يسمح البروتوكول للباحثين بقياس استجابة الكالسيوم في الخلايا التائية الأولية في وقت واحد جنبا إلى جنب مع تقييم مجموعتها الفرعية والنمط الظاهري السطحي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتجنب الحاجة إلى عزل مجموعات فرعية محددة من الخلايا قبل فحص استجاباتها للكالسيوم. للبدء ، قم بإعداد ميكروغرام واحد لكل ميكرولتر من محلول مخزون Indo-1 AM بإضافة 50 ميكرولترا من DMSO في قنينة تحتوي على 50 ميكروغرام من Indo-1 AM. قم بتخفيف محلول المخزون إلى حجم مناسب من cRPMI وتركيز ستة ميكروغرام لكل ملليلتر.
ضع الوسط في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. ثم استخدم هذا الوسط لتخفيف تعليق خلية معد مسبقا بنسبة واحد إلى واحد للحصول على خمسة إلى 6 ملايين خلية لكل ملليلتر. بعد ذلك ، إلى لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا ، أضف ملليلتر واحد من معلق الخلية لكل بئر لكل حالة تجريبية.
قم بإعداد عينة تحكم واحدة ملطخة ل Indo-1 الخالي من الكالسيوم عن طريق إضافة EGTA إلى الخلايا المحملة بالصبغة Indo-1. قم بإعداد بئر للمكافحة السلبية البيولوجية بدون فلوروفورات أو صبغة Indo-1. قم بإعداد عنصر تحكم إيجابي Indo-1 عن طريق إضافة الأيونوميسين بتركيز 50 ميكرومول إلى تعليق الخلية المحمل بالصبغة عند مقياس التدفق الخلوي.
أيضا ، قم بإعداد بئر لضوابط بقعة واحدة لمجموعات الخلايا الإضافية باستخدام الفلوروفورات المترافقة بالأجسام المضادة. ثم أضف ميكروغرام من الأجسام المضادة التي تمنع مستقبلات FC لكل مليون خلية واحتضان اللوحة لمدة 45 دقيقة مع النقر كل 15 دقيقة لإعادة تعليق الخلايا. بعد الحضانة ، قم بخلط وإزالة الحجم الكامل للخلايا من اللوحة وإضافته إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 ملليلتر.
أجهزة الطرد المركزي وصب الطاف. بمجرد غسل الخلايا بملليلتر واحد من cRPMI الذي تم تسخينه مسبقا ، قم بالحبيبات مرة أخرى وصب المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من cRPMI واحتضان كل أنبوب ، وترك الجزء العلوي من الأنبوب مفتوحا قليلا لتبادل الغازات ، مما يسمح بإزالة الأسترة الكاملة لاسترات AM داخل الخلايا.
بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي من جميع الأجسام المضادة المترافقة الفلوروكرومية المعرفة من قبل المستخدم وأضفها إلى خلايا الراحة مقابل ملليلتر واحد من حجم الخلية. بعد الراحة ، قم بإذابة الخلايا وغسل الحبيبات عن طريق تعليقها في ملليلتر واحد من cRPMI المبرد إلى أربع درجات مئوية. كرر هذه الخطوة وضع الأنابيب على الجليد.
أعد تعليق العينات الفردية في 500 ميكرولتر من cRPMI الخالي من الفينول الأحمر باستخدام أنبوب تدفق البوليسترين سعة خمسة ملليلتر مع غطاء. للحفاظ على درجة الحرارة باستخدام تحليل تدفق الكالسيوم ، قم بإعداد حمام حبة عن طريق إضافة حبات الحمام إلى حمام مائي صغير وتسخينه حتى 37 درجة مئوية. قطع بعناية أنبوب كرونيكل 50 ملليلتر في النصف وتجاهل الجزء العلوي من الأنبوب.
املأ ثلاثة أرباع الأنبوب المتبقي بخرز الحمام واتركه يصل إلى 37 درجة مئوية في حمام الخرز. ضع حمام الخرزة بالقرب من مقياس التدفق الخلوي ، جنبا إلى جنب مع رف الستايروفوم لوضع الأنبوب. قبل التحليل على مقياس التدفق الخلوي ، قم بتسخين الأنابيب بشكل فردي إلى 37 درجة مئوية لمدة سبع دقائق.
قم بتسجيل الدخول إلى برنامج مقياس التدفق الخلوي وانقر فوق علامة التبويب المكتبة. ثم حدد علامات الفلورسنت لإضافة Indo-1 المرتبط بالكالسيوم و Indo-1 الخالي من الكالسيوم. ثم حدد ليزر الأشعة فوق البنفسجية ضمن مجموعات علامات الفلورسنت وانقر فوق إضافة لإضافة اسم علامة الفلورسنت.
اختر الطول الموجي لإثارة الليزر وانبعاثه ثم انقر فوق حفظ. تابع إلى الإعداد التجريبي. انقر فوق علامة التبويب "اكتساب" ، افتح / أنشئ تجربة جديدة وأضف علامات الفلورسنت المطلوبة إلى التجربة.
أنشئ مجموعة مرجعية ومجموعة عينات جديدة للتجربة وقم بتسمية كلتا المجموعتين. ضمن علامة التبويب عمليات الاستحواذ ، اضبط الأحداث على التسجيل إلى الحد الأقصى عند 10 ملايين ، وإيقاف الحجم إلى الحد الأقصى لحجم 3000 ميكرولتر ، ووقت التوقف إلى 36،000 ثانية كحد أقصى. احصل على عناصر تحكم مفردة للأجسام المضادة المترافقة المعرفة من قبل المستخدم والمضمنة في اللوحة متعددة الألوان ولصبغة Indo-1 الوظيفية.
أضف 50 ميكرومول من الأيونوميسين إلى التحكم الإيجابي في Indo-1 المرتبط بالكالسيوم والدوامة. أضف أنبوب التدفق إلى لوحة حقن العينة وانقر فوق تسجيل. ثم أضف عنصر التحكم السلبي Indo-1 الخالي من الكالسيوم إلى مقياس التدفق الخلوي وانقر فوق تسجيل.
قم بإلغاء خلط عناصر التحكم الملطخة الفردية بالنقر فوق الزر Unmix. بمجرد اكتمال فك الخلط ، قم بإنشاء مخططات متسلسلة باستخدام ورقة العمل غير المختلطة ، مثل SSC-A مقابل FSC-A ، لإزالة الحطام من العينة و SSC-A مقابل SSC-H لإزالة الثنائيات. ثم قم بإنشاء بوابات بالنقر فوق مؤامرة.
أضف قطعة أرض إلى ورقة العمل وانقر نقرا مزدوجا داخل البوابة لإنشاء مجتمع مسور في اتجاه مجرى النهر. استمر حتى يتم حساب جميع السكان المعنيين. بعد ذلك ، قم بتسخين عينات التحكم الملطخة المفردة المعدة مسبقا إلى 37 درجة مئوية للتحليل المتسلسل.
قم بإعداد برنامج قياس التدفق الخلوي وقم بتشغيل DI في الماء المثلج لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق لضمان الاستقرار السائل لمقياس التدفق الخلوي. قم بإعداد مخططات متسلسلة على ورقة العمل غير المختلطة عن طريق إنشاء بوابات باستخدام أزرار بوابة المستطيل المضلع أو القطع الناقص لتضمين المحتوى محل الاهتمام. انقر نقرا مزدوجا داخل البوابة وقم بتغيير معلمات المحور y و x إلى SSC-A مقابل SSC-H.
أكمل تحديد معلمات المحور عن طريق النقر بزر الماوس الأيسر على المحور. قم بإنشاء قطعة أرض باستخدام إشارة صبغة SSC-A مقابل قابلية التحمل. بوابة الخلايا الحية التي هي سلبية لتلطيخ صبغة أمين.
تتجمع الخلايا الحية السالبة للتلطيخ الميت الحي عند علامة الصفر على كل من المحور y و x. انقر نقرا مزدوجا فوق المخطط الداخلي لإنشاء مؤامرة جديدة تحتوي على خلايا ليمفاوية حية أحادية الخلية فقط. قم بتغيير المحور Y إلى Indo-1 مقابل الوقت على المحور x لتصور تدفق الكالسيوم.
ضع العينة البيولوجية الدافئة في اللقطة العقيمة للآلة. قم بتشغيل العينات بمعدل 2،500 إلى 3000 حدث في الثانية على معدل تدفق متوسط لتصور تدفق الكالسيوم في عدد محدود من مجموعات الخلايا. أضف الأنبوب التالي إلى حمام الخرزة في التحكم في الاستحواذ.
اضغط على Record لتسجيل البيانات الأولية لمدة 30 ثانية للحصول على مستوى أساسي من إشارات الكالسيوم في العينة. ثم انقر فوق إيقاف وإزالة الأنبوب من منفذ حقن العينة. أضف 30 ميكروغرام من مضاد CD3 غير المقترن مباشرة إلى أنبوب العينة لبدء تدفق الكالسيوم.
ضع الأنبوب بسرعة مرة أخرى على منفذ حقن العينة واضغط على تسجيل في البرنامج. سجل البيانات لمدة سبع دقائق ، وشاهد الوقت المنقضي تحت ضوابط الاستحواذ في البرنامج. ثم اضغط على إيقاف في البرنامج.
أضف ميكروجراما واحدا لكل ملليلتر من الأيونوميسين وسجل لمدة 30 ثانية للحصول على أقصى إشارة كالسيوم في الخلايا ذات الاهتمام. تابع إلى العينة التالية وكرر سير العمل حتى يتم جمع كافة العينات. احفظ التجربة وانقر على تصدير ملف مضغوط.
يتم تحميل الملفات غير المختلطة إلى برنامج تحليل التدفق الخلوي الخارجي. تشير الإشارة المتسقة المستقرة في مخطط زمني مقابل التشتت الجانبي إلى استقرار السوائل. كان سكان الخلايا الليمفاوية متبوعين بتمييز المفردات على قطعة من ارتفاع التشتت الجانبي مقابل المساحة.
تم تقييم المفردات للتأكد من جدواها. ثم تم تطبيق البوابات على السكان سلبيين CD19. تم تقييم هذه المجموعات الفرعية للخلايا التائية باستخدام الأجسام المضادة ل CD4 و CD8 من خلال تصور مضان Indo-1 المرتبط بالكالسيوم مقابل الوقت.
في مجموعات الخلايا الفردية ، أظهر مخطط Indo-1 المرتبط بالكالسيوم مقابل الوقت خط أساس قبل التحفيز. استجابة الذروة مع انخفاض مستويات الكالسيوم داخل الخلايا واستجابة الكالسيوم المستنبطة بإضافة الأيونومايسين. قبل إضافة الأجسام المضادة المضادة ل CD3 ، تم اكتشاف إشارة Indo-1 ضعيفة مرتبطة بالكالسيوم.
خلال ذروة الاستجابة ، أظهرت الخلايا إشارة Indo-1 قوية مرتبطة بالكالسيوم وخفضت Indo-1 الخالية من الكالسيوم. في خمس دقائق بعد الذروة ، عاد مضان Indo-1 تقريبا إلى خط الأساس. بعد إضافة الأيونوميسين ، تم تصور إشارة قوية من Indo-1 المرتبط بالكالسيوم ، مما يشير إلى تحميل صبغة كافية للخلايا.
تم إجراء تحليل للمجموعات النادرة عن طريق رسم Indo-1 المرتبط بالكالسيوم مقابل Indo-1 الخالي من الكالسيوم بعد بوابات على كل مجموعة من السكان المعنيين. وتحليل استجابة الكالسيوم على مدار الدورة الزمنية الكاملة لكل مجموعة فرعية. يمكن أن يؤدي تدفق الكالسيوم باستخدام التنميط الكامل الطيف إلى تحليل قياس خلوي عالي التدفق في مجموعة متنوعة من المجموعات الفرعية المناعية.
يمكن استخدام التحليل عالي الأبعاد للتجميع غير المتحيز للمجموعات الفرعية للخلايا التائية مع قياس التدفق الخلوي عالي المعلمات للتحليل المتقدم. تم تطوير هذه التقنية لتحليل مجموعات فرعية مناعية متعددة بالتزامن مع بعضها البعض في عينة مجمعة.
