Bu protokol, klinik öncesi immüno-onkoloji çalışmaları için İnsan Bağışıklık Sistemi veya HIS farelerinin oluşumunu özetlemektedir. Fare kanseri modelleri çeşitliliklerinde sınırlıdır ve kliniğe kötü bir şekilde tercüme edilir. Bu teknik, insan bağışıklık sistemine sahip bir farede insan tümörlerinin tedavisini değerlendirerek immünoterapi çalışmaları için klinik öncesi bir model olarak hizmet eder.
İnsanlaştırılmış fare modeli, birçok enfeksiyona verilen tepkiler veya insan bağışıklık sisteminin kanserleri de dahil olmak üzere insan immünolojisinin birçok yönünü incelemek için kullanılabilir. Güvenilir ve sağlam bir kordon kanı kaynağı edinmek ve immün yetmezlikli fare kolonisinin sağlığını korumak zor olabilir. Akım sitometrisi ve immünolojik analizde uzmanlık esastır.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir araştırma hizmetleri uzmanı olan Kristina Larsen olacak. Başlamak için, kordon kanından izole edilen CD34-pozitif hücre peletini, sekizinci hücrelere bir kez 10 kez 300 mikrolitre manyetik hücre ayırıcı tamponunda yeniden askıya alın. Sekizinci hücrelere bir kez 10 kez 10 başına 100 mikrolitre FCR bloke edici reaktif, ardından sekizinci hücrelere bir kez 10 kez 10 mikrolitre CD34-pozitif manyetik boncuk ekleyin ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Daha sonra, sekizinci hücrelere bir kez 10 kez beş mililitre manyetik hücre ayırıcı tampon ekleyin ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 360 g'da döndürün. Yıkama adımını tekrarlayın ve peleti, fraksiyone edilmemiş etiketli 15 mililitrelik bir konik tüpte 100 milyon manyetik hücre ayırıcı tampon hücresi başına 500 mikrolitrede yeniden askıya alın. İki adet daha 15 mililitrelik tüpü etiketleyin CD34-negatif ve CD34-pozitif Üç tüpü bir soğutma rafına yerleştirin.
Bir biyogüvenlik kabinindeki otomatik manyetik hücre ayırıcı üzerindeki iki sütunlu pozitif seçim programını kullanarak hücreleri ayırın. Daha sonra, CD34 pozitif insan kök hücrelerini genişletmek ve dondurmak için, makalede açıklandığı gibi kordon kanı veya CB ortamı hazırlayın ve 0.22 mikronluk bir filtreden geçirin. CD34-pozitif hücreleri mililitre CB ortamı başına 100.000'de yeniden askıya alın ve 37 santigrat derecede inkübe edin.
Üçüncü günde, şişeye sitokinler olmadan eşit miktarda CB ortamı ekleyin. Beşinci günde, genişletilmiş CD34-pozitif hücreleri toplayın. Hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyin ve 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın.
Şişenin tabanını örtmek için yeterli CB ortamı ekleyin. Bir hücre kazıyıcı kullanarak, şişenin tüm tabanını kazıyın. Tüm medyayı aynı 50 mililitrelik tüpte toplayın ve santrifüj.
Hücreleri iki mililitre CB ortamında yeniden askıya alın ve santrifüj. Ortamı pelet haline getirin ve peleti dondurucu bir ortamda yeniden askıya alın. Daha sonra, yavru ışınlamasından üç saat sonra CD34 pozitif hücre hazırlığına başlayın.
50 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre CB ortamını ısıtın. Her dört ila altı yavrunun enjekte etmesi için bir şişe in vitro genişletilmiş ve dondurulmuş CD34-pozitif hücre alın. Sadece az miktarda buz görünene kadar 50 ila 55 santigrat derecede hızla çözün ve hücreleri ısıtılmış CB ortamına ekleyin.
Her bir şişeyi durulamak için bir mililitre ortam kullanın ve hücreleri dört santigrat derecede 12 dakika boyunca 360 g'da döndürün. Ortamı dikkatlice aspire edin. Peletleri iki mililitre CB ortamında tekrar askıya alın ve hücreleri sayın.
Yine, hücreleri santrifüj edin, ortamı aspire edin ve peleti n başına 100 mikrolitre steril PBS artı enjekte edilecek bir yavru içinde yeniden askıya alın, bu da fare başına 250.000 ila 450.000 CD34 pozitif hücre ile sonuçlanır. Fare kanından PBMC izolasyonu için, kan heparinini yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve arayüzü rahatsız etmemeye dikkat ederek mililitre yoğunluk gradyanı başına 500 mikrolitre 1.077 gramın üzerine yavaşça yerleştirin. Tüpü 1.220 g'da oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ara vermeden santrifüjleyin.
200 mikrolitrelik bir pipetle kabarık kaplamadan mümkün olduğunca çok hücre çıkarın ve 750 mikrolitre hasat ortamı içeren yeni 1,5 mililitrelik tüpe ekleyin. 11 dakika boyunca 360 g'da santrifüj. Ortamı 50 mikrolitreye aspire edin ve peleti 750 mikrolitre hasat ortamında yeniden askıya alın.
Bir akış sitometresindeki her numunenin 100 mikrolitresi için veri elde edin. Ardından fcs dosyasını akış verileri düzenleme yazılımına aktarın ve FSC-A ve SSC-A grafiğine çokgen kapısı uygulayın. Eksenleri FSC-H'ye karşı FSC-A olarak değiştirin ve çizgiden çıkıntı yapan çiftleri hariç tutarak hücreleri doğrusal diyagonal olarak açın.
Bu hücreleri seçin ve eksenleri mCD45'e karşı hCD45 olarak değiştirin. hCD45 pozitif popülasyona bir çokgen kapısı uygulayın ve insan adını uygulayın. mCD45 pozitif popülasyona bir çokgen kapısı uygulayın ve fare adını uygulayın.
İnsan ve fare popülasyonları için bir sayım istatistiği oluşturun. Ardından, insan popülasyonunu seçin ve eksenleri CD3'e karşı CD19 olarak değiştirin. CD19 pozitif hücrelere çokgen kapısı uygulayın ve bunları B hücreleri olarak adlandırın.
CD3 pozitif popülasyona bir çokgen kapısı uygulayın ve bunu T-hücreleri olarak adlandırın. Ardından, çift negatif popülasyona bir çokgen kapısı uygulayın ve TB olmayan olarak adlandırın. T hücresi popülasyonunu seçin ve eksenleri CD3 yerine CD4 olarak değiştirin.
CD4 pozitif popülasyona bir çokgen kapısı uygulayın ve CD4 pozitif olarak adlandırın. CD4 negatif popülasyona bir çokgen kapısı uygulayın ve CD8 olarak adlandırın. TB olmayan popülasyonu seçin ve eksenleri miyeloidlere karşı CD56 olarak değiştirin.
Toplam CD56 pozitif popülasyona bir çokgen kapısı uygulayın ve NK hücreleri olarak adlandırın. Daha sonra CD56-negatif ve miyeloid-pozitif popülasyona bir çokgen kapısı uygulayın ve bunu miyeloid olarak adlandırın. Tüm popülasyonların yüzde ve sayım istatistikleri için bir tablo oluşturun ve bunu bir elektronik tabloya aktarın.
Belirtilen formülü kullanarak yüzde hCD45 kimerizmini hesaplayın. Farede tümör hücrelerini büyüttükten ve ilaç tedavilerini uyguladıktan sonra, dokuları toplayın. Fareyi yerinde tutmak için pimleri olan bir köpük diseksiyon tahtasına yerleştirin ve kollar ve bacaklar 45 derecede uzatı.
Gövdenin ortasından pelvisin yakınından başlayıp çeneye kadar uzanan bir kesi yapın. Cildi kenara doğru çekin ve pimlerle yerinde tutun. Lenf nodlarını aksiller, servikal, mezentrik, inguinal ve hiatal sırayla ince forseps kullanarak çıkarın.
Lenf düğümlerini buzlu cam slaydın bir tarafına sekiz mililitre hasat ortamında bir Petri kabına yerleştirin. Slaytları buzlu kenarları içe doğru olacak şekilde dik açılarda tutarak, hücresel içerikler serbest bırakılana kadar dokuları hafifçe bastırın. Maksimum hücre sayısını serbest bırakmak için slaytı birbirinden ayırarak ve birlikte çekerek birkaç kez durulayın.
Hücreleri beş inçlik bir cam pipetle toplayın ve dokuz inçlik pamukla takılı bir pipetten etiketli 15 mililitrelik bir konik tüpe filtreleyin. Daha sonra, tümörü forseps ile tutarak tümörü açık kanattan çıkarın ve diseksiyon makası ile tümör kenarlarında yavaşça sniping yapın. Tümörü tartın ve RNA ve immünohistokimya işleme için tümörün 1 / 4'ünü çıkarın.
Tümörün kalan 3 / 4'ünü altı santimetrelik bir kaba yerleştirin ve bir neşter bıçağı kullanarak bir milimetre parçaya bölün. Tümör parçalarını bir ayrışma tüpüne aktarın. Daha sonra kabı eksik TIL ortamıyla durulayın ve tüpe ekleyin.
Kollajenaz preparatı ekleyin ve 30 dakika ila bir saat boyunca 37 santigrat derecede mekanik ayrışma kullanarak dokuyu ayırın. Süspansiyonu 100 mikronluk bir filtrenin üzerinden 50 mililitrelik bir konik tüpe geçirin ve filtreyi 10 mililitre TIL komple ortam ile durulayın. Peleti DNaz ile yeterli hasat ortamında santrifüj edin ve yeniden askıya alın, böylece hücre süspansiyonu bir P1000 pipet ucundan kolayca geçebilir ve aşağı akış analizi için hacmi kaydedebilir.
PDX CRC 307P'de, kombinasyon tedavisi, zaman içindeki tümör büyüme hacimleri, tümör ağırlıkları ve spesifik büyüme hızı ile belirlendiği gibi, tümörün büyümesini yavaşlattı. Farklı bir fare kohortunda test edilen PDX CRC 307M, HIS BRGS farelerinde aynı kombinasyon tedavisinden daha az etkilenmiştir. Tümör implantasyonundan önce kandaki genel insan hCD45-pozitif ve insan T-hücresi hCD3-pozitif kimerizmine dayanarak, her iki parametre de periferik bağışıklık sisteminde ve TIL'de tedavi edilen CRC 307P taşıyan farelerle kombinasyon halinde artmıştır, ancak CRC 307M modelinde artmamıştır.
İnsan T hücrelerinin araştırılması, CRC 307P tümörlerinde daha fazla aktive olmuş T hücresi ortaya çıkardı, ancak kombinasyonla tedavi edilen farelerden gelen lenf ortaya çıkmadı. Ayrıca, kombinasyon tedavisi gören CRC 307P tümörlerinde daha fazla efektör bellek CD8-pozitif T-hücresi ve daha az TIM-3-pozitif T-hücresi vardı. Buna karşılık, bu fark CRC 307M modelinde belirtilmedi.
Ayrıca, kombinasyonla tedavi edilen fareler arasında sitotoksik T hücresi popülasyonlarının frekanslarında herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir, ancak tedavi edilmeyenlerde daha yüksek sitotoksik T hücreleri gözlenmiştir. Kombinasyon tedavisi, CRC 307P lenf organlarında veya tümörlerde Treg'lerin frekanslarını etkilemedi, ancak CRC 307M verileri Treg'lerin azalması eğilimini gösterdi. Tümör hücrelerinde immün ile ilgili değişiklikler akım sitometrisi kullanılarak yükseltildi.
MHC sınıf I ve sınıf II'nin ekspresyonunun, kombinasyonla tedavi edilen HIS BRGS farelerinden eksize edilen CRC 307P tümör hücrelerinde arttığı gözlendi. CRC 307M modelinde, aynı ilaç tedavisi tümör hücrelerinde HLA sınıf II ekspresyonunu indüklemiştir. Benzer şekilde, kombinasyon tedavisi, EpCAM-pozitif CRC 307P tümör hücrelerinde PD-L1 ekspresyonunun artmasına neden oldu.
Son olarak, immün yanıtların tümör büyümesi ile korelasyonları araştırıldı. Artmış CD4-pozitif T hücreleri, daha küçük tümör büyümesi ile anlamlı bir korelasyon gösterdi ve daha spesifik olarak, tedavi edilen HIS farelerinin kombinasyonundaki HLA-DR-pozitif aktive edilmiş T hücreleri. CD34 pozitif hücreleri izole ederken steril teknik, fareler son derece immün yetmezliklidir.
Ortaya çıkan kimerizm, kordon kanı bağışçıları içinde ve arasında değişkendir ve T hücreleri en büyük varyasyona sahiptir. Sınırsız immünoterapi kombinasyonlarının yanı sıra mekanik ve ilaç dozlama kinetik çalışmaları, örneğin rollerini doğrulamak için CD8 T hücrelerinin silinmesi yapılabilir. Önemli olarak, ilaca bağlı toksisiteler de incelenebilir.
İnsan immünoterapilerini kliniğe çevrilmek üzere test etmek için daha alakalı ve erişilebilir bir klinik öncesi model sağladı. Şu anda bu verilere dayanarak birkaç klinik çalışma devam etmektedir.
