Dairesel RNA'lar farklı biyolojik süreçlerde önemli düzenleyici roller oynar. Bu protokol, konakçı ve patojen etkileşimleri alanında dairesel RNA analizi yapmak için yeni başlayanlar için uygundur. Burada, güvenli RNA tahmini ve nicelleştirmesi, güvenli RNA fonksiyonel zenginleştirme, güvenli RNA, mikro-RNA etkileşim tahmini ve CCE RNA ağ yapıları için gerekli olan aerodinamik bir protokol oluşturan araçlardan birkaçını bir araya getirdik.
Bu kolaylaştırıcı protokol, konakçı ve patojen etkileşim ortamında belirli adayları, tanısal ve prognostik değerleri tanımlamak için klinik örneklere uygulanabilir. Önceden programlama bilgisi olmayanların bu tekniğin ilk aşamasını yapmakta zorlanmalarını bekliyorum. Bu nedenle, bu teknikte kullanılan programlama dillerinin temellerini öğrenmenizi tavsiye ederim.
Genellikle programlama dilinin nasıl uygulandığına bakmanın, tek başına okumaya kıyasla daha bilgilendirici ve anlaşılması daha kolay olduğuna inanıyorum. Başlamak için bir Linux terminali açın ve ana bilgisayarın referans genomunun dizininde, genomu indekslemek için bwa index ve hisat2-build komutlarını çalıştırın. Dosyanın adını, araçların yolunu, indirilen başvuru dosyalarının yolunu ve dizin dosyalarının yolunu içeren bir yml yapılandırma dosyası hazırlayın.
RNA dizisi verilerinin kütüphane türünü belirtin ve varsayılan veya manuel parametreleri kullanarak Ciriquant aracını çalıştırın. RNA dizisi verilerinin kimliklerini, Ciriquant tarafından çıkarılan GTF dosyalarının yolunu ve RNA dizisi verilerinin bir kontrol veya tedavi edilen bir grup olup olmadığını gruplandırmasını içeren bir veri listesi içeren bir metin dosyası hazırlayın. Linux terminalinde, prep_Ciriquant giriş olarak hazırlanmış bir metin dosyasıyla çalıştırın.
Bu çalıştırma bir dosya listesi oluşturur. RNA dizi kimliklerini ve bunların ilgili dize bağı çıktısının yolunu içeren bir veri listesi içeren ikinci bir metin dosyası hazırlayın. Dosya düzeni, gruplandırma sütunu çalıştırılmadan önceden hazırlanmış metin dosyasına benzer olmalıdır.
prepde'yi çalıştırın. py gen sayısı matris dosyalarını oluşturmak için bir girdi olarak bu metin dosyası ile. library_info ile Ciri_DE_Replicate yürütün.
csv, circRNA_BSJ. csv ve gene_count_matrix. CSV dosyalarını son circRNA_DE çıktısı almak için giriş olarak.
tsv dosyası. Diferansiyel olarak eksprese edilen veya DE, sirkRNA'ların sayısını filtrelemek ve belirlemek için circRNA_DE açın. R veya başka bir elektronik tablo yazılımı içeren tsv dosyası.
WinRar veya 7-Zip gibi ilgili yazılımı kullanarak CircR GitHub sayfasından indirdikten sonra CircR dosyasının içeriğini açın ve ayıklayın. Analizin yapılacağı yeni bir dizine. Ardından, circRNA miRNA analizini yapmadan önce SAMTools, miRanda, RNAhybrid ve Pybedtools gibi önkoşul yazılım uygulamalarını yükleyin.
SAMtools FAIDX komutunu kullanarak ilgili organizmanın referans genom dosyasını indeksleyin ve sekmeyle ayrılmış bir yatak dosyasında ilgilenilen DE sirkRNA'larının koordinatlarından oluşan bir giriş dosyası hazırlayın. Ardından, Circr'yi çalıştırın. Python3 kullanarak py.
Ve argümanlar sirkRNA giriş dosyasını, ilgilenilen organizmanın daha hızlı genomunu, seçilen organizmanın genom versiyonunu, iş parçacığı sayısını ve komut satırındaki çıktı dosyasının adını belirttiğinden. Circr analizi tamamlandıktan sonra, program CSV formatında bir circRNA-miRNA etkileşim dosyası çıkarır. İlgilenilen sirkRNA'ları ve hedef miRNA'larını içeren sekmeyle ayrılmış bir dosya hazırlayın.
İlk sütun circRNA adından oluşur. İkinci sütun, ilk sütundaki RNA tipini belirtir. Üçüncü sütun hedef miRNA'dır.
Ve dördüncü sütun, üçüncü sütundaki RNA tipini belirtir. CeRNA ağ haritasını oluşturmak için Cytoscape yazılımını açın, dosyaya gidin, dosyadan içe aktarın, ağ oluşturun, hazırlanan dosyayı seçin ve yükleyin. Ağın görsel stilini değiştirmek için stil düğmesine basın.
Ardından dolgu renginin sağ tarafındaki oka basın, sütun için türü, eşleme türü için ayrık eşlemeyi seçin ve her RNA türü için istenen rengi seçin. Bundan sonra, düğümlerin şeklini değiştirmek için şekle gidin ve daha önce gösterilen adımları izleyin. Gen ontolojisi ve sirkRNA'ların ebeveyn geninin KEGG analizi için, küme profilleyicisini ve orgunu sağlayın. Hs.eg.
DB paketleri stüdyomuza kuruldu. DE circRNA bilgilerini R studio çalışma alanına aktarın. Kullanıcı ebeveyn gen adlarını entrezid gibi diğer biçimlere dönüştürmek isterse, teklif veren gibi bir işlev kullanın.
Gen kimliğini girdi olarak kullanın ve varsayılan parametreleri kullanarak küme profili veya paketi içindeki enrichGO işlevini kullanarak gen ontolojisini ve zenginleştirme analizini çalıştırın. Son olarak, girdi olarak gen kimliğini ve küme profil oluşturucu paketi içindeki enrichKEGG işlevini kullanarak KEGG zenginleştirme analizini çalıştırın. DE sirkRNA ebeveyn genlerinin gen ontolojisi zenginleştirme analizinin kabarcık grafiği bu şekilde gösterilmiştir.
X eksenindeki gen oranı, belirli bir gen ontolojisi terimiyle ilişkili giriş listesindeki genlerin sayısının, o terimdeki toplam gen sayısına bölünmesiyle elde edilir. Grafikteki nokta boyutu, belirli bir gen ontolojisi terimiyle ilişkili giriş listesindeki genlerin sayısı olan sayı değeri ile temsil edilir. Noktaların boyutu ne kadar büyük olursa, terimle ilişkili giriş genlerinin sayısı da o kadar büyük olur.
Grafikteki noktalar, bir ek açıklama teriminin gözlemlenen sıklığı ile tesadüfen beklenen frekans karşılaştırılarak hesaplanan pvalue'ya göre renk kodludur. Zenginleştirme istatistiksel olarak anlamlıdır ve kabarcık grafiğinde yalnızca pvalue 0,01'den küçükse çizilir. Burada, biyolojik süreçler için ilk üç zenginleştirme, ribonükleoprotein kompleksi biyogenezi, virüse verilen cevabı ve biyotik bir uyarana verilen cevabın düzenlenmesini içerir.
Moleküler fonksiyonlar için, sadece RNA ve tek sarmallı RNA bağlanması üzerinde etkili olan katalitik aktivite istatistiksel olarak zenginleştirilir. Hücresel bileşenler için, sadece retromer kompleksi istatistiksel olarak zenginleştirilir. Bu temsili görüntü, bir kabarcık grafiğinde DE circRNA ebeveyn genlerinin KEGG zenginleştirme analizini göstermektedir.
Bu durumda sadece iki KEGG terimi zenginleştirilmiştir, influenza A ve viral yaşam döngüsü yolları. Bu prosedürü denerken en önemli şeylerden biri, yaralanma sırasında kullandığınız RNA sirk veri kümesinin doğru özellik tipini sağlamaktır. Burada sağlanan biyo-formatik boru hattı, potansiyel seküler RNA'ların ve fonksiyonel ek açıklamaların tahmin edilmesine yardımcı olur.
Bununla birlikte, sağlam kanıtlar sağlamak için iyi yönlendirilmiş doğrulamaya hala ihtiyaç duyulacaktır. Bu protokol, araştırmacıların güvenli RNA'yı ve daha fazla çalışabilecekleri farklı kodlar ve patojen etkileşimlerindeki potansiyel fonksiyonel rollerini keşfetmelerini sağlayacaktır.
