Bu protokol, redoks mekanizmalarına müdahale edilmesini önlemek için düşük BH4 ve nitrat seviyelerine sahip dikkatlice tanımlanmış ortam ve serum kullanarak iNOS veya BH4 eksikliği olan farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların kültürlenmesine yardımcı olur. Kültür prosesindeki potansiyel kirletici madde seviyelerini dikkatli bir şekilde kontrol ederek, nitrik oksit girişimini sınırlayabilir, model sistemin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini sağlayabiliriz. Bu yöntem, biyopterinlerin, nitrik oksidin ve bu temel bileşiklerle ilgili herhangi bir aşağı akış faktörünün doğru ölçümlerini sağlar.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Thomas Nichol olacaktır. Başlamak için, herhangi bir kürk veya kalıntıyı yıkamak için bacakları% 70 etanol içine iki dakika boyunca yerleştirin. Ardından, bacakları temiz, steril bir bakteriyolojik Petri kabına aktarın.
Kemiklerin uzunluğu boyunca bıçakla dikkatlice kazıyın, tendonları kesin ve kası kemikten çıkarın. Kemikler kastan temizlendikten sonra, tibianın tepesindeki, dizin hemen altındaki epifizi kesin. Tibia alt uçta, fibula ile kesişme noktasının hemen üstünde kesilebilir.
Son olarak, femur her iki ucunda, diz ve kalça eklemlerinin hemen altındaki epifizi kesin. Kemik iliğini yıkamak için, 10 mililitrelik bir şırıngayı 10 mililitre PBS ile doldurun ve bir iğneye takın. Daha sonra iğneyi kemiğin medüller boşluğuna yerleştirin.
İğneyi yukarı ve aşağı doğru çalıştırarak bir ila iki mililitre PBS ile yavaşça yıkayın. Ardından, süspansiyonu ayrıştırmak için bir mililitrelik bir şırınganın içine ve dışına beş ila on kez çekin. Süspansiyonu bir mililitrelik bir şırıngada toplayın ve 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden temiz bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne geçirin.
Son olarak, örnekleri buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra kullanmak üzere kemik iliğini dondurmak için, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1000 G'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve kırmızı peleti iki mililitre antifriz içinde yeniden askıya alın.
Ardından, gece boyunca 80 santigrat derecede inkübe edin. Dondurulmuşsa, süspansiyonu 37 santigrat derecede hızla çözün. Hücre süspansiyonunu üç mililitre DMEM / F-12 ortamı içeren temiz bir steril tüpe aktarın.
Daha sonra, hücreleri santrifüjleme ile pelet edin. Süpernatantı atın ve peleti hazırlanan DMEM / F-12 ortamının üç mililitresinde yeniden askıya alın. Hücreleri sayın ve hazırlanan DMEM/F-12 ortamında TC kaplamasız plastik kaplara yerleştirin.
Daha sonra, hücreleri% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Beşinci günde, DMEM / F-12 ortamının orijinal hacminin% 50'sini ekleyerek hücreleri besleyin. Altıncı günde, hazırlanan GM-CSF'yi mikrolitre başına 50 nanogramlık son konsantrasyona doğrudan hücre kültürü ortamına ekleyerek hücreleri uyarın.
Yedinci günde, tüm ortamları hücrelerden çıkarın. Daha sonra, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile kısaca yıkayın ve% 2 düşük endotoksin FBS,% 2X penisilin veya streptomisin, L-glutamin, mikrolitre M-CSF başına 25 nanogram ve mikrolitre GM-CSF başına 50 nanogram içeren DMEM / F-12 ortamı ekleyin. Son olarak, makrofajları M0 fenotipine aktive etmek için hücreleri gece boyunca medyada inkübe edin.
M1 fenotipi için, hücreleri mikrolitre LPS başına 100 nanogram ve mikrolitre IFN-gama başına 10 nanogram ile uyarın. M2 fenotipi için, hücreleri mikrolitre IL-4 başına 100 nanogram ile uyarın. Hücreleri gece boyunca inkübe edin.
Sekizinci günde, hücreler araştırmacının ihtiyaçlarına göre hasat veya aşağı akış işleme için hazırdır. % 10 FBS ile desteklenen medya, M-CSF ve GM-CSF veya LCM'den bağımsız olarak benzer nitrit ve tetrahidrobiyopterine sahipti. Ancak LCM takviyeli ortamlarda toplam biyopterin seviyeleri daha yüksekti.
Bununla birlikte, farklı LCM partileri arasında daha fazla değişkenlik gözlenmiştir. PCR, vahşi tip farelerde 1030 baz çifti bir ürün gösterirken, GCH nakavt fareleri, kritik ekzonların eksizyonunu doğrulayan 1392 baz çifti bir ürün üretti. Tamoksifen tedavisi, nakavt hücrelerindeki GCH proteinini ortadan kaldırdı.
Nakavt ve kontrol hücreleri, LPS ve IFN stimülasyonunu takiben hala iNOS üretti. Koşullu GCH nakavt farelerinden kültürlenen BMDM'ler, tetrahidrobiyopterin ve azalmış nitrit sergiledi. LCM ortamında kültürlenen aynı hücrelerin GCH1 ekspresyonu yoktu.
Bununla birlikte, hücreler nakavt sonrasında önemli miktarda tetrahidrobiyopterin ve nitrit üretir. Sekizinci günde, farklı Tamoksifen konsantrasyonlarında aktive edilmemiş kontrol ve GCH nakavt BMDM'leri arasında morfolojide anlamlı bir fark yoktu. BMDM'ler, yuvarlak yapışkan hücreler ve uzatılmış ekstremiteler ile uyarılmamış makrofajlardan beklenen özellikleri gösterir.
Bunun gibi birincil hücre ile çalışırken, tüm doku ve ekipmanı iyice sterilize etmek zorunludur. Ayrıca, düşük nitrik oksit ve BH4 ortamını korumak için doğru ortamı ve takviyeyi seçmek önemlidir. Hücre peletleri ve ortamları, nitrik oksit, biyopterin veya hücresel redoks durumunun rolüne odaklanarak çeşitli aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.
Diğerlerinin yanı sıra HPLC, qPCR ve Western blot içerebilir.
