We thank the Western University of Health Sciences for the Intramural Grant.

Aşağıda açıklanan protokol rehberlik ve Batı Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayı altında yürütülür. Bütün deneyler ilgili tüm kurallar, yönetmelik ve düzenleyici kurumlar ile uyumlu yapılmaktadır. 1. Hücre Kültürü <ol><li> Komple ortam hazırlanması <ol><li> Sınıf biyolojik güvenlik kabini kullanılarak aseptik olarak RPMI medyum 500 ml&#39;lik bir şişeye fetal sığır serumu (FBS) ve penisilin streptomisin (P / S) eklenerek tam bir ortam hazırlar. dönen hafifçe karıştırın. Her bir ek nihai konsantrasyonu% 10 FBS ve% 1 P / S (hac / hac). Örneğin, 56 ml FBS ve 6 ml P / S ile medya 500 ml tamamlar. </li><li> 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde tam orta yerleştirin. </li></ol></li><li> Çözülme ve yayılan Hücreler <ol><li> sıvı azot PANC-1 GFP hücreleri alın. 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde yavaşça sallanarak şişe çözülme. Not:(- 3 dakika, yaklaşık 2) Çözülme hızlı olmalıdır. </li><li> Etiket, T-75 şişeler, (a) hücre hattı adı, (B) geçiş sayısı, (c) güncel, ve (d) Araştırmacının baş ile birlikte kullanılmak üzere. </li><li> Bir Biyogüvenlik kabini için% 70 etanol ve transfer flakon ile flakon silin. </li><li> Hücreler yaymak 15 ml konik tüp tam orta 9.0 ml ekleyin. 1.0 ml pipet kullanarak dikkatli bir şekilde hücre süspansiyonu transferi ve tam ortam 9 ml asın. </li><li> Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 125 x g&#39;de santrifüjleyin. Bir biyogüvenlik kabini konik flakon transfer ve pelet bozmadan süpernatant aspire. </li><li> hafifçe yukarı ve aşağı süspansiyon pipetleme taze tamamlanmış besiyeri 10 ml pelet askıya. </li><li> Bir hemasitometre ile hücre sayımı 2.1 x 10 6 hücre / şişe yoğunluğunda, T-75 şişelerinde bunları plaka. 37 ° C&#39;de bir inkübatör içine yerleştirilir ve% 5 CO2. </li><li> gözle ve mikroskopla günlük hücreleri izleyin. grip iseyenileme gerekli id, aseptik şişesi tam büyüme ortamı aspire ve atın. Taze tam orta eşit miktarda ekleyin. </li></ol></li><li> Hücreler yayılan <ol><li> Aseptik olarak şişesi bulunan ortamı çıkarın. hücreleri durulayın ve atmak için Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) içinde 5 ml. </li><li> % 0.25 tripsin 3 ml ekleyerek şişeden hücreler ayırın. 5 ila 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de tripsin ve% 5 CO2 ihtiva eden bir şişeye inkübe edin. </li><li> mikroskobu (10X büyütme) altında hücreleri gözlemleyin ve yuvarlak ve yerinden sağlamak. </li><li> tam orta eşit hacimde ekleyerek tripsin nötralize ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme öbekler kırmak. </li><li> Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 1.2.7 belirtilen hücre yoğunluğunda yeni şişelere uygun hücre süspansiyonu hacmi aktarmak; son hacim şişesi başına 10 ml olacak şekilde yeterli taze medya ekleyin. </li></ol></li><li> hücre SuspensEnjeksiyon için iyon Hazırlık Not: bazal membran matrisi yüksek konsantrasyonu, oda sıcaklığında katılaşan için, buz üzerinde tüm malzemeleri tutmak. gece boyunca dondurucuya tüm steril pipet uçları ve şişeleri yerleştirin ve süspansiyon üzerinde çalışırken buz üzerinde tutmak. <ol><li> buz üzerinde hiçbir katkı maddesi olmadan RPMI medya bir şişe tutun. Üreticinin talimatlarını takip ederek bazal membran matrisi, yüksek konsantrasyon, çözülme. Tercihen, küçük şişeleri içine kısım birden donma-çözülme döngüleri 10 önlemek için. </li><li> Aspire Bütün şişeler ortam ve DPBS 5 ml ile yıkayın. 1.3.4 adıma bir önceki bölümünde tüm adımları tekrarlayın. </li><li> Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 125 x g&#39;de 15 ml konik bir tüp ve santrifüj aktarın. Biyogüvenlik kabini konik flakon transfer ve DPBS 10 ml kullanılarak pelet yeniden askıya. </li><li> Yavaşça pelet kırmaya yukarı ve aşağı süspansiyonu pipetle. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> s belirtilen daha santrifüj1.4.3 TEP. Süpernatant aspire ve hücrelerin sayısına bağlı olarak, 50 ul bir hacmi içine 3 x 10 6 hücre elde etmek için uygun bir seyreltici ekleyin. 1 (h / h) oranında bir seyreltici 1 serum barındırmayan ortam ve yüksek konsantrasyonu temel matris dokunun bir karışımı olacaktır. </li><li> nazikçe süspansiyon vorteks ve her zaman buz üzerinde tutmak. Süspansiyon enjeksiyon için hazırdır. </li></ol></li><li> cerrahi İmplantasyon Not: Tüm cerrahi malzemeler ve aletler steril olduğundan emin olun. Her zaman aseptik teknikler uygulayın. <ol><li> Masanın üzerinde bir ısıtma yastığı yerleştirin ve steril bir örtü ile kaplayın. Anestezi Makinenizi kurup tüm malzemeleri kol ulaşılabilecek olmasını sağlamak. </li><li> Anestezi maskesi içine hayvanın burun yerleştirin ve oksijen 1 L / dk ve% 2.5 izofluran anestezi kurmak. </li><li> Yavaşça iyot ile hayvanın kanadını fırçalayın ve% 70 etanol ile durulayın. üç kez tekrarlayın. </li><li> onaylamakHayvan tamamen arka pençe kısma anestezi uygulandı. cevap görülmektedir eğer hayvan cerrahisi için tam anestezi ve hazırdır. Ancak, hayvan kaçınmaları halinde, buharlaştırıcı yeterli anestezi olmadığından emin ve hayvana anestezi altında tamamen gitmek için daha fazla zaman tanıyın. </li><li> Yükü yaklaşık 18 G iğne ile bir 1.0 ml TB enjektöre hücre süspansiyonu 200 ul (daha önce soğutulmuş). 27 G iğne ile iğne değiştirin ve Kullanıma hazır olana kadar buz dönün. </li><li> Dalağın genel alan (karnın sol üst kadran) bulun ve kullanan forseps o bölgenin üstünde cilt çimdik. cerrahi makas, yaklaşık 1.0 cm&#39;lik bir kesi yapmak kullanarak bir cep oluşturmak için. Benzer şekilde, dalak üzerine düz kas tutam ve periton boşluğu erişmek için kesilmiştir. </li><li> Yavaşça dalağın kaudal ucunu yakala ve vücudun dışına doğru çekin. Pankreas dalak eklenecektir. ıslak st kullanarak pankreas yaymakerile Q-tip pankreas kuyruk bulun ve. </li><li> pankreas kuyruğunda içine 50 ul enjeksiyon sunun, 10 saniye boyunca içeride iğne bırakın ve yavaş yavaş pankreas dışına iğne döndürün. Başarılı bir implantasyon herhangi bir sızıntı olmadan yüzeysel balonu gibi görünecek. </li><li> periton boşluğuna pankreas ve dalak geri dönün. İlk kas içine ve daha sonra ayrı ayrı cilt içine alın. insizyon kapatmak için 6-0 sütür veya zımba kullanın. Yönetici ketoprofen deri altından (SC) (5 mg / kg) 24 saat boyunca, bir hayvanda ağrı önlemek için. (- 0.1 mg / kg 0.05) 36 saatlik bir süre boyunca her 12 saat Seçenek olarak ise, buprenorfin sc verilmesi. </li><li> anestezi hayvan kurtarmak ve kendi kafesine geri. Ayrıca ağrı için monitör. cerrahi - Hayvanlar (Rüçhan hatta önce) sırasında ağrı kesici sağlanmalıdır. Ek ağrı kesici de öngördüğü şekilde IACCUC-protokole göre veya ağrı hayvanlara sağlanmalıdırveteriner veya designee otlatırken. </li></ol></li><li> İn vivo Not: Görüntü yakalama bir karanlık oda ve GFP görüntüleme için uygun filtreler ile donatılmış bir ticari bir görüntüleme sistemi kullanılarak yapıldı. (: -;: 513-557 nm emisyon 495 nm 455 uyarma) görüntü elde etme, bir CCD kamera ve değiştirilebilir uyarma / emisyon lensten oluşan bir optik sistem kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Parlak alan görüntüleri her zaman noktası için 1 x 1 binning bir filtre olmadan ele geçirildi. GFP Uyarma Xenon bantlı ışık kaynağı kullanılmıştır. Hayvanlar görüntüleme sisteminin karanlık odacıktan entegre bir gaz anestezi manifolduna anestezi makinesi bağlayarak görüntüleme işlemi boyunca anestezi altında muhafaza edilmiştir. <ol><li> 1.5.2 tarif edilen hayvan anestezisi. Bir anestezi maskesi görüntüleme sırasında anestezi altında hayvan tutmak için ticari görüntüleme sisteminin karanlık odanın iç olduğunusüreç. </li><li> Doğru uyarma ve emisyon filtreleri ayarlayın. </li><li> sadece beyaz ışık kullanarak bir başlangıç ​​görüntü alarak başlayın. görüntüleme oturum boyunca hayvanın aynı pozisyonda tutmak ve ikinci bir görüntü almak için GFP filtreler geçin. </li><li> En iyi sonuçları her iki görüntüleri üst üste. Floresan alan ve yoğunluğu görüntüyü analiz. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Smyth, E., Cunningham, D., Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Harrison's Principles of Internal Medicine. , (2015).</li><li>Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+borderline+resectable+pancreatic+cancer.">Management of borderline resectable pancreatic cancer.</a> World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).</li><li>De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+pancreatic+cancer.">Diagnosis and management of pancreatic cancer.</a> Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).</li><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7, 645-658 (2007).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+orthotopic+xenografts:+better+mimic+of+metastasis+than+subcutaneous+xenografts.">Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts.</a> Nat Rev Cancer. 15, 451-452 (2015).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+uses+of+fluorescent+proteins+to+visualize+cancer+in+vivo.">The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo.</a> Nat Rev Cancer. 5, 796-806 (2005).</li><li>Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+orthotopic+pancreatic+cancer+mouse+model:+cells+suspended+and+injected+in+Matrigel.">Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: cells suspended and injected in Matrigel.</a> World J Gastroenterol. 20, 9476-9485 (2014).</li><li>Arranz, A., Ripoll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+optical+imaging+for+pharmacological+studies.">Advances in optical imaging for pharmacological studies.</a> Front Pharmacol. 6, 189 (2015).</li><li>Metildi, C. A., Kaushal, S., Hoffman, R. M., Bouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+serial+selection+of+human+pancreatic+cancer+cells+in+orthotopic+mouse+models+produces+high+metastatic+variants+irrespective+of+Kras+status.">In vivo serial selection of human pancreatic cancer cells in orthotopic mouse models produces high metastatic variants irrespective of Kras status.</a> J Surg Res. 184, 290-298 (2013).</li><li>Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).</li><li>Katz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+efficacy+of+adjuvant+cytosine-analogue+CS-682+in+a+fluorescent+orthotopic+model+of+human+pancreatic+cancer.">Survival efficacy of adjuvant cytosine-analogue CS-682 in a fluorescent orthotopic model of human pancreatic cancer.</a> Cancer Res. 64, 1828-1833 (2004).</li><li>Bouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+imaging+of+primary+tumor+growth+and+multiple+metastatic+events+in+a+pancreatic+cancer+orthotopic+model.">Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model.</a> Cancer Res. 62, 1534-1540 (2002).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Böylece in vivo floresan görüntüleme (Şekil 1) bütün vücudu kullanılarak tümör büyümesinin non-invaziv izleme sağlayan GFP ifade pankreas kanseri ortotopik fare modeli açıklanmaktadır. Bu teknik, gerçek zamanlı olarak tümör gelişimini izlemek için bize izin verir (Şekil 3); araştırmacıların pankreas kanserine karşı yeni ajanların etkinlikleri incelemek için önemli bir araç olabilir. Bu modelin bir diğer önemli yönü, GFP flöresanmm...

Pankreas kanseri, diğer kanserler göre artan sıklıkta tanı ve ABD&#39;de kansere bağlı ölümlerin 4. önde gelen nedenidir edilir. Tanı zaman, hastaların% 90 üzerinde beş yıl 1,2 içinde ölmektedir. Şu anda, cerrahi tümör çıkarılması pankreas kanseri için tek çare olduğunu, ancak hastaların% 20 den az, çünkü hastalığın ileri bir aşamada olduğunu ve 3,4 metastas yapmış tanı anında başta ameliyat için uygundur. spesifik semptomların olmaması pankreas kanseri sessiz hastalık yapar; bazı belirtilerin karın ağrısı, sırt ağrısı, iştahsızlık, sarılık ve bulantı kaybı arasında; hangi kolayca ortak sindirim hastalıkları 4 olarak yorumlanabilir. Bu nedenle, pankreas kanseri tanı ve tedavisinde yardımcı olmak için yeni farmakolojik araçlar geliştirmek önemlidir. hayvan modellerin kullanımı Pankreas biyolojisinin anlaşılmasında bize izin veriratic kanseri ve insanlara bu bilgiyi uygulayarak içine bir bakış açısı sağlar. Tümörler köken 5 organ büyümesi nedeniyle pankreas kanseri ksenograft ortotopik modelleri, gerçekçi. Hücre çizgileri veya tümör fragmanları deri altından implante heterotopik modelleri, aksine, ortotopik modelleme çevresi 6 tümörün mikro ve taklit tümör hücrelerinin etkileşimini dinlenme sağlar. Burada açıklanan ksenograft modeli, genetik olarak, yeşil floresan proteini (GFP) ifade etmek üzere geliştirilen insan pankreas kanseri hücre çizgisi Panc-1 GFP ile ilgili tümörleri gelmektedir. GFP algılama non-invazif görüntüleme ve tümör büyümesi ve metastaz 7 izlenmesi için olanak sağlar. Tümör gelişimi kendiliğinden hızla oluşur ve yakın insan pankreas kanser hastalarında 8 birincil tümörlerin benzemektedir. Ortotopik model ise, terapötik maddeler karşılık olarak ilaç etkinliğinin daha doğru bir tahmintümör mikro taklit. Yukarıda sözü edildiği gibi, bu hayvan modeli gerçek zamanlı olarak, tümör büyümesi ve metastazın flüoresan tespit edilmesine olanak sağlar. Floresan algılama lüminesans kıyasla daha doğrudan / canlı görüntüleme için izin verir. floresan ile yayılan ışık, bir kısa dalga boylu bir başka ışık tarafından uyarılmasının bir sonucu olduğu; ışıma oysa yayılan ışık bir kimyasal reaksiyon sonucu ve güçlü emisyon 9 olmayabilir. Ayrıca, in vivo flüoresan görüntüleme tüm vücut hayvana zararlı değildir ve araştırmacılar terapötik uygulamaya yanıt olarak, zaman içinde, tümör büyümesini izlemek için olanak sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI media 1640&#160;</td>
			<td>Caisson Labs&#160;</td>
			<td>RPL03-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Ficher Sci</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel HC&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SutureVet PGA 6-0 PGA</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>39010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcare or Foamed Antiseptic Handrub</td>
			<td>Steris</td>
			<td>639680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dubelcco&#39;s Phosphate-Buffered saline)&#160;</td>
			<td>Thermo Ficher Sci</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Syringe 27G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>Blutler Schein</td>
			<td>50562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen&#160;</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, 5.5&#34;straight mayo&#160;</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>22-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 GFP cell line&#160;</td>
			<td>Anticancer, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Imaging System:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBOx Scientia, UVP :</td>
			<td>UVP, LLC&#160; Upland, CA.&#160;</td>
			<td colspan="2">Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent orthotopic mouse model of pancreatic cancer

Pankreas kanseri sağkalım son birkaç on yıl içinde önemli ölçüde artmadı hangi kanser biridir. Sadece tanısı alan hastaların% 7&#39;si beş yıldan daha uzun yaşayacak. anlamak ve pankreas tümörlerinin mikro-taklit etmek için, gerçek zamanlı olarak, tümör ilerlemesinin invazif olmayan görüntüleme sağlar pankreas kanseri bir murin ortotopik bir model kullanılabilir. Yeşil floresan proteini (Panc-1 GFP) ifade Pankreas kanseri hücrelerinin (örneğin, Matrigel HC) serumsuz ortam ile ve daha sonra hastaya da pankreas kuyruk enjekte bazal membran matrisi yüksek konsantrasyon içinde süspansiyon haline getirildi. bu sırada oda sıcaklığına ulaştıktan sonra yüksek konsantrasyonda bazal membran matris içinde hücre süspansiyonu, jel benzeri bir madde olur; Enjeksiyon bölgesinde bir sızdırmazlık oluşturmak ve herhangi bir hücre sızıntısını önlemek, pankreas ile temas, bu nedenle, bu jelleri. diğer organlara tümör büyümesi ve metastaz canlı izlenirfloresan kullanılarak hayvanlar. GFP uyarma ve emisyon için uygun bir filtre kullanımı için çok önemlidir. Araştırmacılar kolayca çıplak farelerde prosedürü çoğaltmak böylece ortotopik implantasyon için adımlar Bu makalede ayrıntılı olarak verilmiştir. Bu protokol ana adımları in vivo görüntüleme hücre süspansiyonu hazırlanması, cerrahi implantasyon ve tüm vücut floresan. Bu ortotopik model, primer ve metastatik tümörler üzerinde yeni tedavilerin etkinliğini araştırmak üzere tasarlanmıştır.

Bu yöntem, enjeksiyon, kemirgenler için uygun anestezi laparotomi ile hücre süspansiyonu verilmesi için, hücre süspansiyonunun hazırlanması odaklanarak, floresan insan pankreas kanser hücrelerinin cerrahi ortotopik implantasyon tarif eder ve floresan in vitro küçük hayvan görüntüleme kullanımı. Iki ve üç hafta arasında bir yeşil floresan sinyali (GFP sinyali) implantasyon sonrası tespiti, gelişmekte olan pankreas kanseri tümörünün (Şekil 1)</...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer at JoVE.com

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pankreas Kanseri Floresan Ortotopik Fare Modeli

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

fluorescent-orthotopic-mouse-model-of-pancreatic-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.5K Görüntüleme.  Western University of Health Sciences. A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here. 

Video: Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Kanser Araştırmaları

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches including the promising immunotherapeutic strategies. Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique that induces tumor cell death without destruction of adjacent collagenous structures, thus enabling the procedure to be performed in tumors very close to blood vessels. Unlike thermal ablation techniques, IRE results in gradual apoptotic cell death, along with immediate ablation induced necrosis, and is currently in clinical use for selected patients with locally advanced PC. An ablative, non-target specific procedure like IRE can induce a myriad of responses in the tumor microenvironment. A few studies have addressed the effects of IRE on tumor growth in other tumor types, but none have focused on PC. We have developed a syngeneic mouse model of PC in which subcutaneous (SQ) and orthotopic tumors can be successfully treated with IRE in a highly controlled setting, facilitating various longitudinal studies post procedure. This animal model serves as a robust system to study the effects of IRE and ways to improve the clinical efficacy of IRE.

Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique used for the treatment of locally advanced pancreatic cancer. Being a relatively new technique, the effects of IRE on the tumor growth are poorly understood. We have developed a syngeneic mouse model that facilitates studying the effects of IRE on pancreatic cancer.

Geri dönüşü olmayan Elektroporasyon etkilerini incelemek için bir Syngeneic pankreas kanseri fare modeli

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

Kollarındaki ve floresan Orthotopic Syngeneic fare modeli androjen bağlı ve kısırlaştırma dayanıklı prostat kanseri

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly its immune-components, is vital to the prognosis and prediction of treatment outcomes, especially those of immunotherapy. TME immune-components are composed of different subsets of tumor-infiltrating immune cells assessable by multi-color FACS. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the deadliest malignances lacking good treatment options, thus an urgent and unmet medical need. One important reason for its non-responsiveness to various therapies (chemo-, targeted, I/O) has been its abundant TME, consisting of fibroblasts and leukocytes that protect tumor cells from these therapies. Orthotopically implanted PDAC is believed to more accurately recapture the TME of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models.
Homograft tumors (KPC) are transplants of mouse spontaneous PDAC originating from genetically engineered KPC-mice (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). The primary tumor tissue is cut into small fragments (~2 mm3) and transplanted subcutaneously (SC) to the syngeneic recipients (C57BL/6, 7&#8211;9 weeks old). The homografts were then surgically orthotopically transplanted onto the pancreas of new C57BL/6 mice, along with SC-implantation, which reached tumor volumes of 300&#8211;1,000 mm3 by 17 days. Only tumors of 400&#8211;600 mm3 were harvested per approved autopsy procedure and cleaned to remove the adjacent non-tumor tissues. They were dissociated per protocol using a tissue dissociator into single-cell suspensions, followed by staining with designated panels of fluorescently-labeled antibodies for various markers of different immune cells (lymphoid, myeloid and NK, DCs). The stained samples were analyzed using multi-color FACS to determine numbers of immune cells of different lineages, as well as their relative percentage within tumors. The immune profiles of orthotopic tumors were then compared to those of SC tumors. The preliminary data demonstrated significantly elevated infiltrating TILs/TAMs in tumors over the pancreas, and higher B-cell infiltration into orthotopic rather than SC tumors.

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

The experimental procedure on the immunophenotyping of murine orthotopic PDAC homografts aims at profiling the tumor immuno-microenvironment. Tumors are orthotopically implanted via surgery. Tumors of 200&#8211;600 mm3 in size were harvested and dissociated to prepare single-cell suspensions, followed by multi-immune marker FACS analysis using different fluorescently-labeled antibodies.

Orthotopic Homogref (Syngeneic) fare birincil KPC pankreas duktal adenokarsinom, akış sitometresi tarafından Immunophenotyping

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and basic cancer researches. Generations of PDX models in traditional host mice are time-consuming and only working for a small proportion of samples. Recently, zebrafish PDX (zPDX) has emerged as a unique host system, with the characteristics of small-scale and high efficiency. Here, we describe an optimized methodology for generating a dual fluorescence-labeled tumor xenograft model for comparative chemotherapy assessment in zPDX models. Tumor cells and fibroblasts were enriched from freshly-harvested or frozen pancreatic cancer tissue at different culture conditions. Both cell groups were labeled by lentivirus expressing green or red fluorescent proteins, as well as an anti-apoptosis gene BCL2L1. The transfected cells were pre-mixed and co-injected into the 2 dpf larval zebrafish that were then bred in modified E3 medium at 32 &#176;C. The xenograft models were treated by chemotherapy drugs and/or BCL2L1 inhibitor, and the viabilities of both tumor cells and fibroblasts were investigated simultaneously. In summary, this protocol allows researchers to quickly generate a large amount of zPDX models with a heterogeneous tumor microenvironment and provides a longer observation window and a more precise quantitation in assessing the efficiency of drug candidates.

This protocol describes optimization procedures in a virus-based dual fluorescence-labeled tumor xenograft model using larval zebrafish as hosts. This heterogeneous xenograft model mimics the tissue composition of pancreatic cancer microenvironment in vivo and serves as a more precise tool for assessing drug responses in personalized zPDX (zebrafish patient-derived xenograft) models.

Karşılaştırmalı Ilaç değerlendirmesi için ev sahipleri olarak zebrafish larvaları kullanarak pankreas kanserinin hasta türevi heterojen xenograft modeli

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional (3D) tumor architecture and low relevance to human cancer. Researchers have recently developed a 3D in vitro cancer model referred to as tumor organoids that can mimic the characteristics of a native tumor in a culture dish. Here, experimental procedures are described in detail for the establishment of bladder tumor organoids from a carcinogen-induced murine bladder tumor, including culture, passage, and maintenance of the resulting 3D tumor organoids in vitro. In addition, protocols to manipulate the established bladder tumor organoid lines for genetic engineering using lentivirus-mediated transduction are described, including optimized conditions for the efficient introduction of new genetic elements into tumor organoids. Finally, the procedure for orthotopic transplantation of bladder tumor organoids into the wall of the murine bladder for further analysis is laid out. The methods described in this article can facilitate the establishment of an in vitro model for bladder cancer for the development of better therapeutic options.

This protocol provides detailed experimental steps to establish a three-dimensional in vitro culture of bladder tumor organoids derived from carcinogen-induced murine bladder cancer. Culture methods including passaging, genetic engineering, and orthotopic transplantation of tumor organoids are described.

Fare Mesane Tümörü Organoidlerinin Kültürü, Manipülasyonu ve Ortotopik Transplantasyonu

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

Murine Pankreatik Duktal Adenokarsinomun Ultrason Eşliğinde Ortotopik İmplantasyonu

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer (PC). To address this deficiency, we describe a mouse model involving orthotopic implantation of PC followed by distal pancreatectomy and splenectomy. The model has been demonstrated to be safe and suitably flexible for the study of various therapeutic approaches in adjuvant and neo adjuvant settings.
In this model, a pancreatic tumor is first generated by implanting a mixture of human pancreatic cancer cells (luciferase-tagged AsPC-1) and human cancer associated pancreatic stellate cells into the distal pancreas of Balb/c athymic nude mice. After three weeks, the cancer is resected by re-laparotomy, distal pancreatectomy and splenectomy. In this model, bioluminescence imaging can be used to follow the progress of cancer development and effects of resection/treatments. Following resection, adjuvant therapy can be given. Alternatively, neoadjuvant treatment can be given prior to resection.
Representative data from 45 mice are presented. All mice underwent successful distal pancreatectomy/splenectomy with no issues of hemostasis. A macroscopic proximal pancreatic margin greater than 5 mm was achieved in 43 (96%) mice. The technical success rate of pancreatic resection was 100%, with 0% early mortality and morbidity. None of the animals died during the week after resection.
In summary, we describe a robust and reproducible technique for a surgical resection model of pancreatic cancer in mice which mimics the clinical scenario. The model may be useful for the testing of both adjuvant and neoadjuvant treatments.

In the clinical context, patients with localized pancreatic cancer will undergo pancreatectomy followed by adjuvant treatment. This protocol reported here aims to establish a safe and effective method of modelling this clinical scenario in nude mice, through orthotopic implantation of pancreatic cancer followed by distal pancreatectomy and splenectomy.

Pankreas Kanserinin Ortotopik Rezeksiyonlu Fare Modeli

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...