Bu protokol, kemik iliğinden türetilmiş ve doku faktörlerine veya sitokinlere hiç maruz kalmamış yüksek miktarda uyarılmamış makrofajlar elde etmeyi amaçlar. Bu tekniğin temel avantajı, tek bir hayvandan elde edilen hücre sayısıdır. Doğru işlem ile yaklaşık 2 çarpı 10 üzeri 7 makrofaj gücü elde edilebilir.
Bu yöntem, hücre biyolojisi, patoloji, immünoloji ve parazitoloji gibi makrofajları inceleyen farklı alanlardan araştırmacılara yardımcı olabilir, Hücreler her zaman kontaminasyona karşı hassas olduğundan, hücre canlılığını korumak için tüm steril adımlara dikkat etmek ve laminer akışlı bir biyogüvenlik kabini kullanmak gereklidir. Prosedürü gösteren Izabela Aparecida de Souza olacaktır. Laboratuvarımızdan bir yüksek lisans öğrencisi.
Uygun şekilde ötenazi yapılmış sekiz haftalık C57BL / 6 vahşi tip erkek fare üzerinde işleme başlamak için, fareyi% 70 etanol çözeltisi ile ıslatın. Steril makas kullanarak, karın boyunca bir santimetrelik bir kesi yapın ve arka bacakların kası tamamen açığa çıkana kadar cildi çıkarın. Ardından, uyluk kemiği ve kaval kemiğini kırmadan arka bacakları kalça yüksekliğinde dikkatlice çıkarın.
Sağlam arka ayakları% 70 etanol çözeltisi içeren konik bir santrifüj tüpüne koyun. Laminer akışlı bir biyogüvenlik kabini içinde, izole edilmiş bacakları %70 etanolden steril PBS'ye aktarın. Forseps ve dezenfektan mendil kullanarak, bağlı tüm kasları ve fasyayı çıkararak kemikleri temizleyin.
Ardından, kemik iliğini açığa çıkararak kemik epifizini her iki ucundan kesmek için steril bir cerrahi neşter bıçağı kullanın. 20 mililitrelik bir şırıngayı% 2 penisilin streptomisin çözeltisi ile desteklenmiş 10 mililitre steril PBS ile doldurun ve buna 26 gauge bir iğne bağlayın. Bir elinizle anatomik diseksiyon forsepsleri kullanarak kemiği tutun.
Kemiği ezmeden iğneyi kemik boşluğuna dikkatlice sokmak için diğer elinizi kullanın. Daha sonra, kemiğin içini PBS ile yıkayın ve kemik iliğini steril bir konik santrifüj tüpünde toplayın. Yıkandıktan sonra kemik boşluğu beyaz görünmelidir.
Toplanan hücreleri 300G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini bir mililitre DMEM / F1210 ortamında yeniden süspanse edin. Süspansiyonu homojenize edin ve toplam hacmi 10 mililitreye çıkarmak için dokuz mililitre daha ortam ekleyin.
100 mililitre x 20 milimetre ölçülerinde 10 yuvarlak plastik Petri kabının her birine bir mililitre progenitör hücre süspansiyonu ekleyin. Düzgün bir dağılım elde etmek için hücreleri bir pipetle plakalara yayın. Ardından, her yemeğe %20 L929 hücre süpernatanı ile takviye edilmiş dokuz mililitre DMEM/F1210 ekleyin.
Bulaşıkları 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Üçüncü gün, her yemeğe %20 L929 hücre süpernatanı ile takviye edilmiş 10 mililitre DMEM / F1210 ortamı ekleyin. Her tabakta elde edilen 20 mililitre kültür ortamı, olgunlaşmaya kadar hücre büyümesi için yeterlidir.
Süpernatanları tüm kültür yemeklerinden atın. Her bir kültür kabını 10 mililitre steril magnezyum ve kalsiyum içermeyen PBS ile yıkayın, önceden 37 santigrat dereceye ısıtın ve yıkadıktan sonra çözeltiyi atın. Her yemeğe 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış üç mililitre enzimatik olmayan hücre ayrışma çözeltisi ekleyin.
37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 10 dakika inkübe edin. Ardından, makrofajların hücre kültürü kaplarından ayrılıp ayrılmadığını görselleştirmek için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanın. Serolojik bir pipet kullanarak, bulaşıkları enzimatik olmayan hücre ayrışma solüsyonu ile yıkayın, tam makrofaj ayrışmasını sağlamak için tekrar tekrar dairesel hareketler yapın.
Çözeltiyi tüm kültür kaplarından toplayın ve 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpünde birleştirin. Bir kez daha, boş kültür kaplarına 10 mililitre steril, önceden ısıtılmış PBS ekleyin. Toplanan kombine çözeltiyi içeren konik tüpü 300G ve dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı atın ve peleti bir mililitre DMEM / F1210 ile yeniden süspanse edin. Hücrelere zarar vermeden yukarı ve aşağı pipetleyerek süspansiyonu yavaş ve dikkatli bir şekilde homojenize edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri saymak için 10 mikrolitre tripan mavisi ekleyerek makrofaj çözeltisinin 10 mikrolitrelik bir alikotunu seyreltin.
Yedinci günde, her yemek yaklaşık 2 milyon makrofaj üretecektir. L929 süpernatantından makrofaj koloni uyarıcı faktöre maruz kalma, kemik iliği progenitörlerini kademeli olarak olgun makrofajlara dönüştürdü ve sitoplazmik uzantılara bağlı tipik yayılma morfolojisi gösterdi. Üçüncü günde, birkaç zar çıkıntısı ile tipik bir yuvarlak şekil morfolojisine sahip birkaç olgunlaşmamış makrofaj ortaya çıktı.
Tüm süreç boyunca dönüşmelerine rağmen, yeterli sayı ve olgunluğa ulaşmak için yedi gün gerekliydi. Elde edilen makrofajlar, akım sitometri analizinde büyüklük ve taneciklik açısından homojen bir popülasyon sergilemiştir. Ayrıca, popülasyonun %100'ü karakteristik F480 ve CD11B yüzey moleküllerini eksprese etti ve iyi tanımlanmış tek bir hücre popülasyonu oluşturdu.
Olgun ve iyi diferansiye makrofajların fagositoz yeteneği, makrofajların içindeki fagositoz Leishmania majör parazitlerini gösteren floresan mikroskopi görüntüleri ile doğrulandı. Steril olmayan bir ortamda yapılması ve en önemli bulaşma kaynağı olması nedeniyle bacaklar hayvandan dikkatli bir şekilde uzaklaştırılmalıdır. Laminer akışlı biyogüvenlik kabini dışında bacaklar kırılmamalıdır.
Bu protokolden elde edilen kemik iliği kaynaklı makrofajlar, daha sonra makrofaj fizyolojisini anlamak için makrofaj in vitro polarizasyon yapmak için kullanılabilir.
