O protocolo permite que os investigadores meçam simultaneamente a resposta ao cálcio em células T primárias, juntamente com a avaliação de seu subconjunto e fenótipo de superfície. A principal vantagem dessa técnica é que ela evita a necessidade de isolar subconjuntos específicos de células antes de examinar suas respostas de cálcio. Para começar, prepare uma solução estoque de um micrograma por microlitro de Indo-1 AM adicionando 50 microlitros de DMSO em um frasco contendo 50 microgramas de Indo-1 AM. Diluir a solução-mãe num volume adequado de cRPMI e numa concentração de seis microgramas por mililitro.
Coloque o meio em banho-maria a 37 graus Celsius. Em seguida, use esse meio para diluir uma suspensão de célula previamente preparada em uma proporção de um para um para obter cinco a 6 milhões de células por mililitro. Em seguida, a uma placa de cultura de tecidos de 12 poços, adicionar um mililitro de suspensão celular por poço por condição experimental.
Preparar uma única amostra de controle corada para Indo-1 livre de cálcio adicionando EGTA às células carregadas de corante Indo-1. Prepare um poço para controle biológico negativo sem fluoróforos ou corante Indo-1. Preparar um controle positivo de Indo-1 adicionando ionomicina a uma concentração de 50 micromoles à suspensão celular carregada de corante no citômetro de fluxo.
Além disso, prepare um poço para controles de coloração única para populações celulares adicionais usando fluoróforos conjugados com anticorpos. Em seguida, adicione dois microgramas de anticorpo bloqueador do receptor FC por milhão de células e incube a placa por 45 minutos com toques a cada 15 minutos para ressuspender as células. Após a incubação, misture e retire todo o volume de células da placa e adicione-o a tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro.
Centrifugar e decantar o sobrenadante. Uma vez que as células são lavadas com um mililitro de cRPMI pré-aquecido, pellet novamente e decantar o sobrenadante. Ressuspender as células em um mililitro de cRPMI e incubar cada tubo, deixando o topo do tubo levemente aberto para as trocas gasosas, permitindo a completa desesterificação dos ésteres de AM intracelulares.
Em seguida, prepare uma mistura mestre de todos os anticorpos conjugados de fluorocromo definidos pelo usuário e adicione-a às células de repouso por um mililitro do volume celular. Após o repouso, granule as células e lave o pellet ressuspendendo em um mililitro de cRPMI resfriado a quatro graus Celsius. Repita este passo e coloque os tubos sobre gelo.
Ressuspenda amostras individuais em 500 microlitros de cRPMI livre de fenol vermelho usando um tubo de fluxo de poliestireno de cinco mililitros com tampa. Para manter a temperatura usando a análise de fluxo de cálcio, prepare um banho de contas adicionando contas de banho a um pequeno banho de água e aqueça-o até 37 graus Celsius. Corte cuidadosamente um tubo de 50 mililitros ao meio e descarte a parte superior do tubo.
Encha três quartos do tubo restante com contas de banho e deixe-o atingir 37 graus Celsius no banho de contas. Coloque o banho de contas perto de um citômetro de fluxo, juntamente com um suporte de isopor para posicionar o tubo. Antes da análise no citômetro de fluxo, aqueça os tubos individualmente a 37 graus Celsius por sete minutos.
Faça login no software do citômetro de fluxo e clique na guia Biblioteca. Em seguida, selecione etiquetas fluorescentes para adicionar Indo-1 ligado ao cálcio e Indo-1 sem cálcio. Em seguida, selecione laser UV em grupos de etiquetas fluorescentes e clique em adicionar para adicionar um nome de etiqueta fluorescente.
Escolha o comprimento de onda de excitação e emissão a laser e clique em Salvar. Continue para a montagem experimental. Clique na guia Aquisição, Abrir/Criar um novo experimento e adicione as etiquetas fluorescentes desejadas ao experimento.
Crie um grupo de referência e um novo grupo de amostra para o experimento e rotule ambos os grupos. Na guia Aquisições, defina os eventos para registrar no máximo em 10 milhões, o volume de parada para o volume máximo de 3000 microlitros e o tempo de parada para o máximo de 36.000 segundos. Adquira controles corados únicos para anticorpos conjugados definidos pelo usuário incluídos no painel multicolorido e para corante funcional Indo-1.
Adicionar 50 micromoles de ionomicina ao controle positivo e vórtice Indo-1 ligado ao cálcio. Adicione o tubo de fluxo à placa de injeção de amostra e clique em Gravar. Em seguida, adicione o controle negativo de Indo-1 sem cálcio ao citômetro de fluxo e clique em Gravar.
Desmisture os controles manchados clicando no botão Desmisturar. Quando a desmistura estiver concluída, crie gráficos sequenciais usando a planilha não misturada, como SSC-A versus FSC-A, para remover detritos da amostra e SSC-A versus SSC-H para remover duplicatas. Em seguida, crie portões clicando em Plotar.
Adicione um gráfico à planilha e clique duas vezes dentro do portão para criar um condomínio fechado a jusante. Continue até que todas as populações de interesse sejam contabilizadas. Em seguida, aqueça as amostras de controle coradas únicas previamente preparadas a 37 graus Celsius para análise sequencial.
Configure o software de citometria de fluxo e execute DI em água gelada por dois a três minutos para garantir a estabilidade fluídica do citômetro de fluxo. Configure gráficos sequenciais na planilha não misturada criando portas usando o retângulo de polígono ou botões de porta de elipse para incluir a população de interesse. Clique duas vezes dentro do portão e altere os parâmetros dos eixos y e x para SSC-A versus SSC-H.
Complete a definição dos parâmetros do eixo clicando com o botão esquerdo do mouse no eixo. Crie um gráfico com SSC-A versus sinal de corante de viabilidade. Portar as células vivas que são negativas para coloração de corante de amina.
As células vivas negativas para coloração de mortos vivos se agruparão na marca zero nos eixos y e x. Clique duas vezes no gráfico interno para criar um novo gráfico contendo apenas linfócitos vivos de célula única. Mude o eixo Y para Indo-1 versus o tempo no eixo x para visualização do influxo de cálcio.
Em seguida, coloque a amostra biológica aquecida no SIT da máquina. Execute as amostras a 2.500 a 3000 eventos por segundo em uma taxa de fluxo média para visualizar o influxo de cálcio em um número limitado de populações celulares. Adicione o próximo tubo ao banho de contas no controle de aquisição.
Pressione Record para registrar os dados iniciais por 30 segundos para obter um nível basal de sinalização de cálcio na amostra. Em seguida, clique em Parar e remova o tubo da porta de injeção da amostra. Adicione 30 microgramas de anti-CD3 não conjugado diretamente no tubo de amostra para iniciar o influxo de cálcio.
Coloque rapidamente o tubo de volta na porta de injeção da amostra e pressione Gravar no software. Registre os dados por sete minutos, observando o tempo decorrido sob os controles de aquisição no software. Em seguida, pressione Parar no software.
Adicionar um micrograma por mililitro de ionomicina e registrar por 30 segundos para obter o sinal máximo de cálcio nas células de interesse. Continue para a próxima amostra e repita o fluxo de trabalho até que todas as amostras tenham sido coletadas. Salve o experimento e clique no arquivo zip de exportação.
Arquivos não misturados são enviados para o software de análise de citometria de fluxo externo. Um sinal consistente estável em um gráfico de tempo versus dispersão lateral indicou estabilidade fluídica. A população de linfócitos foi delimitada seguida da discriminação de singlets em um gráfico de altura de dispersão lateral versus área.
Singlets foram avaliados quanto à viabilidade. Em seguida, aplicou-se o gating na população CD19 negativa. Esses subgrupos de células T foram avaliados usando anticorpos contra CD4 e CD8 visualizando fluorescência Indo-1 ligada ao cálcio versus o tempo.
Em populações celulares individuais, o gráfico de Indo-1 ligado ao cálcio versus o tempo mostrou uma linha de base antes da estimulação. Um pico de resposta à medida que os níveis de cálcio intracelular diminuíram e a resposta de cálcio provocou a adição de ionomicina. Antes da adição do anticorpo anti-CD3, um fraco sinal de Indo-1 ligado ao cálcio foi detectado.
Durante o pico de resposta, as células mostraram um forte sinal de Indo-1 ligado ao cálcio e redução da Indo-1 livre de cálcio. Aos cinco minutos após o pico, a fluorescência do Indo-1 quase retornou à linha de base. Após a adição de ionomicina, um sinal robusto de Indo-1 ligado ao cálcio foi visualizado, indicando adequada carga de corante das células.
A análise das populações raras foi realizada plotando-se Indo-1 ligado ao cálcio versus Indo-1 livre de cálcio após o gating em cada população de interesse. E analisar a resposta do cálcio ao longo de todo o curso de tempo para cada subgrupo. O fluxo de cálcio usando perfil de espectro completo pode levar à análise por citometria de fluxo de alto parâmetro em uma variedade de subgrupos imunes.
A análise de alta dimensão para agrupamento imparcial de subgrupos de células T pode ser usada em combinação com citometria de fluxo de alto parâmetro para análise avançada. Esta técnica é desenvolvida para a análise de múltiplos subconjuntos imunológicos em conjunto uns com os outros em uma amostra em massa.
