MS2 benzeşimlilik saflaştırma RNA dizilimi veya MAPS ile birleştiğinde bakterilere ilgi gösteren herhangi bir RNA'nın tüm hedef milyonlarını tanımlamak için geliştirilmiştir. Bu teknoloji, düzenleme mekanizmasından bağımsız olarak her türlü sRNA ortaklarının tanımlanmasını mümkün kılar. SRNA'ya bağımlı düzenleyici ağların karakterizasyonu, konak hücrelerdeki bakterilerin üretimini, biyofilm oluşumunu ve hayatta kalmasını daha iyi anlamaya yardımcı olacak ve sonuçta stafilokok enfeksiyonlarına karşı savaşacaktır.
Bu protokol herhangi bir patojenik veya patojenik olmayan gram pozitif bakteriye uygulanabilir. Prosedürü gösteren Noemie Mercier, Dr. Pascal Romby'nin laboratuvarından bir doktora öğrencisi. Başlamak için, üç mililitre BHI ortamında pCN51 P3 MS2 sRNA veya pCN51 P3 MS2 plazmidleri taşıyan bir suş kolonisi yetiştirin ve kopyalarda mikrolitre eritromisinin başına 10 mikrogram ile desteklenmiştir.
Her bir gece kültürünü 0,05'in 600'üne ulaşmak için eritromisinin takviye edildiği 50 mililitre taze BHI ortamında seyreltin. Kültürleri 37 santigrat derecede büyütün ve altı saat boyunca 180 RPM'de sallanın. Her kültürü 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 2.900 kez G'de santrifüjleyin, ardından süpernatantı atın, dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın veya peletleri buzda tutun ve doğrudan mekanik hücre lizisi yapın.
Mekanik hücre lizizini gerçekleştirmek için, beş mililitre tampon A'da peletleri yeniden depolar ve yeniden biriktirilen hücreleri 3,5 gram silika boncuklu 15 mililitre santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri mekanik bir hücre liziz cihazına yerleştirin ve saniyede dört metrede 40 saniyelik bir döngü çalıştırın. Tüpleri 15 dakika boyunca 2.900 kez G'de santrifüjleyin, sonra süpernatantı kurtarın ve buzda tutun.
Süpernatantın açık olduğundan emin olun, değilse santrifüjü tekrarlayın. Sütun ucunu çıkarın, ardından bir sütun rafı içine bir kromatografi sütunu koyun ve sütunu ultra saf suyla yıkayın. 300 mikrolitre amiloz reçinesi ekleyin ve sütunu 10 mililitre tampon A.Seyreltin 1, 200 mbp-MS2 proteini ile altı mililitre tampon A'da yıkayın ve sütuna yükleyin.
Sütunu 10 mililitre arabellek A.Next ile yıkayın, MS2 benzeşim temizleme gerçekleştirin. Hücre lisatını sütuna yükleyin ve akış fraksiyonunu temiz bir toplama tüpünde toplayın. Sütunu 10 mililitre tampon A ile üç kez yıkayın ve yıkama fraksiyonunu toplayın, ardından sütunu bir mililitre tampon E ile elüte edin ve elution fraksiyonunu iki mililitrelik bir mikrotüpte toplayın.
Toplanan tüm fraksiyonları RNA çıkarma işlemine kadar buzda tutun. RNA ayıklama için her kesirden bir mililitre kullanın. RNA'ya bir hacim fenol ekleyin ve kuvvetlice karıştırın, ardından karışımı 20 santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüjleyin.
Üst fazı temiz bir iki mililitre mikrotüpe aktarın. Bir hacim kloroform izoamil alkol ekleyin ve santrifüjü tekrarlamayı tekrarlayın, ardından üst fazı yeni bir tüpe aktarın. pH 5.2'de 2.5 cilt 100% soğuk etanol ve 0.1 hacim üç azı dişi sodyum asetat ekleyin ve gece boyunca eksi 20 santigrat derecede çökelti yapın.
Ertesi gün, tüpleri 16.000 kez G ve dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Etanol'ü bir pipetle yavaşça çıkarın, peletin rahatsız olmamasına dikkat edin. Beş dakika boyunca 500 mikrolitre % 80 soğuk etanol ve santrifüj ekleyin.
Etanol'ü yavaşça pipetle atarak atın, ardından peletin çalışma modunda beş dakika boyunca vakum konsantratörü kullanarak kurutun. Peletin uygun miktarda ultra saf suda yeniden süzün. Bu protokol S.aureus'taki RsaC targetome'u incelemek için kullanıldı.
MAPS teknolojisi kullanılarak RsaC ile doğrudan etkileşime giren birkaç mRNA tespit edildi ve oksidatif stres ve metalle ilgili yanıtlardaki önemli rolünü ortaya koydu. MS2 sRNA yapılarını doğrulamak ve ifade kalıplarını görselleştirmek için, hücreler BHI ortamında iki, dört ve altı saatlik büyümeden sonra hasat edildi. RNA çıkarıldı ve RsaC'ye özgü DIG probu kullanılarak Kuzey leke analizi yapıldı.
Endojen RsaC seviyesi altı saatlik büyümeden sonra önemli ölçüde artmıştır. Daha da önemlisi, MS2-RsaC 544 ve MS2-RsaC 1, 116 seviyesi altı saatte endojen RsaC ile karşılaştırılabilirdi. Benzeşim saflaştırması yapıldı ve RNA'lar, sadece MS2 etiketini ve MS2-RsaC 544 yapısını ifade eden mutant RsaC suşunu ifade eden vahşi tip suştaki ham özüt, akış ve elution fraksiyonlarından çıkarıldı.
1, 116 nükleotid uzun endojen RsaC, elütion fraksiyonunda zenginleştirilmiştir, ancak uzunluğu ve karmaşık ikincil yapısı nedeniyle özellikle benzeşim sütunu ile etkileşime girdi. MS2-RsaC 544, elüsyon fraksiyonunda yüksek oranda zenginleştirilmiş ve MS2-MBP füzyon proteini tarafından başarıyla korunduğunu göstermiştir. Biyoinformatik bir analiz, MS2 sRNA ve MS2 kontrolü arasındaki kat değişimine göre putatif mRNA hedeflerini ortaya koydu ve bu da sodA'nın ilk putatif hedef olduğunu gösterdi.
Ms2 benzeşim saflaştırması, SODA'nın MS2 kontrolüne kıyasla MS2-RsaC 544 ile verimli bir şekilde birlikte zenginleştiğini gösterdikten sonra Kuzey blot analizi SODA'ya özgü DIG probu gerçekleştirdi. Bu protokolü denerken, MS2 etiketinin eklenmesinin sRNA onayını, kararlılığını veya işlevini etkileyebileceğini unutmayın. Bu dikkatle izlenmelidir.
MAPS, sRNA-RNA hedefleri eşleştirmesinin anlık görüntüsünü sağlar. Daha fazla deneysel doğrulama işlevlerini çözecektir. Bu teknik, herhangi bir bakteride sRNA düzenleyici ağlar oluşturmak için güçlü bir aracı temsil eder.
