Protokolümüz, araştırmacıların pahalı ekipman kullanmadan vahşi tip ve genetik mantar mutantlarının erken enfeksiyon adımlarını görselleştirmelerini sağlayan basitleştirilmiş bir yöntemdir. Bu tekniğin temel avantajı, karmaşık biyolojik soruları cevaplamak ve mantar mutantlarının daha fazla analiz için hızlı bir şekilde taranması için temel laboratuvar malzemelerinin kullanılmasıdır. Bu tekniğin zor bir kısmı kılıfın tedavisidir.
Kılıf, kolayca zarar görebilecek ince bir hücre tabakasıdır, bu nedenle başarılı bir deney için dikkatli kullanım şarttır. Başlamak için, ikinci yaprak aşamasına kadar yetiştirilen arpaları seçin. Steril makas kullanarak, arpa bitkisini toprak çizgisinin hemen üzerinde kesin.
Forseps ve neşter kullanarak, uzunlamasına açık olan ilk yaprağın kılıfını dikkatlice kesin. Forsepsleri kullanarak, ikinci yaprağın tabanından çıkarın. Bir neşter kullanarak, ilk yaprağın çoğunu kılıftan uzaklaştırın ve montaj için yaprak dokusunun sadece 0,5 inçini bırakın.
İlk yaprağı, plakanın içindeki nemi korumak için ıslak bir kağıt havlu içeren steril bir 60 milimetre Petri kabına yerleştirin. Yaprak dokusunu Petri kabının dibine bantlayın. Dokuz ila 12 günlük bir Magnaporthe oryzae kültür plakası seçin ve üzerine 0,5 ila iki mililitre steril su ekleyin.
Steril bir aşılama döngüsü kullanarak, ekli konidiayı serbest bırakmak için miseli yavaşça kazıyın. Konidiyal süspansiyondan büyük miselyum parçalarını filtrelemek için konidiyal süspansiyonu küçük bir parça peynir bezi içeren bir mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice pipetin. Gerekirse, spor konsantrasyonunu steril suyla mililitre başına beş kez 10 ila dördüncü sporlara kadar seyreltin, çünkü konsantrasyonun çok yüksek olması bireysel enfeksiyon bölgelerinin görüntülenmesini zorlaştırır.
Kılıf boyutuna bağlı olarak, haddelenmiş yaprak kılıfının içindeki konidiyal süspansiyonun 25 ila 50 mikrolitresini dikkatlice pipetin. Daha sonra, dört veya beş adet 500 mililitrelik beheri çift damıtılmış suyla doldurun ve buharlaşana kadar ısıtın. Petri kabının kapağını, tabağın içindeki nemi hapsetmek için buharda pişirilen beherlerden birinin üzerinde tutun.
Enfekte yaprak kılıf plakalarını istifleyin ve sporların çimlenmesi için nemli, nemli bir ortam yarattığı için kalan sıcak beherlerle çevreleyin. Bu kurulumu düz renkli bir kauçuk veya plastik kutu ile kaplayarak ve 48 saat boyunca veya görüntüleme için istenen zaman noktasında rahatsız edilmeden bırakarak ışıktan koruyun. Taze seyreltilmiş %45 asetik asit ve %0,1 tripan mavisini karıştırarak lekeyi hazırlayın.
Boya çözeltisinin bir mililitresini mikrosantrifüj tüplerine aliquot. Bir neşter kullanarak, yaprak kılıfını banttan dikkatlice kesin. Forseps kullanarak, kılıfı mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve boya çözeltisine tamamen batırıldığından emin olun.
Boyanın yaprağa nüfuz etmesi için tüplerin 40 santigrat derecelik bir ısı bloğunda veya su banyosunda iki saat beklemesine izin verin. Daha sonra, ekstra boyayı çıkarmak için yaprak kılıflarını% 60 taze gliserol içinde üç kez dikkatlice durulayın. Kılıfı slaytlara monte etmeye hazır olana kadar gliserol içinde tutun.
Kılıfı temiz bir cam slayda yerleştirin ve birkaç damla% 60 gliserol ekleyin. Diseksiyon mikroskobu ve iki çift forseps kullanarak, aşılanmış merkezi yukarı bakacak şekilde bırakarak kılıfı dikkatlice açın. Kılıfı forseps ile açık tutarak, kılıfın kıvrılmasını ve enfeksiyon bölgesini tıkamasını önlemek için kapak kaymasını üstüne yerleştirin.
Uzun süreli depolama veya bant kısa süreli depolama için oje kullanarak kapak fişini kapatın. Slaytları bileşik ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Mikroskopa bir cep telefonu adaptörü takarak akıllı telefonla temel görüntüleri çekin.
Android cihazlar için, kamera uygulaması ayarlarını yanıp sönecek şekilde ayarlayın, üst çekimi devre dışı bırakın, parlaklık ve gölgelerin otomatik olarak ayarlanmasını devre dışı bırakın ve fotoğraf çözünürlüğünü tam olarak ayarlayın. Cep telefonunu monte ettikten sonra, verileri elde etmek için istenen bir hedefe sahip bir ölçek mikrometresinin görüntüsünü alın. Telefonun yakınlaştırmasını 2,5 x'e ayarlayın ve tutarlı bir piksel boyutunu korumak için tutarlı tutun.
Kılıfın merkezi, en büyük spor konsantrasyonuna ev sahipliği yapar ve appressoria'yı enfekte eder. Bu nedenle, istatistiksel analiz için önemli sayılar elde etmek için her kılıfın dokuz ila 12 görüntüsünü hedefleyin. Kılıfın enfeksiyon bölgeleri, tripan mavisi ile boyandıktan sonra bir akıllı telefon ve akıllı telefon mikroskop adaptörü kullanılarak görüntülendi.
Boyama işlemindeki ısı ve asetik asit, yaprak dokusunu nazikçe yumuşatır. % 60 gliserol içindeki boyama sonrası durulamalar sadece fazla lekeyi çıkarmakla kalmaz, aynı zamanda yaprağın neden olduğu ışık saçılımını azaltmaya ve görüntü kalitesini iyileştirmeye yardımcı olur. Boyama protokolünden sapmalar, burada gösterildiği gibi optimal olmayan sonuçlara neden olabilir.
4091 vahşi tip ile enfekte olmuş arpa, yaprak kılıf dokusu içinde enfekte olmuş hiflerin varlığı ile tanımlanan başarılı bir şekilde enfekte olmuş hücreler üretti. Mutant J99A enfeksiyonu durumunda, appressoria ve penetrasyon mandallarının başarılı gelişimi fark edildi, ancak invaziv hifler üretmedi. Enfeksiyona dayalı analizler için zamanlama önemlidir.
Uygun şekilde yaşlandırılmış bitkiler ve mantar sporları başarı için gereklidir. Bu çalışmada enfeksiyon yapılarının varlığına veya yokluğuna baktık. Ek deneyler, enfeksiyon yapısının fenotipi ve istilacı hiflerin fenotipi ile ilgili soruları cevaplayabilir.
Metodolojimiz yeni değil, daha karmaşık, pahalı bir deneyin basitleştirilmiş, erişilebilir bir versiyonudur.
