Jan Van den Bossche received a Junior Postdoc grant from the Netherlands Heart Foundation (2013T003) and a VENI grant from ZonMW (91615052). Menno de Winther is an Established Investigator of the Netherlands Heart Foundation (2007T067), is supported by a Netherlands Heart Foundation grant (2010B022) and holds an AMC-fellowship. We also acknowledge the support from the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development and the Royal Netherlands Academy of Sciences for the GENIUS project &#8220;Generating the best evidence-based pharmaceutical targets for atherosclerosis&#8221; (CVON2011-19). We acknowledge Seahorse Bioscience for making open access publication possible. The authors thank Riekelt Houtkooper and Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, The Netherlands) for all previous assistance with the Seahorse analyzer.

1. Kültürleme ve Polarizasyon Kemik İliği-türevli Makrofajlar <ol><li> Gün 0: ilgi 6-10 haftalık farelerden izole edin femur ve tibia kemikleri (bu deneyde C57BL / 6). </li><li> Kemiklerden kas dokusu çıkarın ve buz gibi soğuk PBS ile dolu bir 9 cm&#39;lik petri tabağına kemikleri yerleştirin. </li><li> % 70 etanol ile dolu bir 9 cm Petri için kemik aktarın ve yavaşça 30 sn için plaka çalkalayın. </li><li> Buz gibi soğuk steril PBS ile dolu bir taze 9 cm Petri kabı kemikleri aktarın. </li><li> Steril makas ile her iki ucunda ve femur tibia kesin. </li><li> 10 ml&#39;lik bir şırınga ve bir tane 25 G iğne kullanılarak 10 ml buz gibi soğuk PBS ile kemik steril yıkayın. 50 ml&#39;lik bir tüp içinde kemik iliği toplamak. </li><li> 23 G iğne kullanarak yeni bir 50 ml tüp kemik iliği hücreleri aktarın. </li><li> 25 G iğne ile bu adımı yineleyin. Not: Bu adımlar hücre kümeleri ve kemik kalıntılarını çıkarmak için gereklidir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Sup atınernatant ve 40 ml hücre kültür ortamında (RPMI-1640 artı 2 mM L-glutamin,% 10 FCS, penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 ug / ml) ve% 15 süzüldü L-929 hücre hücreleri tekrar süspansiyon ( ATCC CCL-1), L-929 hücre koşullu ortam yerine M-CSF (ya da seçenek olarak 10 ng / ml yeniden birleştirici M-CSF ihtiva eden -conditioned ortamı). Not: L-929 hücre klimalı ortamda nesil 2013 11 daha önce bu dergide ayrıntılı edildi </li><li> Kültür, 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde levha başına 20 ml kültür ortamı içinde iki adet 15 cm Petri kapları (makrofaj bu plastiğin ayrılmaz çünkü hücre kültürü ile muamele edilmiş plakalar kullanmayın) bir fare hücreleri. </li><li> 20 ml daha büyük hücre kültür ortamı çıkarmadan, 3. günde 10 ml taze kültür ortamı hücre ekleyin. </li><li> Aksi takdirde 6. günde 20 ml taze kültür ortamı ile her plakanın eski orta değiştirin yapışmayan hücreler de kaldırılır. </li><li> 8. Gün: <ol><li> Onlara 5 m kuluçka hücreleri Ayır(otoklavlanmış, H2O içinde 135 mM potasyum klorid ve 15 mM sodyum sitrat), 37 ° C de 10 ml tuzlu su sitrat ve 10 ml PBS ile yıkayın. Hücre sayacını kullanarak günde 8 olgun, kemik iliği türevli makrofajlar (BMDM) sayın. </li><li> Görsel denetim veya flow sitometri ile Olgun oluşumunu (CD11b + F4 / 80 +) BMDM doğrulayın. 100 ul PBS içinde 20 dakika boyunca PBS içinde 1/100, anti-CD16 / CD32 ile Blok 10 5 hücreleri, oda sıcaklığında anti-CD11b-FITC ile 1/200 artı 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 ile inkübe yıkama ve flow sitometri ile analiz edin. Not:. Kültürleme fare kemik iliği kökenli makrofajlar Ying ve ark 11 tarafından daha önce bu dergide detaylı olarak yayınlanmıştır. </li></ol></li><li> Tohum 50.000 hücre 100 ul kültür ortamı içinde bir hücre kültürü mikrotablada oyuk başına (optimum hücre sayımları optimize edilmesi gerekir). Arka plan düzeltme kuyuları (A1, A12, H1, H12) hücreleri tohum ve bu kuyulardan sadece orta (hücre) koymayın İpucu:. Bir açı a at pipet tutunyarım en homojen hücre katmanı için kuyuların yan aşağı butik. </li><li> Hücreler, 1 saat için bir hücre kültürü kaputu oda sıcaklığında oturmasına izin verin. Bu hücre dağılımı eşit teşvik etmek ve kenar etkilerini azaltacaktır. 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör bir mikroskop ve kültür kullanan uyumu izlemek. </li><li> Üç saat sonra kaplama, 10 ng / ml LPS, veya 20 ng / 24 st için hücreleri uyarmak ml IL-4, sırasıyla, M1 veya M2 makrofajlar üretmek için rekombinant fare. Bir kontrol olarak tedavi edilmemiş saf (M0) makrofajlar ekleyin. IL-6, IL-12 LPS ile indüklenen salgısının ölçülmesiyle doğru M1 ve M2 makrofaj kutuplaşma değerlendirilmesi, TNF (ELISA) ve IL-4 ile uyarılan arginaz-1 aktivitesi ve / veya NMR (CD206) ile MGL (CD301) yüzey ekspresyonu Daha önce 3,11 açıklandığı gibi (flow sitometri). Not: Bu noktada, hücreler (önceden) diğer faktörler ile uyarılabilir ilgi veya makrofajlar farmakolojik bileşiklerle ile tedavi edilen. Yana, ayrı kuyuları arasındaki varyasyon subs olabilirtantial, bu durumda en az 4 ve ideal olarak 6 kuyu kullanılması tavsiye edilir. </li></ol> Hücre dışı Akı Testinin 2. Hazırlık <ol><li> Bir gün tahlil çalıştırmadan önce sensör kartuşu hidrat: <ol><li> Bir sonraki yarar plakasına ters sensör kartuşunu yerleştirin. </li><li> Kalibrant çözeltisi 200 ul programı bir levhanın her bölmesine doldurun ve kalibrant çözeltisi sensörleri daldırılması programı plakası üzerine sensör kartuşunu indirin. </li><li> Kalibrant çözüm düzey olmayan bir CO 2 37 ° C inkübatör O / N batmış sensörleri ve yer tutmak için yeterince yüksek olduğundan emin olun. </li></ol></li><li> Analiz aşağıda belirtildiği gibi gününde deney ortamı hazırlayın: <ol><li> 37 ° C sıcak bir 50 ml XF taban ortamı. </li><li> 2 mM nihai konsantrasyon elde etmek için 500 ul 200 mM L-glutamin ekleyin. </li><li> 1 N NaOH ile 7.4&#39;e pH ayarlama ve 0.2 uM filtre ile sterilize ve 37 ° C&#39;de deney ortamını tutun. </li></ol></li><li> Yavaşça polarize makrofajlardan hücre kültür ortamı çıkarın ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C&#39;de saklayın (örneğin ELISA uygun makrofaj kutuplaşma incelemek için). , 100 ul deney ortamı ile hücreleri yıkayın kuyu başına 180 ul tahlil orta eklemek ve hücreler yıkanıp değil mikroskop altında doğrulayın. Deney döngüsünden önce 1 saat boyunca CO2 olmadan 37 ° C inkübatör hücre kültür plakası yerleştirin. </li><li> 37 ° C&#39;ye kadar, Tablo 1 &#39;de tarif edildiği gibi, sıcak D kadar 10 x enjeksiyon bileşik karışımları A Hazırlama, 7.4 ve filtre ile sterilize pH ayarlamak. <ol><li> 10x hücre kültür havuzlarına nihai konsantrasyon, bu karışımlar içinde tüm bileşikleri yapmak ve her hücre tipi için, bu konsantrasyonlar optimize eder. </li></ol></li><li> Bağlantı noktaları A, B, C ve D, respe hazırlanan 10x enjeksiyon madde karışımlarının belirtilmedikçe hacim (Tablo 1) ile donatılmış yükleme kılavuzları kullanarak sensör kartuşunu doldurmactively. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> Karışım / Enjeksiyon </td><td> Bileşikler </td><td> Cilt 10x Karışımı (ul) almak eklendi </td><td> Cilt Analiz Ortamı (mi) </td><td> Çalışması sırasında enjekte edilen hacim (ul) </td><td> Deneyde nihai konsantrasyonu </td></tr><tr><td> A </td><td> 2.5 M (% 45) glukoz </td><td> 300 </td><td> 2.7 </td><td> 20 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> B </td><td> A oligomycin 5 mM (OM) </td><td> 9 </td><td> 3,0 </td><td> 22 </td><td> 1,5 uM </td></tr><tr><td> C </td><td> 5 mM FCCP </td><td> 9 </td><td> 2.7 </td><td> 25 </td><td> 1,5 uM </td></tr><tr><td></td><td> 100 mM Sodyum Privat çözeltisi </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> D </td><td> 5 mM antimycin A (AA) </td&gt; <td> 15 </td><td> 3,0 </td><td> 28 </td><td> 2,5 uM </td></tr><tr><td></td><td> 5 mM rotenone (Rot) </td><td> 7.5 </td><td></td><td></td><td> 1.25 uM </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Enjeksiyon karışımlarıdır. Bir Ekstrasellüler Flux Analyzer kullanarak Polarize M1 ve M2 BMDM 3. Bioenerjetik Karakterizasyonu <ol><li> 2 dakika MIX ve 3 dakika TEDBİR süreleri ve (en azından) 3 mix ve hız ölçümleri tahlil sihirbazı ile bir deney şablonu oluşturma 4 enjeksiyonları her birinden önce (Tablo 1) ve son enjeksiyondan sonra döngüler. Not: Bu konsantrasyonlar, kemik iliği türevli makrofajlar ve RAW264.7 makrofaj hücre çizgileri için geçerlidir, ancak her hücre tipi için optimize edilmelidir. FCCP karışımı içinde ekleme piruvat maksimum solunum yakıt için gereklidir. </li><li> Başlangıç ​​dibe iterek çalıştırmak başlatın ve aygıtın talimatları izleyin. Araç ilk yükhidrate problar ile tridge plaka aparatı ve bir sonraki yük hücresi levhası ile kalibrasyonu izin vermek. </li><li> Deneyinden sonra dikkatlice analiz ortamı atılır ve satıcı tarafından detaylı olarak tarif edildiği gibi, hücre çoğalması test kiti kullanılarak ileride hücre normalizasyonu için -20 ° C&#39;de analiz hücre kültürü mikroplak saklayın. <ol><li> Kısaca, damıtılmış su içinde B bileşeni 20 kat seyreltilmesi ile 1x hücre lisis tamponu hazırlamak ve bileşik 1x hücre lisis tamponu içinde bir 400-kat seyreltilir. , Oyuk başına 200 ul ekle oda sıcaklığında 5 dakika inkübe etmek ve ~ 180 nm eksitasyon ve 520 nm emisyon ~ maxima ile floresan ölçer. Not: yapışmayan hücreleri ile çalışırken veya kötü yapışma bir sorun, bu protokol, tüm deney ortamını atarak gerektirmediğinden doğrudan hücre çoğalma kiti alternatif olarak kullanılabilir ise. Ancak, bu doğrudan protokol bu laboratuarda kullanılan protokole göre biraz daha az duyarlıdır. </li></ol></li><li> Floresan ölçümünden sonra, normalleştirmekHer bir hücre sayısı ve tüm naif makrofaj kuyuların ortalama hücre sayısı 1 ile ayarlanmış olan bir oranı. (Örneğin, bir BCA deneyi kullanılarak) protein miktarının hücreleri sayısında normalize edilmesi için bir yol olarak kullanılabilir: edin. Bununla birlikte, elimizdeki bu deney hücre çoğalması test kiti ile karşılaştırıldığında daha az duyarlı idi. </li></ol>

<ol>
	<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41, 14-20 (2014).</li><li>Hoeksema, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN+gamma+Priming+of+Macrophages+Represses+a+Part+of+the+Inflammatory+Program+and+Attenuates+Neutrophil+Recruitment.">IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment.</a> J Immunol. , (2015).</li><li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+Advance+Arginase+1+independent+polyamine+production+stimulates+the+expression+of+IL+4+induced+alternatively+activated+macrophage+markers+while+inhibiting+LPS-induced+expression+of+inflammatory+genes.">Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes.</a> Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).</li><li>Pearce, E. L., Pearce, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathways+in+immune+cell+activation+and+quiescence.">Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence.</a> Immunity. 38, 633-643 (2013).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKM2+regulates+the+Warburg+effect+and+promotes+HMGB1+release+in+sepsis.">PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis.</a> Nature communications. 5, 4436 (2014).</li><li>Freemerman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+of+macrophages+glucose+transporter+1+(GLUT1)+mediated+glucose+metabolism+drives+a+proinflammatory+phenotype.">Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype.</a> The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).</li><li>Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioenergetic+profiles+diverge+during+macrophage+polarization+implications+for+the+interpretation+of+18F+FDG+PET+imaging+of+atherosclerosis.">Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis.</a> J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).</li><li>Vats, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+metabolism+and+PGC+1beta+attenuate+macrophage+mediated+inflammation.">Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation.</a> Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).</li><li>Huang, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+intrinsic+lysosomal+lipolysis+is+essential+for+alternative+activation+of+macrophages.">Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages.</a> Nature immunology. 15, 846-855 (2014).</li><li>Tannahill, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Succinate+is+an+inflammatory+signal+that+induces+IL+1beta+through+HIF+1alpha.">Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha.</a> Nature. 496, 238-242 (2013).</li><li>Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+macrophage+polarization+using+bone+marrow+derived+macrophages.">Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Hoeksema, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+macrophage+Histone+deacetylase+3+stabilizes+atherosclerotic+lesions.">Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions.</a> EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).</li><li>Vanden Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternatively+activated+macrophages+engage+in+homotypic+and+heterotypic+interactions+through+IL+4+and+polyamine+induced+E+cadherin+catenin+complexes.">Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes.</a> Blood. 114, 4664-4674 (2009).</li><li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+epigenetic+enzymes+to+improve+atherogenic+macrophage+functions.">Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions.</a> Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).</li><li>Galvan Pena, S., O Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprograming+in+macrophage+polarization.">Metabolic reprograming in macrophage polarization.</a> Frontiers in immunology. 5, 420 (2014).</li><li>Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+metabolism+and+macrophage+functional+polarization.">Cellular metabolism and macrophage functional polarization.</a> International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).</li></ol>

Bu maddeye ücretsiz erişim Seahorse Bioscience tarafından desteklenmektedir.

Laboratuvarımızda amacı makrofaj kutuplaşma ve fonksiyon ateroskleroz ve diğer inflamatuar koşulları 12 sonuçlarını iyileştirmek için nihai hedefi ile nasıl etkilenebileceği anlamaktır. Makrofaj polarizasyon değerlendirmek için, bir tipik haliyle, LPS (+ IFNy) bağlı ve M1 ve M2 marker genleri (qPCR) gen ekspresyonu, IL-4 ile uyarılan ölçen ELISA ile IL-6, IL-12, TNF ve NO salgılanmasını (belirler ve Griess tepkimesi) ve IL-4 ile uyarılan CD71, CD206, CD273 ve CD301 yüzey akış sitometrisi ile ifade () ve arginaz aktivitesi 3,13 inceler. Buna ek olarak, (DII oxLDL alımı, LipidTOX nötral lipid boyama ile) ve köpük hücre oluşumu deneylerinde (floresan lateks boncuk ve / veya pHrodo E.coli) ile fagositoz deneylerinde (Annexin-V / PI boyaması) apoptoz deneyleri için yapılabilir makrofaj işlevini 14 değerlendirir. Ayrıca, hücre dışı akı analizi Biyoenerji polarize mac profillerini ölçmek için yapılabiliryeni ve alternatif fonksiyonel okuma olarak rophages. Bu el yazması makrofaj kutuplaşma onların enerji kaynağı olarak artan glikoliz geçiş LPS makrofajlar ile metabolik yeniden programlama uyardığını göstermektedir. Bunun aksine, IL-4 ile uyarılan M2 makrofajlar ATP ana kaynak olarak mitokondriyal oksidatif fosforilasyon kullanın. Önemlisi, metabolik yeniden programlama sadece M1 ve M2 polarize makrofajlar özel gereksinimleri için gerekli enerjiyi sağlar. Nitekim, metabolik değişiklikler makrofaj fenotip 10,15,16 doğrudan düzenleyicileri metabolit konsantrasyonları etkiler. Ama aynı zamanda farklı makrofaj polarizasyon durumlarının bir sürücü (Şekil 2&#39;de burada görüldüğü gibi) ve bu yeni bilgi son birkaç yıldır sırasında immunometabolism araştırma alanının hızlı büyümesini destekledi Dolayısıyla, makrofaj metabolizma sadece bir özelliğidir. Ancak, makro metabolik profillerin sağlam ölçümlerifajları zor kaldı ve sınırlamaları vardı. Bu çalışmada, bir hücre dışı akı analizör sağlam gerçek zamanlı olarak glikoliz, glikolitik rezerv, maksimal glikolitik kapasite olmayan glikolitik asitlenme, bazal ve maksimal solunum, ATP üretimini, yedek solunum kapasitesi, proton sızıntısı ve non-mitokondrial solunum ölçmek için uygulanan makrofaj az bir miktarda uygulanır. Bu nedenle, değiştirilmiş ve aşağıda üreticinin protokolleri geliştirilmiştir. Standart Mito Stres Testi (# 103015-100) glukoz ve piruvat ve 3 enjeksiyonları (OM, FCCP, AA / Rot) ile bir protokol ile orta kullanarak önerir. Biz, glukoz / piruvat-içermeyen ortam ile tahlil başlangıç ​​(Glikoliz stres testi # 103.020-100 gibi) port A bir birinci enjeksiyon olarak glikoz ekleyin ve bu şekilde de bağlantı noktası C&#39;de FCCP uncoupler birlikte piruvat eklemek tercih tüm ilgili glikoliz parametreleri ECAR ölçümlerinin 1-9 ve mitochondri ilgili tüm bilgilere türetilmiştirOCR ölçümlerinden 4-15 den al fonksiyonu. O ayrılması tekniğine maksimal solunum yakıt FCCP birlikte piruvat enjekte kritik olduğunu unutmayın. Bu kombine protokolü kullanılarak önce, bir de 2-Deoksi-D-glikoz (2-DG) başlangıç ​​değerleri (1-3) için tahlil sonra ECAR seviyelerini düşürdüğünü doğrulamalıdır ve kayıtlı ECAR oranları 06/04 gerçekten de bağlı olduğu glikoliz. Buna ek olarak, bir bu metinde geçen bileşik konsantrasyonları ve hücre sayıları, kemik iliğinden türetilmiş makrofajlar ve RAW264.7 makrofaj hücre çizgileri için geçerlidir ve diğer hücre tipleri için optimize edilmesi gerektiğini anlamak gerekir. Ayrıca, bir kemik iliği türevi makrofajlar oluşturmak için kullanılan M-CSF, bir M2 gibi anti-inflamatuar fenotipi teşvik olduğuna dikkat edilmelidir. Kemik iliğinden türetilmiş makrofajlardan sunulan sonuçlar bu nedenle hücre culturi sırasında M-CSF gerektirmeyen primer doku yerleşik makrofaj veya makrofaj hücre çizgileri ile yapılan ölçümlerin bütünüyle karşılaştırılabilir olmayabilirng. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol, makrofajların az miktarda gerektirir ve hızlı bir şekilde, hemen hemen bütün temel metabolik hücre özelliklerini içerir. Bu, diğer immünolojik tayinler ve biyoenerji profil oluşturma için kullanılan da hücreler de tahlil sonra amaçlı diğer için kullanılabilir gerçekleştirmek için yeterli artı hücrelere yol açar. Ayrıca, özellikle de 96 kuyucuklu plak format, aynı zamanda, gerçek zamanlı olarak birden fazla koşulları değerlendirmek sağlar. Yine de, tek tek oyuklara arasındaki farklılıklar önemli ve dolayısıyla durum başına en az 4 kuyu kullanımı çoğu zaman arzu edilir olabilir. Dikkate alındığında bu sınırlama, tarif dışı akı analizi hala 10&#39;dan fazla deneysel koşullar çalıştırmanızı sağlar (n = 6), geleneksel tekniklerle çok daha fazla olduğu, bir kerede. Genel olarak, bu makalede ilgili tüm glikoliz ve mitokondriyal param ölçme izin veren kolay ve tekrarlanabilir fonksiyonel tahlil sağlarpolarize makrofaj alt gruplarında eters. Bu teknik makrofaj fonksiyonu değerlendirmek için ve makrofaj adlı (metabolik) fenotip üzerindeki farklı manipülasyonlar etkisini (örn gen yıkmak, yeni ilaçlar, vs.) değerlendirmek için bir gelecek uygulama olarak hizmet verebilir. Bu haliyle, hücre dışı akı veriler makrofaj aktivasyon durumu derinlemesine tanımlamasının yapılmasına diğer deneylerde ile bağlantılı olarak kullanılabilir.

Makrofajlar hemen hemen tüm hastalıklarda önemli bir rol oynarken, kendi fenotip düzenleyen moleküler mekanizmalar hala tam olarak sökülmüş değildir. Makrofajlar yüksek heterojenlik gösterir ve mikroçevresinin cevaben farklı fenotipleri 1 benimsemek. LPS (+ IFNy) klasik M1 veya M (LPS) makrofajlar iltihabı teşvik ve mikrobiyal tehdit 2 farklı türlerine karşı konakçıyı korumasına aktive araştırmaktı. Diğer M1 polarizasyon ortaya çıkarmak için uyaran olarak TNF ile tek başına ya da kombinasyon halinde IFNy kullanın. IL-4 ve / veya IL-13, alternatif makrofaj aktivasyonuna neden olur ve bu M2 veya M (IL-4) hücreleri güçlü bir bastırma ve 3 devam eden bağışıklık tepkilerinin kontrol cihazları bulunmaktadır. Polarize makrofajlar LPS ile aktive makrofajlar M1 gelişmiş glikoliz 4-6 metabolik anahtarı geçiren hücresel metabolizmanın farklı bir yönetmelik görüntüler. Bunun aksine, geliştirilmiş yağ asidi oksidasyon (FAO) ve mitokondriyal oxidative fosforilasyonu (OXPHOS), IL-4 ile uyarılan M2 makrofajlar 7-9&#39;da sürekli enerji sağlar. Böylece, değişmiş metabolizma bu doğru kutuplaşma ve inflamatuvar düzenlenmesi için bir ön koşul değil, sadece polarize makrofaj altkümelerini bir özelliği de olmasıdır. Önemlisi, glikoliz veya OXPHOS engellenmesi / FAO sırasıyla 8,10, M1 veya M2 aktivasyonunu bozduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, makrofajlarda belirlenmesi metabolik değişiklikler polarizasyon durumu ve inflamatuar potansiyelinin değerlendirilmesi için bir araç olarak uygulanabilir. Makrofaj metabolizmasını ölçen tutarlı bir tahlil bu nedenle ilaç, gen yıkmak olmadığını tahmin etmek için kullanılan olabilir veya diğer tedavi makrofaj kutuplaşma ve işlevini etkiler. Bu videoda, bir hücre dışı akı analizör naif, M1 ve M2 makrofajlar biyoenerjetik profillerini tanımlamak için kullanılır. Bu el yazması ölçümünü sağlayan bir optimize edilmiş protokol detaylarıtüm ilgili glikoliz parametreleri (glikoliz, maksimal glikolizis ve glikolitik rezerv) ve bir tek deneyde mitokondriyal fonksiyon özellikleri (toplam solunum, bazal mitokondriyal solunum, ATP üretimi, proton sızıntısı, maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesi). Bu deney düzeneği kullanarak, biyoenerjetik hücreleri (transgenik ifadesinin veya farmakolojik tedavi yıkmak gibi geni) kontrol ve &#39;değiştirilemez&#39; arasında mukayese edilebilir.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>23G and 25G needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#300800 and #300600</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringes</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>#307736</td>
			<td>To flushed bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>#639161</td>
			<td>To culture bone marrow cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#C7026</td>
			<td>For cell quantification at a later time point (works only for adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay kit&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>#35011</td>
			<td>For cell quantification immediately after assay (non-adherent cells)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XFe96 cell culture microplate</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#101085-004</td>
			<td>96 well plate in which cells are cultured and in which assay is done</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant mouse interleukin-4 (IL-4)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>#214-14-B</td>
			<td>Used to induced alternative macrophage activation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lipopolysaccharide (LPS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#L2637</td>
			<td>Pro-inflammatory stimulus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Sensor Cartridge&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102416-100</td>
			<td>Contains the probes for pH and O2 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse XF Calibrant&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#100840-000</td>
			<td>Needed to hydrate the probes overnight&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XF base medium&#160;</td>
			<td>Seahorse Bioscience</td>
			<td>#102353-100</td>
			<td>Buffer-free medium that allows efficient measurement of pH changes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#G8769</td>
			<td>Fuels glycolysis once added to the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligomycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#75351</td>
			<td>Inhibits mitochondrial ATP synthase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCCP( Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#C2920</td>
			<td>Uncouples mitochondrial respiration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mM Sodium Pyruvate solution</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>#BE13-115E</td>
			<td>Allows maximal mitochondrial respiration without the need for glycolysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674</td>
			<td>Inhibits complex III of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#BE13-115EA8674R8875</td>
			<td>Inhibits complex I of the mitochondria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casy Cell Counter</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>#05 651 697 001</td>
			<td>Instrument to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#14-0161</td>
			<td>Fc receptor block flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-F4/80-APC-eFluor780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#47-4801</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD11b-FITC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>#11-0112</td>
			<td>Antibody to stain macrophages</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic characterization of polarized m1 and m2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Hücre-dışı akı tahlili ve hücre ölçümü bittikten sonra, veri hücre sayımı için normalize edildi ve analiz edilebilir. Şekil 1A ve Şekil 1B &#39;de gösterildiği gibi, tipik olarak bu ECAR ve OCR araziler verecektir. Glikoz (A) &#39;lerin enjeksiyonundan sonra, ECAR artış glikoliz hızını temsil eder. Oligomycin (B) ile ATP sentaz inhibisyonu sonra ECAR ek artış glikolitik rezerv ve kapasite (Şekil 1A) hakkında bilgi sağlar. OCR değerlerini analiz ederken, enjeksiyon (B) oligomycin mitokondriyal ATP sentezi için kullanılan oksijen tüketiminin hesaplanmasını sağlar. FCCP (C) mitokondriyal solunum koparan ve ilgili OCR ölçümleri maksimal ve yedek solunum kapasitesi hakkında veri elde. Son olarak, rotenone enjeksiyonu (Rot) ve antimycin A (AA) mitokondriyal kompleks I engellemek ve III ve artık OCR olmayan mitokondriyal oksijen eksilerini temsilumption (Şekil 1B). <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53424/53424fig1.jpg" /> Şekil 1: XF Ekstrasellüler akı deneyinde elde edilen Metabolik parametreler. (A) hücresel glikoliz ardından parametreleri (mph / dk) ECAR değerlerinden hesaplanır: glikoliz, maksimum glikolitik kapasite ve glikolitik rezerv. Bazal solunum, ATP üretimi, proton sızıntısı, maksimum solunum ve yedek solunum kapasitesi: (pmol / dk) (B) OCR ölçümleri mitokondriyal fonksiyon sonraki temel parametrelerini hesaplamak için kullanılır. Gluc = glükoz; OM = oligomycin A; FCCP = karbonil siyanit 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon; AA = antimycin A; Rot = Rotenone <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayınız.</a> Çalıştırdıktan sonra, ECAR ve OCR ölçümleri 1 tilaşağıdaki gibi ECAR ölçümlerinden her bir kuyunun l 15 Excel&#39;e ihraç edilebilir ve aşağıdaki glikolitik parametreler hesaplanabilir: Sigara glikolitik asitlenme = ort. ECAR (1,2,3) Glikoliz = ort. ECAR (4,5,6) - ort. ECAR (1,2,3) Maksimum glikolitik kapasite = ort. ECAR (7,8,9) - ort. ECAR (1,2,3) Glikolitik rezerv avg =. ECAR (7,8,9) - ort. ECAR (4,5,6) OCR oranlarından sonraki metabolik özellikleri tespit edilebilir: Sigara mitokondriyal solunum = ort. OCR (13,14,15) Bazal solunum = ort. OCR (4,5,6) - ort. OCR (13,14,15) ATP üretimi = ort. OCR (4,5,6) - ort. OCR (7,8,9) Proton kaçak =ort. OCR (7,8,9) - ort. OCR (13,14,15) Maksimum solunum = ort. OCR (10,11,12) - ort. OCR (13,14,15) Yedek solunum kapasitesi (SRC) = ort. OCR (10,11,12) - ort. OCR (4,5,6) <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53424/53424fig2.jpg" /> Şekil 2:. Naif metabolik özellikleri (M0), LPS (M + -1) ve IL-4 (M2) polarize makrofajlar 8 ayrı kuyuların ortalama (SEM) her bir ölçüm, ortalama ve standart hata için sunulmuştur. (A) Hücre dışı asitlenme oranları (MPH / dak ECAR) ve (B) oksijen tüketimi oranları (OCR, pmol / dk) farklı şekilde polarize (M1 ve M2) ve naif makrofajlar (M0) için ölçülür. (CyQUANT ile ölçülen) ve saf makrofajlar ortalama hücre sayısı, 1. ayarlandı Tüm ölçümler hücre sayımı için normalize edildijection A = glükoz; B = oligomycin; C = FCCP; D antimycin A + rotenone =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53424/53424fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, LPS ile makrofaj aktivasyonu glikolitik metabolizma artışa yol açar. Şekil 2B&#39;de oksijen tüketimi oranlarına (OCR) bakarken, LPS ve IL-4 ile tedavi edilmiş makrofajlar arasındaki farklar çok daha belirgindir. Maksimal oksidatif metabolizması yüksek M (LPS) ile bastırılır olsa da, bu, IL-4 M2 makrofajlar, bazal ve özellikle de maksimum solunum indükler. Bir artmış glikolitik M (LPS) makrofajlar oldukça benzersiz ve M (IFNy) makrofajlar glikolizi geliştirmek göstermek yok çünkü ille M1 makrofajların karakteristik olmadığına dikkat edilmelidir. Genel olarak, bu, hücre dışı akı analizi tha göstermektedirLPS ile aktive makrofajlar görüntüleme glikolitik metabolizma geliştirilmiş herhangi bir fazlalık solunum kapasiteye sahip değildir, oysa t, M2 makrofajlar gelişmiş oksidatif metabolizması ile karakterize edilir ve özellikle de yüksek bir yedek solunum kapasiteli (SRC) IL-4 ile uyarılan.

Watch this Scientific Journal Video about Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis at JoVE.com

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

metabolic-characterization-polarized-m1-m2-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.0K Görüntüleme.  Academic Medical Center, Amsterdam. Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage’s metabolism and phenotype.

Video: Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Aktif Kemik İliği türetilen Makrofajlar ve Bradyzoite Koşullar Toxoplasma gondii Kist Duvar Oluşumu

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Kemik İliği Makrofaj üretim kaynaklı

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

İzolasyon ve Kemirgen Kemik İliği intravenöz enjeksiyon Türetilmiş Monositler

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

Monitoring Influenza Virus Survival Outside the Host Using Real-Time Cell Analysis

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are either time-consuming or unable to detect small variations. Presented here is a protocol for the precise quantification of viral titer by analyzing electrical impedance variations of infected cells in real-time. Cellular impedance is measured through gold microelectrode biosensors located under the cells in microplates, in which magnitude depends on the number of cells as well as their size and shape. This protocol allows real-time analysis of cell proliferation, viability, morphology and migration with enhanced sensitivity. Also provided is an example of a practical application by quantifying the decay of influenza A virus (IAV) submitted to various physicochemical parameters affecting viral infectivity over time (i.e., temperature, salinity, and pH). For such applications, the protocol reduces the workload needed while also generating precise quantification data of infectious virus particles. It allows the comparison of inactivation slopes among different IAV, which reflects their capacity to persist in given environment. This protocol is easy to perform, is highly reproducible, and can be applied to any virus producing cytopathic effects in cell culture.

Reported here is a protocol for the quantification of infectious viral particles using real-time monitoring of electrical impedance of infected cells. A practical application of this method is presented by quantifying influenza A virus decay under different physicochemical parameters mimicking environmental conditions.

Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanarak Konak Dışında Influenza Virüsünün Hayatta Kalmasını İzleme

Methods for virus particle quantification represent a critical aspect of many virology studies. Although several reliable techniques exist, they are ...

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of tuberculosis (TB). We have established an experimental protocol to follow immune polarization of myeloid-derived cells into M1 (classically activated) or M2 (alternatively activated) macrophage-like cells through assessment with a 10-color flow cytometry panel that allows visualization and deep-characterization of green-fluorescent-protein (GFP)-labeled Mtb in diverse macrophages subsets. Monocytes obtained from healthy blood donors were polarized into M1 or M2 cells using differentiation with granulocyte macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) or macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) followed by polarization with IFN-&#947; and lipopolysaccharide (LPS) or IL-4, respectively. Fully polarized M1 and M2 cells were infected with Mtb-GFP for 4 hours before detached Mtb-infected macrophages were stained with flow cytometry at 4- or 24-hours post-infection. Sample acquisition was performed with flow cytometry and the data was analyzed using a flow cytometry analysis software. Manual gating as well as dimensionality reduction with Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) and phenograph analysis was performed. This protocol resulted in effective M1/M2 polarization characterized by elevated levels of CD64, CD86, TLR2, HLA-DR and CCR7 on uninfected M1 cells, while uninfected M2 cells exhibited a strong up-regulation of the M2 phenotype markers CD163, CD200R, CD206 and CD80. M1-polarized cells typically contained fewer bacteria compared to M2-polarized cells. Several M1/M2 markers were downregulated after Mtb infection, which suggests that Mtb can modulate macrophage polarization. In addition, 24 different cell clusters of different sizes were found to be uniquely distributed among the M1 and M2 uninfected and Mtb-infected cells at 24-hours post-infection. This M1/M2 flow cytometry protocol could be used as a backbone in Mtb-macrophage research and be adopted for special needs in different areas of research.

Polarization of M1 and M2 Human Monocyte-Derived Cells and Analysis with Flow Cytometry upon Mycobacterium tuberculosis Infection

This protocol provides a method to study Mycobacterium tuberculosis infection in human M1- or M2-polarized macrophages based on differentiation of peripheral-blood-monocytes to macrophage-like cells that are infected with the GFP-labeled virulent strain H37Rv, and analyzed with flow cytometry using a 10-color panel including expression of selected M1/M2 markers.

M1 ve M2 İnsan Monosit Türevi Hücrelerin Polarizasyonu ve Mikobakteri Tüberküloz Enfeksiyonu Üzerine Akış Sitometrisi ile Analiz

Human macrophages are primary host cells of intracellular Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infection and thus have a central role in immune control of ...

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and adaptive immune responses. In vitro study of macrophages can be undertaken by ex vivo culture from the peritoneum or through differentiation of myeloid bone marrow progenitor cells to form bone marrow-derived macrophages (BMDMs). A common approach to macrophage differentiation from precursors involves the use of conditioned media from L929 cells (LCM). This media is easy to self-produce but suffers from batch variability, and its constituents are undefined. Similarly, Foetal Bovine Serum (FBS) is used to support growth but contains a vast mixture of undefined molecules that may vary between batches. These methods are not adequate for the study of nitric oxide biology and redox mechanisms as they both contain substantial amounts of small molecules that either interfere with redox mechanisms or supplement levels of cofactors, such as tetrahydrobiopterin (BH4), required for the production of NO from inducible nitric oxide synthase (iNOS). In this report, we present an optimized protocol allowing for control of the NO-redox environment by reducing the levels of exogenous biopterin while maintaining conditions suitable for cell growth and differentiation. Tight control of culture media composition helps ensure experimental reproducibility and facilitates accurate interpretation of results. In this protocol, BMDMs were obtained from a GTP cyclohydrolase (GCH)- deficient mouse model. Culture of BMDMs was performed with media containing either (i) conditioned LCM, or (ii) recombinant M-CSF and GM-CSF to produce minimal artifacts while obtaining BH4 and NO-deficient culture conditions - thus allowing for the reproducible study of NO-redox biology and immunometabolism in vitro.

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

This protocol has been established to culture tetrahydrobiopterin (BH4)- and inducible nitric oxide synthase (iNOS)-deficient primary murine macrophages to study NO-redox biology. The study focuses on reducing potential contamination of BH4 and other artifacts found in traditional isolation and culture methods which may confound experimental outcomes and interpretation of results.

NO-Redoks Biyolojisi Çalışması için Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve In vitro Kültürü

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Isolation and Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages from Mice

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ability to change their profile according to the stimuli present in the microenvironment. Cytokines can profoundly affect macrophage physiology, especially IFN-&#947; and interleukin 4, generating M1 and M2 types respectively. Because of the versatility of these cells, the production of a population of bone marrow-derived macrophages can be a basic step in many experimental models of cell biology. The aim of this protocol is to help researchers in the isolation and culture of macrophages derived from bone marrow progenitors. Bone marrow progenitors from pathogen-free C57BL/6 mice are transformed into macrophages upon exposure to macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) that, in this protocol, is obtained from the supernatant of the murine fibroblast lineage L-929. After incubation, mature macrophages are available for use from the 7th to the 10th day. A single animal can be the source of approximately 2 x 107 macrophages. Therefore, it is an ideal protocol for obtaining large amounts of primary macrophages using basic methods of cell culture.

The present protocol describes the isolation and culture of bone marrow-derived macrophages from mice.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Macrophages have important effector functions in homeostasis and inflammation. These cells are present in every tissue in the body and have the important ...