Bu protokol, fonksiyonel tahliller ve henotypik karakterizasyon kullanarak kanser kök hücrelerinin sağlam bir şekilde tanımlanmasını ve izole edilmesine olanak sağlar. Bir tümör örneğinden kanser kök hücre izolasyonu bireysel tümörler için spesifik tedavilerin klinik uygulama rehberlik için bir platform olabilir, direnç ve sonuç tekrarı tahmin. Non-adherent süspansiyon kültürleri hazırlamak için, ilk polihema mililitre başına 15 miligram kare 50 mikrolitre ile hücre kültürü kapları kat ve en az iki gün boyunca 37 derece santigrat derece kurutma fırınına kapları yerleştirin.
Kaplar tamamen kuruduğunda, PBS ile yüzde 80-90 eşzamanlı kanser hücre hattı kültürü nde yıkayın ve bir ila iki tripsin EDTA mililitre ile hücreleri ayırmak. 37 santigrat derecede beş dakika sonra, taze hücre kültürü ortamının 2-4 mililitre ile reaksiyon tutuklamak ve santrifüj ile ayrıştırılmış hücreleri yıkayın. Taze kültür ortamındaki peleti saymak için yeniden askıya alın ve kültür çanak konsantrasyonu başına santimetre karelik yüzde 500 ila 2000 hücrede yüzde iki metil selüloz içeren taze küre kültür ortamındaki hücreleri seyreltin.
Küre monokonalitesi sağlamak için, her hücre hattını anakrajsız bir ortamda düşük yoğunlukta tohumlayın. Sonra 37 derece santigrat ve yüzde beş karbondioksit beş günlük kuluçka için polihema kaplı plakalar üzerine hücreleri tohum, epidermal büyüme faktörü mililitre başına on nanogram ve hücre kültürü orta her iki günde bir temel fibroblast büyüme faktörü mililitre başına on nanogram ekleyerek. Kaplamadan 3-12 gün sonra, üç boyutlu top şeklindeki hücre kolonileri ışık mikroskobu ile gözlemlenmelidir.
Türemiş yapışık popülasyonlar elde etmek için, orijinal kanser hücresi hattı için uygun kültür koşulları altında yeni bir kültür çanak küreler aktarın. Kültürün bir ila iki gün sonra, bir hücre monolayer menşe hücre hattına benzer bir morfolojiile yapışık küreler etrafında büyüyen gözlenmelidir. İlgi kanser hücresi hattının küre oluşturan kapasitesini belirlemek için, küre oluşturan protokolü tamamladıktan sonra, santrifüj ile küreleri toplamak.
Küre peletini taze ortamda yavaşça askıya alın ve 40 mikrometreden büyük çaptaki küre sayısını saymak için hemositometre kullanın. Daha sonra elde edilen kürenin ilk kaplanmış hücre sayısına göre yüzde oranını hesaplayın. İlgi hücre hattının kendini yenileme yeteneğini belirlemek için, santrifüj ile küreleri toplamak ve yavaşça 37 santigrat derece beş dakikalık kuluçka için trippsin EDTA küre pelet yeniden askıya.
Kuluçka sonunda, tüp enzim ve aktivasyon orta ekleyin ve pipet tek hücreli süspansiyon elde etmek için çözüm. Bir hemositometre ve trippan mavi dışlama yöntemi kullanarak, süspansiyon canlı hücreleri saymak ve sadece gösterildiği gibi bir küre oluşturan tsay için poliHEMA kaplı plakalar hücreleri plaka. Sekiz gün sonra, 40 mikrometreden fazla çapa sahip küre sayısını saymak için bir hemositometre kullanın ve elde edilen kürelerin ilk kaplanmış hücre sayısına göre yüzde oranını hesaplayın.
Kürelerin işgal ettiği alanı değerlendirmek için kültür çanamasını görüntü edinme modülüyle donatılmış ters bir mikroskobun sahnesine yerleştirin ve 100X ila 400X büyütme seçin. Koşul başına en az on rasgele alanın görüntülerini alın ve kürelerin etrafında ilgi bölgeleri çizmek için uygun bir görüntü analizi yazılım programı kullanın. Ardından, piksellerin ilgi çekici her bölgesinin alanını ölçün ve ölçülen piksellerin ortalama alanı olarak küre projeksiyon alanını hesaplayın.
Küre oluşturan kapasitenin fonksiyonel karakterizasyonu, kendini yenileme ve kanser kök hücrelerinin projeksiyon alanı uzak soy ve menşe doku larının karşılaştırılmasına olanak sağlar. Küre oluşturma protokolü küresel kolonilerin birkaç endometriyal ve meme kanseri hücre hattından süspansiyon veya insan tümör örneklerinden dokuların nazik enzimatik sindirim sonra elde edilmesine olanak sağlar. Hem endometrial hem de meme kanseri küreleri, kaplamadan 1-2 gün sonra, menşei olan hücre çizgisine benzer morfolojilere sahip bir hücre monokatmanına yol açar.
Bu temsili deneylerde, hormonal reseptör pozitif meme kanseri MCF-7 hücreleri daha yüksek bir küre oluşturma kapasitesi gösterdi, kendini yenileme yeteneği, ve projeksiyon alanı üçlü negatif HCC1806 meme kanseri hücreleri daha. Küre oluşturan protokol ile kanser kök hücre zenginleştirmenin yanı sıra, akış sitometrisi gibi tamamlayıcı yöntemlerle köklerinin daha fazla değerlendirilmesini öneriyoruz. Endometrial hücre hatlarından elde edilen kürelerin bu temsili analizinde, her hücre hattında kanser kök hücre belirteçlerini ifade eden dört hücre popülasyonu akış sitometrisi ile tespit edilmiştir.
Tümör kürelerinin diğer moleküler biyoloji teknikleri ile değerlendirilmesi köklüğü ve kanser kök hücrelerinin plastisitesini doğrulayabilir ve hedeflenen tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştırabilir. Hafif küre hasat sonra Batı leke analizi de in vitro oluşturulan küreler için bir kanser kök hücre fenotip ortaya. Bu izolasyon protokolü klinik nüks, metastaz ve tedavi direnci anlamak anlamına gelir kanser kök hücre önemi anlayışımıza katkıda bulunur.
