresinde ve tüp duvarında kalan süpernatanı dikkatlice ortadan kaldırın. Peletin 1 mL nötrofil ortamında yeniden süspanse edilmesi.</li>
	<li>Bir hemositometre kullanarak hücre sayılarını sayın. Tipik olarak, 8 mL insan kanından 1 ila 4 × 107 nötrofil elde edildi. NOT: Nötrofil süspansiyonunda kırmızı kan hücresi kontaminasyonu olabilir. Kırmızı kan hücreleri çoğu tahlili önemli ölçüde etkilemez ve nötrofil aktivasyonunu / hazırlamayıönleyebilir 27. Doğru bir nötrofil konsantrasyonu elde etmek için kırmızı kan hücrelerinin sayımdan önce parçalanması gerekir. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için 10-30 saniye boyunca 891 μL deiyonize suya 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin, ardından ozmotik basıncı dengelemek için nötrofillerin parçalanmasını önlemek için 99 μL 10× PBS ekleyin.</li>
	<li>Nötrofil ortamı ekleyerek hücre yoğunluğunu 6.25 × 105 hücre / mL'ye ayarlayın.</li>
</ol>3. 384 oyuklu plakanın hazırlanması
<ol><li>1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 1 μg/mL mAb24-APC çözeltisi oluşturmak için 1 mL antikor çözeltisini (1.2 μg/mL mAb24-APC) 0.2 mL nötrofil ortamı ile birleştirin. Daha sonra, bu karışımdan 25 μL'yi 384 oyuklu bir plakadaki negatif kontrol kuyucuklarına ekleyin ( Şekil 1'deki mavi kuyucuklar).</li>
	<li>15 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 1 μg/mL mAb24-APC ve 200 nM fMLP içeren bir çözelti oluşturmak için 9 mL antikor solüsyonunu 21.6 μL fMLP solüsyonu (100 μM) ve 1.7784 mL nötrofil ortamı ile karıştırın. Daha sonra, bu karışımdan 25 μL'yi 384 oyuklu bir plakadaki pozitif kontrol ve test kuyucuklarına ekleyin ( Şekil 1'deki kırmızı ve mavi kuyucuklar).</li>
	<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak 5 μL'lik 100 μM bileşik çözeltilerini bileşik kitaplık plakasından 384 oyuklu plakaya aktarın.</li>
	<li>Sıvıyı oda sıcaklığında 500 × g'da 1 dakika santrifüjleyin. NOT: Plakaları santrifüjlemek için bir döner kova rotoru ve plaka kovaları gereklidir.</li>
</ol>4. Hücrelerin tedavisi
<ol><li>16 kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 20 μL nötrofil süspansiyonu ekleyin (384 oyuklu plakanın her bir sütunu için 5-50 μL aralığı). Pipeti kullanarak 5-10 kez nazikçe karıştırın ve her pipetleme arasında tutarlı bir zaman aralığı sağlayın. NOT: Kuyucuklardaki nihai konsantrasyonlar aşağıdaki gibidir: nötrofiller 2.5 × 105 hücre/mL (tüm kuyucuklar); mAb24-APC 0.5 μg/mL (tüm kuyucuklar); fMLP 100 nM (pozitif kontrol ve test kuyuları); bileşikler 10 μM (test kuyuları).</li>
	<li>Plakayı bir çalkalayıcı üzerinde 300 rpm'de, oda sıcaklığında (RT) 10 dakika inkübe edin.</li>
	<li>16 kanallı bir pipet kullanarak her bir oyuğa 3 μL %16 paraformaldehit (PFA) ekleyerek hücreleri sabitleyin (son PFA konsantrasyonu ~%0.91). Ardından, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. NOT: Nötrofiller ve PFA eklerken farklı sütunlar arasında tutarlı bir zaman aralığının korunması önerilir. Bu, her kuyucuktaki nötrofillerin fMLP ve mAb24-APC ile aynı inkübasyon süresine sahip olmasını sağlar.</li>
</ol>5. Akış sitometrisi
<ol><li>Akış sitometresini açın (Malzeme Tablosuna bakın) ve cihaza bağlı bilgisayarın da açık olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kılıf sıvı kabının dolu olduğundan ve atık kabının boş olduğundan ve cihaza doğru şekilde bağlandığından emin olun.</li>
	<li>384 oyuklu plakayı akış sitometresinin numune yükleyicisine yükleyin. Plakanın A1 kuyusunun yükleyici üzerindeki A1 işaretiyle hizalandığından emin olun.</li>
	<li>Yazılımı açın ve yeni bir deney oluşturun. 384 kuyusunu seçin ve istediğiniz floroforları seçin. Ardından, Plaka kurulumu'na tıklayın, tüm kuyucukları seçmek için sürükleyin ve ardından Örnek'e tıklayın. "Yüksek verim" anahtarını açın ve oran panelinin altında Yüksek'i seçin.<ol><li>Birim kutusuna 50 girin. Tek sayılı sütunlardaki örnekleri seçin ve ardından "Çalkalama" anahtarını etkinleştirin. Son olarak, örnekleri sağ panelde adlandırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Arsa ve kapıya tıklayın. Ardından, Uygula düğmesine (yeşil dolu bir daire üzerinde iki ok) tıklayın ve ardından oynat düğmesine (üçgen şekli) tıklayın. İlk kuyudan bazı hücreleri gözlemlemek için birkaç saniye bekleyin ve ardından duraklat düğmesine tıklayın.<ol><li>Grafikteki hücrelerin uygun şekilde görselleştirilmesini sağlamak için FSC ve SSC voltajlarını ayarlayın. Edinme'ye tıklayın ve ardından testi başlatmak için oynat düğmesine (üçgen şekli) tıklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Akış sitometresi, her kuyucuktan sırayla ~50 μL 1000-3000 nötrofil örnekleyecektir. 384 oyuklu plakanın tamamının tamamlanması yaklaşık 3 saat sürecektir.</li>
	<li>Tüm örnekleri tamamladıktan sonra, bir sonraki adım için .fcs dosyalarını dışarı aktarın.</li>
</ol>6. Veri analizi
<ol><li>Akış sitometrisi veri analizi yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın). Tüm .fcs dosyalarını içeren klasörü seçin ve yazılım penceresine sürükleyin, ardından verileri yazılıma aktarmak için bırakın.</li>
	<li>Bir örneğe çift tıklayın, Şekil 28,29,30'te gösterildiği gibi, açılan pencerede FSC ve SSC 3'a dayalı tek nötrofiller açın. Geçitli satırları seçin ve klasöre sürükleyin, ardından geçiti bu klasördeki tüm örneklere uygulamak için bırakın.</li>
	<li>Yazılımın tablo düzenleyici işlevini kullanarak her bir kuyucuktan nötrofillerin APC medyan floresan yoğunluğunu (MFI) hesaplayın ve dışa aktarın. Düzenle sekmesi altındaki Sütun Ekle'ye tıklayın. İstatistik sekmesinde Medyan'ı seçin, geçitli popülasyon nötrofillerini seçin ve parametre olarak APC'yi seçin. Tamam düğmesine tıklayın.</li>
	<li>"Tablo düzenleyici" sekmesine dönün, "Grup" sekmesinde Tüm Örnekler'i seçin ve Tablo oluştur düğmesine basın. Oluşturulan tabloyu gösteren yeni bir pencere açılacaktır. Metin, CSV veya Excel dosyası olarak kaydedin.</li>
	<li>Dışa aktarılan tabloyu açın, pozitif ve negatif kontrol numuneleri için APC MFI'nin ortalama değerini ve standart sapmasını hesaplayın (Şekil 4).</li>
	<li>Denklemi kullanarak plakanın Z' faktörünü (Z') hesaplayın: Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μp - μn), buradaσ p ve σ n sırasıyla pozitif ve negatif kontrollerin standart sapmalarıdır ve μp ve μn sırasıyla pozitif ve negatif kontrollerin ortalamalarıdır 31. NOT: Z' faktörü, pozitif ve negatif kontrol dağılımlarının ayrıldığını gösterir. 0'lık bir Z' ayrılık olmadığı anlamına gelirken, 0.5'lik bir Z' eşit ayrılmayı gösterir. Daha önceki bir çalışmada31 belirtildiği gibi, Z' > 0.5, bileşik tarama için mükemmel bir testi gösterir. 0,5 ila 0 aralığında bir Z' kabul edilebilir, ancak tahlilde yalnızca ikincil tahlillerde daha fazla doğrulama gerektirecek güçlü isabetleri tanımlayabilir.</li>
	<li>Bileşikle muamele edilmiş nötrofillerin APC MFI'si, pozitif kontrol MFI'sinden çıkarılan pozitif kontrol MFI'sinin standart sapmasının üç katından düşük olduğunda, bileşikleri tarama için "isabet" olarak düşünün (P = 0.0013, Şekil 4'teki noktalı çizgi ile temsil edilir).</li>
</ol>

İnsan Nötrofillerinde β2 İntegrin Aktivasyon İnhibitörlerinin Taranması

<ol>
	<li>Herrero-Cervera, A., Soehnlein, O., Kenne, E. Neutrophils in chronic inflammatory diseases. Cellular &#38; Molecular Immunology. 19 (2), 177-191 (2022).</li>
	<li>Sadik, C. D., Kim, N. D., Luster, A. D. Neutrophils cascading their way to inflammation. Trends in immunology. 32 (10), 452-460 (2011).</li>
	<li>Mitroulis, I. et al. Leukocyte integrins: Role in leukocyte recruitment and as therapeutic targets in inflammatory disease. Pharmacology &#38; Therapeutics. 147, 123-135 (2015).</li>
	<li>Slack, R. J., Macdonald, S. J. F., Roper, J. A., Jenkins, R. G., Hatley, R. J. D. Emerging therapeutic opportunities for integrin inhibitors. Nature Reviews Drug Discovery. 21 (1), 60-78 (2022).</li>
	<li>Frampton, J. E., Plosker, G. L. Efalizumab. American Journal of Clinical Dermatology. 10 (1), 51-72 (2009).</li>
	<li>Talamonti, M. et al. Efalizumab. Expert Opinion on Drug Safety. 10 (2), 239-251 (2011).</li>
	<li>Sariba&#351;, A. S., &#214;zdemir, A., Lam, C., Safak, M. JC virus-induced progressive multifocal leukoencephalopathy. Future Virology. 5 (3), 313-323 (2010).</li>
	<li>Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future. British Journal of Pharmacology. 157 (2), 220-233 (2009).</li>
	<li>Mancuso, R. V., Casper, J., Schmidt, A. G., Kr&#228;henb&#252;hl, S., Weitz-Schmidt, G. Anti-&#945;L&#946;2 antibodies reveal novel endocytotic cross-modulatory functionality. British Journal of Pharmacology. 177 (12), 2696-2711 (2020).</li>
	<li>Anderson, J. M., Li, J., Springer, T. A. Regulation of integrin &#945;5&#946;1 conformational states and intrinsic affinities by metal ions and the ADMIDAS. Molecular Biology of the Cell. 33 (6), ar56 (2022).</li>
	<li>Jensen, R. K. et al. Complement receptor 3 forms a compact high-affinity complex with iC3b. The Journal of Immunology. 206 (12), 3032-3042 (2021).</li>
	<li>Li, J., Yan, J., Springer, T. A. Low affinity integrin states have faster ligand binding kinetics than the high affinity state. Elife. 10, e73359 (2021).</li>
	<li>Luo, B. H., Carman, C. V., Springer, T. A. Structural basis of integrin regulation and signaling. Annual Review of Immunology. 25, 619-647 (2007).</li>
	<li>Fan, Z. et al. Neutrophil recruitment limited by high-affinity bent &#946;2 integrin binding ligand in cis. Nature communications. 7 (1), 1-14 (2016).</li>
	<li>Fan, Z. et al. High-affinity bent &#946;2-integrin molecules in arresting neutrophils face each other through binding to ICAMs in cis. Cell reports. 26 (1), 119-130 (2019).</li>
	<li>Gupta, V. et al. The &#946;-tail domain (&#946;TD) regulates physiologic ligand binding to integrin CD11b/CD18. Blood. 109 (8), 3513-3520 (2006).</li>
	<li>Sen, M., Yuki, K., Springer, T. A. An internal ligand-bound, metastable state of a leukocyte integrin, &#945;X&#946;2. Journal of Cell Biology. 203 (4), 629-642 (2013).</li>
	<li>Sun, H., Hu, L., Fan, Z. &#946;2 integrin activation and signal transduction in leukocyte recruitment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 321 (2), C308-C316 (2021).</li>
	<li>Sun, H., Zhi, K., Hu, L., Fan, Z. The activation and regulation of &#946;2 integrins in phagocytes. Frontiers in Immunology. 12, 978 (2021).</li>
	<li>Kamata, T. et al. The role of the CPNKEKEC sequence in the &#946;2 subunit I domain in regulation of integrin &#945;L&#946;2 (LFA-1). The Journal of Immunology. 168 (5), 2296-2301 (2002).</li>
	<li>Lu, C., Shimaoka, M., Zang, Q., Takagi, J., Springer, T. A. Locking in alternate conformations of the integrin &#945;L&#946;2 I domain with disulfide bonds reveals functional relationships among integrin domains. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (5), 2393-2398 (2001).</li>
	<li>Yang, W., Shimaoka, M., Chen, J., Springer, T. A. Activation of integrin &#946;-subunit I-like domains by one-turn C-terminal &#945;-helix deletions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (8), 2333-2338 (2004).</li>
	<li>Dransfield, I., Hogg, N. Regulated expression of Mg2+ binding epitope on leukocyte integrin alpha subunits. The EMBO Journal. 8 (12), 3759-3765 (1989).</li>
	<li>Torres, M., Hall, F., O&#39;neill, K. Stimulation of human neutrophils with formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine induces tyrosine phosphorylation and activation of two distinct mitogen-activated protein-kinases. The Journal of Immunology. 150 (4), 1563-1577 (1993).</li>
	<li>Dorward, D. A. et al. The role of formylated peptides and formyl peptide receptor 1 in governing neutrophil function during acute inflammation. The American Journal of Pathology. 185 (5), 1172-1184 (2015).</li>
	<li>Lin, F. Y. et al. A general chemical principle for creating closure-stabilizing integrin inhibitors. Cell. 185 (19), 3533-3550 (2022).</li>
	<li>Lizcano, A. et al. Erythrocyte sialoglycoproteins engage Siglec-9 on neutrophils to suppress activation. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 129 (23), 3100-3110 (2017).</li>
	<li>Tadema, H., Abdulahad, W. H., Stegeman, C. A., Kallenberg, C. G., Heeringa, P. Increased expression of Toll-like receptors by monocytes and natural killer cells in ANCA-associated vasculitis. PloS One. 6 (9), e24315 (2011).</li>
	<li>Nagelkerke, S. Q., aan de Kerk, D. J., Jansen, M. H., van den Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Failure to detect functional neutrophil B helper cells in the human spleen. PloS one. 9 (2), e88377 (2014).</li>
	<li>Blanco-Camarillo, C., Alem&#225;n, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Frontiers in Immunology. 12, 672520 (2021).</li>
	<li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of biomolecular screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li>
	<li>Shimaoka, M., Salas, A., Yang, W., Weitz-Schmidt, G., Springer, T.A. Small molecule integrin antagonists that bind to the &#946;2 subunit I-like domain and activate signals in one direction and block them in the other. Immunity. 19 (3), 391-402 (2003).</li>
	<li>Liu, W. et al. Nexinhib20 Inhibits neutrophil adhesion and &#946;2 integrin activation by antagonizing Rac-1-Guanosine 5&#8242;-Triphosphate interaction. The Journal of Immunology. 209 (8), 1574-1585 (2022).</li>
	<li>Robinson, M. et al. Antibody against the Leu-CAM beta-chain (CD18) promotes both LFA-1-and CR3-dependent adhesion events. The Journal of Immunology. 148 (4), 1080-1085 (1992).</li>
	<li>Lu, C., Ferzly, M., Takagi, J., Springer, T. A. Epitope mapping of antibodies to the C-terminal region of the integrin &#946;2 subunit reveals regions that become exposed upon receptor activation. The Journal of Immunology. 166 (9), 5629-5637 (2001).</li>
	<li>Mauler, M. et al. Platelet serotonin aggravates myocardial ischemia/reperfusion injury via neutrophil degranulation. circulation. 139 (7), 918-931 (2019).</li>
	<li>Shen, X. F., Cao, K., Jiang, J., Guan, W. X., Du, J. F. Neutrophil dysregulation during sepsis: an overview and update. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (9), 1687-1697 (2017).</li>
	<li>Chiang, C. C., Cheng, W. J., Korinek, M., Lin, C. Y., Hwang, T. L. Neutrophils in Psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 02376 (2019).</li>
	<li>Lood, C. et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature medicine. 22 (2), 146-153 (2016).</li>
	<li>Bazzoni, G., Shih, D. T., Buck, C. A., Hemler, M. E. Monoclonal antibody 9EG7 defines a novel &#946;1 integrin epitope induced by soluble ligand and manganese, but inhibited by calcium. Journal of Biological Chemistry. 270 (43), 25570-25577 (1995).</li>
	<li>Luque, A. et al. Activated conformations of very late activation integrins detected by a group of antibodies (HUTS) specific for a novel regulatory region(355-425) of the common &#946;1 chain. Journal of Biological Chemistry. 271 (19), 11067-11075 (1996).</li>
	<li>Mould, A. P., Akiyama, S. K., Humphries, M. J. The inhibitory Anti-&#946;1 integrin monoclonal antibody 13 recognizes an epitope that is attenuated by ligand occupancy: evidence for allosteric inhibition of integrin function. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20365-20374 (1996).</li>
	<li>Spiess, M. et al. Active and inactive &#946;1 integrins segregate into distinct nanoclusters in focal adhesions. Journal of Cell Biology. 217 (6), 1929-1940 (2018).</li>
	<li>Yang, S. et al. Relating conformation to function in integrin &#945;5&#946;1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), E3872-E3881 (2016).</li>
	<li>Shattil, S. J., Hoxie, J. A., Cunningham, M., Brass, L. F. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. Journal of Biological Chemistry. 260 (20), 11107-11114 (1985).</li>
	<li>Shattil, S. J., Motulsky, H. J , Insel, P. A., Flaherty, L., Brass, L. F. Expression of fibrinogen receptors during activation and subsequent desensitization of human platelets by epinephrine. Blood. 68 (6), 1224-1231 (1986).</li>
	<li>Carre&#241;o, R. et al. 2E8 binds to the high affinity i-domain in a metal ion-dependent manner: a second generation monoclonal antibody selectively targeting activated LFA-1. Journal of Biological Chemistry. 285 (43), 32860-32868 (2010).</li>
	<li>Keizer, G. D., Visser, W., Vliem, M., Figdor, C. G. A monoclonal antibody (NKI-L16) directed against a unique epitope on the alpha-chain of human leukocyte function-associated antigen 1 induces homotypic cell-cell interactions. The Journal of Immunology. 140 (5), 1393-1400 (1988).</li>
	<li>Lefort, C. T. et al. Distinct roles for talin-1 and kindlin-3 in LFA-1 extension and affinity regulation. Blood. 119 (18), 4275-4282 (2012).</li>
	<li>van Kooyk, Y. et al. Activation of LFA-1 through a Ca2(+)-dependent epitope stimulates lymphocyte adhesion. Journal of Cell Biology. 112 (2), 345-354 (1991).</li>
	<li>Mould, A. P. et al. Conformational changes in the integrin a domain provide a mechanism for signal transduction via hybrid domain movement. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17028-17035 (2003).</li>
	<li>Chigaev, A. et al. Real-time analysis of conformation-sensitive antibody binding provides new insights into integrin conformational regulation. Journal of Biological Chemistry. 284 (21), 14337-14346 (2009).</li>
	<li>Njus, B. H. et al. Conformational mAb as a tool for integrin ligand discovery. Assay and Drug Development Technologies. 7 (5), 507-515 (2009).</li>
	<li>Chigaev, A., Wu, Y., Williams, D. B., Smagley, Y., Sklar, L. A. Discovery of very late antigen-4 (VLA-4, &#945;4&#946;1 integrin) allosteric antagonists. Journal of Biological Chemistry. 286 (7), 5455-5463 (2011).</li>
	<li>Ghigo, A., De Santi, C., Hart, M., Mitash, N., Swiatecka-Urban, A. Cell signaling and regulation of CFTR expression in cystic fibrosis cells in the era of high efficiency modulator therapy. Journal of Cystic Fibrosis. 22, S12-S16 (2023).</li>
	<li>Van Goor, F., Yu, H., Burton, B., Hoffman, B.J. Effect of ivacaftor on CFTR forms with missense mutations associated with defects in protein processing or function. Journal of Cystic Fibrosis. 13 (1), 29-36 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar rekabet eden herhangi bir finansal çıkar beyan etmemektedir.

Nötrofil stimülasyonu ve boyamanın başlatılması ve sonlandırılması, nötrofillerin ve fiksatif PFA'nın eklenmesiyle belirlenir. Bu nedenle, nötrofillerin veya PFA'nın her sütuna pipetlenmesi arasında aynı zaman aralığının sağlanması çok önemlidir. Bu, her bir kuyucuktan nötrofillerin uyarılma ve boyama süresinin tutarlı kalmasını sağlar. Nötrofillerin kısa ömrü nedeniyle, donörlerden kan toplanmasından akış sitometrisinin tamamlanmasına kadar tüm deney aynı gün yapılmalıdır. N...

Birçok enflamatuar hastalık, nötrofillerin şişme veya yaralanma bölgesine infiltrasyonu ile karakterizedir1. Bu dokulara sızmak için nötrofiller, endotelin tutuklanmasını, damar duvarı boyunca ekstravazasyonu ve doku2'ye alımını içeren nötrofil alım kaskadını tamamlamalıdır. Dolaşımdaki nötrofiller, özellikle tutuklama aşaması için bu kaskadı tamamlamak için β2 integrin aktivasyonuna ihtiyaç duyar. Bu nedenle, nötrofil yapışmasını, ekstravazasyonu ve işe alımını azaltan integrin inhibe edici ilaçlar, enflamatuar hastalıkları etkili bir şekilde tedavi edebilir 3,4.
β2 integrinleri daha önce inflamatuar hastalıklar için hedeflenmiştir. Doğrudan integrin αLβ2'yi hedef alan bir monoklonal antikor olan Efalizumab, sedef hastalığı5'i tedavi etmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, efalizumab ölümcül yan etkisi nedeniyle geri çekildi - JC virüsü reaktivasyonundan kaynaklanan ilerleyici multifokal lökoensefalopati 6,7. Yeni anti-inflamatuar integrin bazlı tedaviler, yan etkileri en aza indirmek için lökositlerin anti-enfeksiyon fonksiyonlarını sürdürmeyi düşünmelidir. Efalizumabın yan etkileri, kan dolaşımındaki monoklonal antikorların uzun süreli dolaşımına bağlı olabilir ve bu da uzun vadede bağışıklık fonksiyonlarını inhibe edebilir8. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, efalizumabın αLβ2 çapraz bağlanmasına ve α4 integrinlerinin istenmeyen içselleştirilmesine aracılık ettiğini ve yan etkiler için alternatif bir açıklama sağladığını göstermektedir9. Bu nedenle, kısa ömürlü, küçük moleküllü antagonistler bu sorunu önleyebilir.
İnsan nötrofillerini kullanarak küçük moleküllü β2 integrin antagonistlerini taramak için yüksek verimli bir yöntem burada sunulmaktadır. β2 integrin aktivasyonu, ligandına erişmek ve bağlanma afinitesini artırmak için integrin ektodomaininin konformasyonel değişikliklerini gerektirir. Kanonik sustalı modelde, bükülmüş-kapalı integrin ektodomain önce uzatılmış-kapalı bir konformasyona uzanır ve daha sonra başlığını tamamen etkinleştirilmiş uzatılmış-açık konformasyona10,11,12,13 açar. Bükülmüş-kapalıdan bükülmüş-açık ve uzatılmış-açık, sonunda 14,15,16,17,18,19'a kadar uzanan alternatif bir yol da vardır. Konformasyona özgü antikor mAb24, ektodomainin başlığı açık olduğunda insan β2-I benzeri alandaki bir epitopa bağlanır20,21,22,23.
Burada, β24 integrinlerinin aktive edilip edilmediğini belirlemek için mAb2-APC kullanılır. Nötrofilleri ve integrini aktive etmek için, nötrofil β2 integrinlerini24 aktive edebilen bakteri kaynaklı kısa bir kemotaktik peptit olan N-formilmetiyonil-lösil-fenilalanin (fMLP) bu protokolde uyarıcı olarak kullanılır. fMLP, nötrofiller üzerindeki Fpr1'e bağlandığında, G-proteinleri, fosfolipaz Cβ ve fosfoinositid 3-kinaz γ içeren aşağı akış sinyal kaskadları aktive edilir. Bu sinyal olayları nihayetinde içten dışa sinyal yolu18,25 aracılığıyla integrin aktivasyonu ile sonuçlanır. β2 integrinlerine doğrudan bağlanan ve integrin aktivasyonu26'nın konformasyonel değişikliklerini önleyen küçük molekül antagonistlerinin yanı sıra, β2 integrin içten dışa aktivasyon sinyal yolundaki bileşenleri inhibe edebilen bileşikler de bu yöntemle tespit edilecektir. Otomatik akış sitometreleri, yüksek verimli tarama sağlar. Yeni antagonistleri tanımlamak, yalnızca integrin fizyolojisi anlayışımızı derinleştirmekle kalmaz, aynı zamanda integrin bazlı anti-inflamasyon tedavisine translasyonel içgörü sağlayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16-channel pipettes</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>4661090N</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-well plate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>784201</td>
			<td>Materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD11a/CD18 (LFA-1) Antibody Clone: m24</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>363410</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bravo&#160;Automated Liquid Handling Platform&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>16050-102</td>
			<td>384 multi-channel liquid handler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Model 5810R</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo</td>
			<td>Becton, Dickinson &#38; Company</td>
			<td>NA</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution (25%)</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>800-120</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lifitegrast</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>&#160;50-208-2121</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nexinhib20</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>6089</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>UL155</td>
			<td>Accessory</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate shaker&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymorphPrep</td>
			<td>PROGEN</td>
			<td>1895 (previous 1114683)</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestwick Chemical Library Compound Plates (10 mM)</td>
			<td>Prestwick Chemical Libraries</td>
			<td>Ver19_384</td>
			<td>1520 small molecules, 98% marketed approved drugs (FDA, EMA, JAN, and other agencies approved)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11-835-030</td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swing-bucket rotor&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>A-4-62</td>
			<td>Rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZE5 Cell Analyzer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories</td>
			<td>Model ZE5</td>
			<td>Instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow cytometry-based high-throughput technique for screening integrin-inhibitory drugs

Bu protokol, konformasyonel değişiklik bildiren antikorlar ve yüksek verimli akış sitometrisi kullanarak β2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini tanımlamak için bir yöntem oluşturmayı amaçlamaktadır. Yöntem ayrıca diğer antikor bazlı yüksek verimli tarama yöntemleri için bir kılavuz görevi görebilir. β2 integrinler, bağışıklık tepkilerinde çok önemli olan lökositlere özgü adezyon molekülleridir. Nötrofiller, sadece enfeksiyonlarla savaşmak için değil, aynı zamanda çoklu enflamatuar hastalıklara karışmak için kan dolaşımından çıkmak için integrin aktivasyonuna güvenirler. β2 integrin aktivasyonunun kontrol edilmesi, nötrofil ile ilişkili enflamatuar hastalıkların tedavisi için uygun bir yaklaşım sunar. Bu protokolde, izole edilmiş primer insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu ölçmek için β2 integrinlerinin yüksek afiniteli başlığına spesifik olarak bağlanan bir monoklonal antikor olan mAb24 kullanılır. N-formilmetiyonil-lösil-fenilalanin (fMLP), nötrofil β2 integrinlerini aktive etmek için bir uyarıcı olarak kullanılır. Bu çalışmada 384 oyuklu plaka numunelerini otomatik olarak çalıştırabilen yüksek verimli bir akış sitometresi kullanılmıştır. 320 kimyasalın β2 integrin inhibisyonu üzerindeki etkileri 3 saat içinde değerlendirilir. G proteinine bağlı reseptör tarafından başlatılan integrin içten dışa aktivasyon sinyal yolundaki β2 integrinlerini veya hedef molekülleri doğrudan hedefleyen moleküller bu yaklaşımla tanımlanabilir.

Temsili bir 384 oyuklu plaka taramasından elde edilen veriler (Şekil 4), negatif kontrollerin MFI'sinin 3236 ± 110 mAb24-APC'ye sahip olduğunu, pozitif kontrollerin ise 7588 ± 858'lik bir mAb24-APC MFI'sine sahip olduğunu ortaya koydu. Bu plaka için Z' faktörü yaklaşık 0.33'tür ve bu kabul edilebilir biraralık 31'dir. Bununla birlikte, Z' ikincil tahlillerde daha fazla doğrulama gerektirir.
Verileri normalleştirmek için, tü...

Watch this Scientific Journal Video about Development of a Method for Identifying Small Molecular Antagonists of Î²2 Integrin Activation at JoVE.com

Yazar Spotlight: β2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini tanımlamak için bir yöntemin geliştirilmesi 

Bu protokol, insan nötrofilleri üzerinde β2 integrin aktivasyonunu inhibe eden küçük moleküllü ilaçları tanımlamak için akış sitometrisi tabanlı, yüksek verimli bir tarama yöntemini açıklar.

İntegrin İnhibitör İlaçların Taranması için Flow Sitometri Tabanlı Yüksek Verimli Bir Teknik

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Araştırmamız nötrofil integrin üzerine odaklanmıştır ve bu çalışmada Beta-2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini bulmak için bir yöntem oluşturmayı amaçladık. Bu yöntemle, integrin fizyolojisindeki anlayışımızı derinleştirebilecek yeni antagonistler bulabileceğimize ve ayrıca integrin bazlı anti-inflamatuar tedaviye translasyonel içgörü sağlayabileceğimize inanıyoruz. Gelecekte, yeni anti-enflamatuar ilaçları keşfetmeye ve etki mekanizmalarını incelemeye odaklanacağız.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

1.6K Görüntüleme.  UConn Health. Araştırmamız nötrofil integrin üzerine odaklanmıştır ve bu çalışmada Beta-2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini bulmak için bir yöntem oluşturmayı amaçladık. Bu yöntemle, integrin fizyolojisindeki anlayışımızı derinleştirebilecek yeni antagonistler bulabileceğimize ve ayrıca integrin bazlı anti-inflamatuar tedaviye translasyonel içgörü sağlayabileceğimize inanıyoruz. Gelecekte, yeni anti-enflamatuar ilaçları keşfetmeye ve etki mekan...

Video: Yazar Spotlight: β2 integrin aktivasyonunun küçük moleküler antagonistlerini tanımlamak için bir yöntemin geliştirilmesi 

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Screening for Broad-spectrum Chemical Inhibitors of RNA Viruses

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat because of increased worldwide exchanges and human populations penetrating more and more natural ecosystems. A good example of such an emerging situation is chikungunya virus epidemics of 2005-2006 in the Indian Ocean. Recent progresses in our understanding of cellular pathways controlling viral replication suggest that compounds targeting host cell functions, rather than the virus itself, could inhibit a large panel of RNA viruses. Some broad-spectrum antiviral compounds have been identified with host target-oriented assays. However, measuring the inhibition of viral replication in cell cultures using reduction of cytopathic effects as a readout still represents a paramount screening strategy. Such functional screens have been greatly improved by the development of recombinant viruses expressing reporter enzymes capable of bioluminescence such as luciferase. In the present report, we detail a high-throughput screening pipeline, which combines recombinant measles and chikungunya viruses with cellular viability assays, to identify compounds with a broad-spectrum antiviral profile.

In vitro assays to measure virus replication have been greatly improved by the development of recombinant RNA viruses expressing luciferase or other enzymes capable of bioluminescence. Here we detail a high-throughput screening pipeline that combines such recombinant strains of measles and chikungunya viruses to isolate broad-spectrum antivirals from chemical libraries.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

RNA viruses are responsible for major human diseases such as flu, bronchitis, dengue, Hepatitis C or measles. They also represent an emerging threat ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Modüle c-di-GMP sinyal İşte Küçük Moleküller Tarama için Yüksek verim Kur kurulması<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and virus-infected or malignantly transformed cells due to a set of germline encoded inhibitory and activating receptors. Upon virus or tumor cell recognition a variety of different NK cell functions are initiated including cytotoxicity against the target cell as well as cytokine and chemokine production leading to the activation of other immune cells. It has been demonstrated that accurate NK cell functions are crucial for the treatment outcome of different virus infections and malignant diseases. Here a simple and reliable method is described to analyze different NK cell functions using a flow cytometry-based assay. NK cell functions can be evaluated not only for the whole NK cell population, but also for different NK cell subsets. This technique enables scientists to easily study NK cell functions in healthy donors or patients in order to reveal their impact on different malignancies and to further discover new therapeutic strategies.

A simple and reliable method is described here to analyze a set of NK cell functions such as degranulation, cytokine and chemokine production within different NK cell subsets.

Akış NK Hücre Fonksiyonları İzleme Testi Sitometri tabanlı

Natural killer (NK) cells are an important part of the human tumor immune surveillance system. NK cells are able to distinguish between healthy and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, specifically eliminating tumoral and virally infected cells. Approximately 30 known monogenic defects, together with a host of other pathological conditions, cause either functional or classic NK cell deficiency, manifesting in reduced or absent cytotoxic activity. Historically, cytotoxicity has been investigated with radioactive methods, which are cumbersome, expensive and potentially hazardous. This article describes a streamlined, clinically applicable flow cytometry-based method to quantify NK cell cytotoxic activity. In this assay, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or purified NK cell preparations are co-incubated at different ratios with a target tumor cell line known to be sensitive to NK cell-mediated cytotoxicity (NKCC). The target cells are pre-labeled with a fluorescent dye to allow their discrimination from the effector cells (NK cells). After the incubation period, killed target cells are identified by a nucleic acid stain, which specifically permeates dead cells. This method is amenable to both diagnostic and research applications and, thanks to the multi-parameter capabilities of flow cytometry, has the added advantage of potentially enabling a deeper analysis of NK cell phenotype and function.

A flow cytometry-based method to quantitatively determine the cytotoxic activity of human natural killer cells is shown here.

Akış Sitometresi tabanlı sitotoksisite tahlil insan NK hücre etkinliği değerlendirilmesi için

Within the innate immune system, effector lymphocytes known as natural killer (NK) cells play an essential role in host defense against aberrant cells, ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Salmonella spp. testi ile taranması için yüksek üretilen iş platformu /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by naturally acquired IgG antibodies specific for VAR2CSA. VAR2CSA is the parasite antigen that mediates the selective sequestration of IEs in the placenta that can cause a severe form of malaria in pregnant women, called placental malaria (PM). Protection from PM is mediated by VAR2CSA-specific antibodies that are believed to function by inhibiting placental sequestration and/or by opsonizing IEs for phagocytosis. The assay employs late-stage-synchronized IEs that have been selected in vitro to express VAR2CSA, plasma/serum-antibodies from women with naturally acquired PM-specific immunity, and the phagocytic cell line THP-1. However, the protocol can easily be modified to assay the functionality of antibodies to any parasite antigen present on the IE surface, whether induced by natural exposure or by vaccination. The assay offers simple and high-throughput evaluation, with good reproducibility, of an important functional aspect of antibody-mediated immunity in malaria. It is, therefore, useful when evaluating clinical immunity to P. falciparum malaria, a major cause of morbidity and mortality in the tropics, particularly in sub-Saharan Africa.

Measuring Naturally Acquired Phagocytosis-Inducing Antibodies to Plasmodium falciparum Parasites by a Flow Cytometry-Based Assay

The overall goal of this protocol is to provide instruction on how to measure the capacity of antibodies present in sera or plasma of individuals, naturally exposed to Plasmodium falciparum infection, to opsonize and induce phagocytosis of the parasite-infected erythrocytes (IEs).

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi

The protocol describes how to set up and run a flow cytometry-based phagocytosis assay of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IEs) opsonized by ...