Protokol, araştırmacıların birincil T hücrelerindeki kalsiyum yanıtını aynı anda ölçmelerine ve alt kümelerini ve yüzey fenotiplerini değerlendirmelerine olanak tanır. Bu tekniğin temel avantajı, kalsiyum yanıtlarını incelemeden önce hücrelerin belirli alt kümelerini izole etme ihtiyacını ortadan kaldırmasıdır. Başlamak için, 50 mikrogram Hint-1 içeren bir şişeye 50 mikrolitre DMSO ekleyerek Hint-1'nin mikrolitre stok çözeltisi başına bir mikrogram hazırlayın. Stok çözeltisini uygun bir cRPMI hacmine ve mililitre başına altı mikrogramlık bir konsantrasyona seyreltin.
Ortamı 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Daha sonra, mililitre başına beş ila 6 milyon hücre elde etmek için önceden hazırlanmış bir hücre süspansiyonunu bire bir oranda seyreltmek için bu ortamı kullanın. Daha sonra, 12 kuyucuklu bir doku kültürü plakasına, deneysel durum başına kuyu başına bir mililitre hücre süspansiyonu ekleyin.
Indo-1 boya yüklü hücrelere EGTA ekleyerek kalsiyumsuz Indo-1 için tek bir lekeli kontrol örneği hazırlayın. Florofor veya Hint-1 boyası olmadan biyolojik negatif kontrol için bir kuyu hazırlayın. Akış sitometresindeki boya yüklü hücre süspansiyonuna 50 mikromol konsantrasyonunda iyonomisin ekleyerek bir Hint-1 pozitif kontrol hazırlayın.
Ayrıca, antikor konjuge floroforlar kullanarak ek hücre popülasyonları için tek leke kontrolleri için bir kuyu hazırlayın. Ardından, milyon hücre başına iki mikrogram FC reseptörü bloke edici antikor ekleyin ve hücreleri yeniden askıya almak için her 15 dakikada bir dokunarak plakayı 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüm hücre hacmini plakadan karıştırın ve çıkarın ve 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine ekleyin.
Süpernatanı santrifüj edin ve boşaltın. Hücreler bir mililitre önceden ısıtılmış cRPMI ile yıkandıktan sonra, pelet tekrar ve süpernatanı boşaltın. Hücreleri bir mililitre cRPMI'de yeniden askıya alın ve her tüpü inkübe edin, tüpün üstünü gaz değişimi için hafifçe açık bırakarak hücre içi esterlerinin tamamen deesterifikasyonuna izin verin.
Daha sonra, kullanıcı tanımlı tüm florokrom konjuge antikorların ana karışımını hazırlayın ve hücre hacminin bir mililitresi için kalan hücrelere ekleyin. Dinlendikten sonra, hücreleri pelet edin ve dört santigrat dereceye kadar soğutulmuş bir mililitre cRPMI'de yeniden askıya alarak peleti yıkayın. Bu adımı tekrarlayın ve tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
Kapaklı beş mililitrelik polistiren akış tüpü kullanarak 500 mikrolitre fenol kırmızısız cRPMI'de bireysel numuneleri yeniden askıya alın. Kalsiyum akısı analizini kullanarak sıcaklığı korumak için, küçük bir su banyosuna banyo boncukları ekleyerek bir boncuk banyosu hazırlayın ve 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. 50 mililitrelik bir kronikleşme tüpünü dikkatlice ikiye bölün ve tüpün üstünü atın.
Kalan tüpün dörtte üçünü banyo boncuklarıyla doldurun ve boncuk banyosunda 37 santigrat dereceye ulaşmasına izin verin. Boncuk banyosunu, tüpü konumlandırmak için bir strafor rafla birlikte bir akış sitometresinin yanına yerleştirin. Akış sitometresindeki analizden önce, tüpleri yedi dakika boyunca ayrı ayrı 37 santigrat dereceye ısıtın.
Akış sitometresi yazılımına giriş yapın ve Kütüphane sekmesine tıklayın. Ardından, kalsiyuma bağlı Hint-1 ve kalsiyumsuz Hint-1 eklemek için floresan etiketleri seçin. Ardından floresan etiket grupları altında UV lazeri seçin ve floresan etiket adı eklemek için ekle'ye tıklayın.
Lazer uyarma ve emisyon dalga boyunu seçin ve ardından Kaydet'e tıklayın. Deneme kurulumuna devam edin. Edinme sekmesine tıklayın, Yeni bir deneme açın/oluşturun ve istediğiniz floresan etiketlerini denemeye ekleyin.
Deneme için bir başvuru grubu ve yeni bir örnek grup oluşturun ve her iki grubu da etiketleyin. Almalar sekmesi altında, olayları 10 milyonda en fazla 10 milyona, durdurma ses düzeyini en fazla 3000 mikrolitre hacme ve durma süresini en fazla 36.000 saniyeye kaydedecek şekilde ayarlayın. Çok renkli panelde bulunan kullanıcı tanımlı konjuge antikorlar ve Indo-1 fonksiyonel boya için tek lekeli kontroller elde edin.
Kalsiyuma bağlı Hint-1 pozitif kontrol ve vortekse 50 mikromol iyonomisin ekleyin. Akış tüpünü numune enjeksiyon panosuna ekleyin ve Kaydet'e tıklayın. Ardından akış sitometresine kalsiyumsuz Indo-1 negatif kontrolü ekleyin ve Kaydet'e tıklayın.
Tek lekeli kontrollerin karışımını Karıştır düğmesine tıklayarak çıkarın. Karıştırmayı kaldırma işlemi tamamlandıktan sonra, karıştırılmamış çalışma sayfasını kullanarak örnekteki kalıntıları kaldırmak için SSC-A ve SSC-A ile SSC-H gibi sıralı grafikler oluşturun. Ardından Arsa'ya tıklayarak kapılar oluşturun.
Çalışma sayfasına bir grafik ekleyin ve aşağı akış kapılı bir popülasyon oluşturmak için kapının içine çift tıklayın. İlgilenilen tüm popülasyonlar hesaba katılana kadar devam edin. Daha sonra, sıralı analiz için önceden hazırlanmış tek lekeli kontrol numunelerini 37 santigrat dereceye ısıtın.
Akış sitometri yazılımını kurun ve akış sitometresinin akışkan stabilitesini sağlamak için DI'yi buzlu suda iki ila üç dakika çalıştırın. İlgilenilen popülasyonu dahil etmek için çokgen dikdörtgenini veya elips kapısı düğmelerini kullanarak kapılar oluşturarak karıştırılmamış çalışma sayfasında sıralı grafikler ayarlayın. Kapının içine çift tıklayın ve y ve x ekseni parametrelerini SSC-A ve SSC-H olarak değiştirin.
Eksene sol tıklayarak eksen parametrelerini tanımlamayı tamamlayın. SSC-A ve canlılık boya sinyali ile bir grafik oluşturun. Amin boyası boyaması için negatif olan canlı hücreleri açın.
Canlı ölü boyama için negatif olan canlı hücreler hem y hem de x ekseninde sıfır işaretinde kümelenecektir. Sadece tek hücreli canlı lenfositleri içeren yeni bir arsa oluşturmak için iç grafiğe çift tıklayın. Kalsiyum akışının görselleştirilmesi için Y eksenini X eksenindeki zamana karşı Hint-1 olarak değiştirin.
Daha sonra ısıtılmış biyolojik numuneyi makinenin SIT içine yerleştirin. Sınırlı sayıda hücre popülasyonunda kalsiyum akışını görselleştirmek için örnekleri orta akış hızında saniyede 2.500 ila 3000 olayda çalıştırın. Bir sonraki tüpü satın alma kontrolünde boncuk banyosuna ekleyin.
Numunede bazal düzeyde kalsiyum sinyallemesi elde etmek üzere ilk verileri 30 saniye boyunca kaydetmek için Kaydet'e basın. Ardından Durdur'a tıklayın ve tüpü numune enjeksiyon portundan çıkarın. Kalsiyum akışını başlatmak için 30 mikrogram konjuge edilmemiş anti-CD3'ü doğrudan numune tüpüne ekleyin.
Tüpü hızlı bir şekilde numune enjeksiyon portuna geri yerleştirin ve yazılımda Kaydet'e basın. Yazılımdaki edinme kontrolleri altında geçen süreyi izleyerek yedi dakika boyunca verileri kaydedin. Ardından yazılımda Durdur'a basın.
Mililitre iyonomisin başına bir mikrogram ekleyin ve ilgili hücrelerde maksimum kalsiyum sinyalini elde etmek için 30 saniye boyunca kaydedin. Sonraki örneğe geçin ve tüm örnekler toplanana kadar iş akışını yineleyin. Denemeyi kaydedin ve dışa aktarma zip dosyasına tıklayın.
Karıştırılmamış dosyalar harici akış sitometri analiz yazılımına yüklenir. Yan saçılmaya karşı bir zaman grafiğindeki kararlı tutarlı bir sinyal, akışkan stabiliteyi gösterdi. Lenfosit popülasyonu kapılıydı ve bunu takiben, yan saçılma yüksekliği ile alan arasındaki bir arsa üzerinde singletlerin ayırt edilmesi izledi.
Singlet'lar uygulanabilirlik açısından değerlendirildi. Daha sonra CD19-negatif popülasyonda geçit uygulandı. Bu T-hücresi alt kümeleri, kalsiyuma bağlı Hint-1 floresansını zamana karşı görselleştirerek CD4 ve CD8'e karşı antikorlar kullanılarak değerlendirildi.
Bireysel hücre popülasyonlarında, kalsiyuma bağlı Hint-1'in zamana karşı grafiği, stimülasyondan önce bir taban çizgisi gösterdi. Hücre içi kalsiyum seviyeleri azaldıkça pik yanıt ve iyonomisin eklenerek kalsiyum yanıtı ortaya çıktı. Anti-CD3 antikor ilavesinden önce, zayıf bir kalsiyuma bağlı Indo-1 sinyali tespit edildi.
Tepe tepkisi sırasında, hücreler güçlü bir kalsiyuma bağlı Hint-1 sinyali gösterdi ve kalsiyumsuz Hint-1'i azalttı. Zirveden beş dakika sonra, Hint-1 floresansı neredeyse taban çizgisine geri döndü. İyonomisin ilavesinden sonra, hücrelerin yeterli boya yüklemesini gösteren sağlam bir kalsiyum bağlı Hint-1 sinyali görselleştirildi.
Nadir popülasyonların analizi, ilgilenilen her popülasyona geçit verdikten sonra kalsiyuma bağlı Hint-1'e karşı kalsiyumsuz Hint-1'i çizerek gerçekleştirildi. Ve her bir alt küme için tüm zaman boyunca kalsiyum tepkisini analiz etmek. Tam spektrum profillemesi kullanan kalsiyum akısı, çeşitli immün alt kümelerde yüksek parametreli akış sitometrik analizine yol açabilir.
T-hücresi alt kümelerinin tarafsız kümelenmesi için yüksek boyutlu analiz, gelişmiş analiz için yüksek parametreli akış sitometrisi ile birlikte kullanılabilir. Bu teknik, toplu bir numunede birbirleriyle bağlantılı olarak çoklu bağışıklık alt kümelerinin analizi için geliştirilmiştir.
