이 프로토콜을 통해 연구자는 일차 T 세포의 칼슘 반응을 동시에 측정하고 하위 집합 및 표면 표현형을 평가할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 칼슘 반응을 검사하기 전에 세포의 특정 하위 집합을 분리할 필요가 없다는 것입니다. 시작하려면 50 마이크로 그램의 DMSO를 50 마이크로 그램의 Indo-1 AM이 들어있는 바이알에 첨가하여 Indo-1 AM의 마이크로 리터 당 1 마이크로 그램의 저장 용액을 준비합니다. 원액을 적절한 부피의 cRPMI와 밀리리터당 6마이크로그램의 농도로 희석합니다.
섭씨 37도의 수조에 매체를 넣습니다. 그런 다음 이 배지를 사용하여 이전에 제조된 세포 현탁액을 1:1 비율로 희석하여 밀리리터당 5-600만 개의 세포를 얻습니다. 다음에, 12-웰 조직 배양 플레이트에, 실험 조건당 웰 당 1 밀리리터의 세포 현탁액을 첨가한다.
Indo-1 염료가 로딩된 세포에 EGTA를 첨가하여 칼슘이 없는 Indo-1에 대한 단일 염색 대조군 샘플을 준비합니다. 형광단이나 Indo-1 염료가 없는 생물학적 음성 조절을 위한 웰을 준비합니다. 유세포 분석기에서 염료가 로딩된 세포 현탁액에 50 마이크로몰의 농도로 이오노마이신을 첨가하여 Indo-1 양성 대조군을 준비합니다.
또한, 항체 접합 형광단을 사용하여 추가 세포 집단에 대한 단일 염색 대조군을 위한 웰을 준비합니다. 그런 다음 백만 세포당 2마이크로그램의 FC 수용체 차단 항체를 추가하고 세포를 재현탁하기 위해 15분마다 두드리면서 45분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후, 플레이트로부터 세포의 전체 부피를 혼합 및 제거하고 1.7 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 첨가한다.
원심분리하고 상등액을 디캔팅합니다. 세포가 1밀리리터의 예열된 cRPMI로 세척되면, 다시 펠렛화하고 상청액을 경사 제거한다. 1밀리리터의 cRPMI에 세포를 재현탁하고 각 튜브를 배양하여 가스 교환을 위해 튜브의 상단을 약간 열어 두어 세포 내 AM 에스테르의 완전한 탈에스테르화를 허용합니다.
다음으로, 모든 사용자 정의 형광색소 접합 항체의 마스터 믹스를 준비하고 이를 세포 부피의 1밀리리터 동안 휴지기 세포에 추가합니다. 휴식 후, 세포를 펠렛화하고, 섭씨 4도로 냉각된 cRPMI 1밀리리터에 재현탁하여 펠릿을 세척한다. 이 단계를 반복하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
캡이 있는 5밀리리터 폴리스티렌 플로우 튜브를 사용하여 500마이크로리터의 페놀 레드가 없는 cRPMI에 개별 시료를 재현탁합니다. 칼슘 플럭스 분석을 사용하여 온도를 유지하려면 작은 수조에 목욕 비즈를 추가하여 비드 배스를 준비하고 섭씨 37도까지 데우십시오. 50밀리리터 크로니클 튜브를 조심스럽게 반으로 자르고 튜브 상단을 버립니다.
나머지 튜브의 4분의 3을 목욕 구슬로 채우고 구슬 욕조에서 섭씨 37도에 도달하도록 합니다. 비드 배스를 유세포 분석기 근처에 놓고 스티로폼 랙과 함께 튜브를 배치합니다. 유세포 분석기에서 분석하기 전에 튜브를 개별적으로 섭씨 37도까지 7분 동안 예열합니다.
유세포 분석기 소프트웨어에 로그인하고 라이브러리 탭을 클릭합니다. 그런 다음 형광 태그를 선택하여 칼슘 결합 Indo-1 및 칼슘 무함유 Indo-1을 추가합니다. 그런 다음 형광 태그 그룹에서 UV 레이저를 선택하고 추가를 클릭하여 형광 태그 이름을 추가합니다.
레이저 여기(laser excitation) 및 방출 파장(emission wavelength)을 선택한 다음 Save(저장)를 클릭합니다. 실험 설정을 계속합니다. 획득 탭을 클릭하고 새 실험을 열기/만들기를 클릭하고 원하는 형광 태그를 실험에 추가합니다.
실험에 대한 참조 그룹과 새 샘플 그룹을 만들고 두 그룹에 레이블을 지정합니다. 획득 탭에서 이벤트를 최대 1,000만 개로 기록하고, 중지 볼륨을 최대 3000마이크로리터로 설정하고, 중지 시간을 최대 36, 000초로 설정합니다. 다색 패널에 포함된 사용자 정의 접합 항체 및 Indo-1 기능성 염료에 대한 단일 염색 대조군을 획득합니다.
50마이크로몰의 이오노마이신을 칼슘 결합 Indo-1 양성 대조군에 추가하고 소용돌이칩니다. 플로우 튜브를 샘플 주입 보드에 추가하고 Record(기록)를 클릭합니다. 그런 다음 칼슘이 없는 Indo-1 음성 대조군을 유세포 분석기에 추가하고 기록을 클릭합니다.
Unmix 버튼을 클릭하여 단일 염색 컨트롤을 혼합하지 않습니다. 혼합 해제가 완료되면 샘플에서 잔해물을 제거하기 위해 SSC-A 대 FSC-A, 이중선을 제거하기 위해 SSC-A 대 SSC-H와 같은 혼합되지 않은 워크시트를 사용하여 순차적 플롯을 만듭니다. 그런 다음 플롯을 클릭하여 게이트를 만듭니다.
워크시트에 플롯을 추가하고 게이트 내부를 두 번 클릭하여 다운스트림 게이트 모집단을 생성합니다. 관심 있는 모든 모집단이 설명될 때까지 계속합니다. 다음으로, 순차적 분석을 위해 이전에 준비된 단일 염색 대조군 샘플을 섭씨 37도까지 따뜻하게 합니다.
유세포 분석 소프트웨어를 설정하고 얼음물에서 2-3분 동안 DI를 실행하여 유세포 분석기의 유체 안정성을 보장합니다. 관심 있는 모집단을 포함하도록 polygon rectangle 또는 ellipse gate 버튼을 사용하여 게이트를 생성하여 혼합되지 않은 워크시트에 순차적 플롯을 설정합니다. 게이트 내부를 두 번 클릭하고 y축 및 x축 매개변수를 SSC-A 대 SSC-H로 변경합니다.
축을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 축 매개변수 정의를 완료합니다. SSC-A 대 생존성 염료 신호로 플롯을 만듭니다. 아민 염료 염색을 위해 음성인 살아있는 세포를 게이트합니다.
살아있는 죽은 염색에 대해 음성인 살아있는 세포는 y축과 x축 모두에서 0 표시에 모입니다. 내부 플롯을 두 번 클릭하여 단일 세포 살아있는 림프구만 포함하는 새 플롯을 만듭니다. 칼슘 유입을 시각화하기 위해 Y축을 Indo-1 대 x축의 시간으로 변경합니다.
다음으로 데워진 생물학적 샘플을 기계의 SIT에 넣습니다. 중간 유속에서 초당 2, 500 - 3000 이벤트로 샘플을 실행하여 제한된 수의 세포 집단에서 칼슘 유입을 시각화합니다. 획득 제어에서 비드 배스에 다음 튜브를 추가합니다.
Record를 눌러 30초 동안 초기 데이터를 기록하여 샘플에서 칼슘 신호의 기초 수준을 얻습니다. 그런 다음 중지를 클릭하고 샘플 주입 포트에서 튜브를 제거합니다. 30마이크로그램의 비접합 항-CD3를 샘플 튜브에 직접 추가하여 칼슘 유입을 시작합니다.
튜브를 샘플 주입 포트에 빠르게 다시 놓고 소프트웨어에서 Record를 누릅니다. 7분 동안 데이터를 기록하고 소프트웨어의 수집 제어 하에서 경과된 시간을 관찰합니다. 그런 다음 소프트웨어에서 중지를 누릅니다.
이오노마이신 1밀리리터당 1마이크로그램을 추가하고 30초 동안 기록하여 관심 세포에서 최대 칼슘 신호를 얻습니다. 다음 샘플을 계속 진행하고 모든 샘플이 수집될 때까지 워크플로를 반복합니다. 실험을 저장하고 zip 파일 내보내기를 클릭합니다.
혼합되지 않은 파일은 외부 유세포 분석 소프트웨어에 업로드됩니다. 시간 플롯 대 측면 산란에서 안정적이고 일관된 신호는 유체 안정성을 나타냅니다. 림프구 개체군을 게이트한 후 측면 산란 높이 대 면적의 플롯에서 싱글렛을 식별했습니다.
싱글렛은 생존력에 대해 평가되었습니다. 그런 다음 CD19 음성 집단에 게이팅을 적용했습니다. 이러한 T 세포 하위 집합은 칼슘 결합 Indo-1 형광 대 시간을 시각화하여 CD4 및 CD8에 대한 항체를 사용하여 평가되었습니다.
개별 세포 집단에서, 칼슘 결합 Indo-1 대 시간의 플롯은 자극 전의 기준선을 나타냈다. 세포 내 칼슘 수치가 감소함에 따라 피크 반응이 나타나고 칼슘 반응은 이오노마이신을 추가하여 유도되었습니다. 항-CD3 항체 첨가 전에, 약한 칼슘-결합 인도-1 신호가 검출되었다.
피크 반응 동안, 세포는 강한 칼슘 결합 Indo-1 신호를 보였고 칼슘이 없는 Indo-1을 감소시켰다. 피크 후 5 분 후에 Indo-1 형광은 거의 기준선으로 돌아 왔습니다. 이오노마이신 첨가 후, 칼슘 결합 Indo-1의 강력한 신호가 시각화되어 세포의 적절한 염료 로딩을 나타냅니다.
희귀 개체군의 분석은 관심 있는 각 개체군에 대한 게이팅 후 칼슘 결합 Indo-1 대 칼슘이 없는 Indo-1을 플로팅하여 수행되었습니다. 각 서브세트에 대한 전체 시간 경과에 걸쳐 칼슘 반응을 분석한다. 전체 스펙트럼 프로파일링을 사용하는 칼슘 플럭스는 다양한 면역 하위 집합에서 높은 파라미터 유세포 분석으로 이어질 수 있습니다.
T 세포 하위 집합의 편향되지 않은 클러스터링을 위한 고차원 분석은 고급 분석을 위해 높은 파라미터 유세포 분석과 함께 사용할 수 있습니다. 이 기술은 벌크 샘플에서 서로 결합된 여러 면역 하위 집합의 분석을 위해 개발되었습니다.
