Bu yöntem, Rice Shoots'ta Derin Floresan Gözleminde, temizleme çözeltisinin sınırlı doku penetrasyonu ve konfokal mikroskop altında gerçek çözünürlük gibi zorlukları ele almaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, makro perspektiften çok büyük dokuların yapı gözlemi, hatta yetişkin erized sürgünler gibi sert ve kalın dokularla yapılan istemlerdir. Bu yöntem, geniş bitki türlerinde sert ve kalın dokuların derin görüntülenmesi için geçerlidir.
Bitki biyolojik araştırmalarında yeni fenomenlerin keşfini hızlandırmaya yardımcı olabilir. Başlamak için, bitkilere zarar vermeden kökleri dikkatlice kesin ve kiri gidermek için suyla yıkayın. Şimdi, eski dış yaprakları soymak için cımbız kullanın.
Hücrelerin ezilmesini önlemek için, dokuyu sürgünden, apikal meristemden veya genç salkımdan tabana kesmek için kayma hareketine sahip tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanın. Sürgün apikal meristeminin veya genç salkımının konumu görünmüyorsa, daha uzun süre kesin. Pirinç filizi oval bir kesitlidir.
Ovalin bir tarafını uzun ekseni yönünde ince bir şekilde tıraş etmek için çift kenarlı bir tıraş bıçağı kullanın. Sürgün apikal meristeminin veya genç salkımının konumunu, numunede beyazımsı bir rengin ortaya çıkmasıyla onaylayın ve fazla dokuyu kesin. Numuneyi, bir mililitre fiksatif çözelti içeren 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne koyun.
2,5 santimetrekarelik bir parafin film parçasını kesin ve bir top haline getirin. Şimdi, fiksatif çözeltiden dışarı kaymalarını önlemek için bu topları numunelerin üzerine yerleştirin. Numuneyi içeren tüpü bir kurutucuya yerleştirin.
Kurutucunun kapağını kapatın ve eksi 0,095 megapaskal basınca ulaşana kadar kurutucunun içini yavaşça basınçsızlaştırmak için vakum pompasını çalıştırın. Kurutucuyu eksi 0.095 megapascal'da kapattıktan sonra, vakum pompasını kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Kurutucuyu hafifçe açın ve yavaşça atmosferik basınca geri döndürün.
Numune doğru şekilde sabitlenirse, fiksatif çözeltiye batar. Ve eğer batmazsa, basıncı tekrar azaltın. Parafin filmini çıkarın.
Kapağı kapatın ve tüpleri gece boyunca dört santigrat derecede tutun. Tüy bırakmayan mendiller kullanarak, fazla fiksatif çözeltiyi numuneden çıkarın ve numuneyi anında tutkal ile titreşimli bir mikro dilimleyici tepsiye sabitleyin. Numuneyi, numune alma sırasında tıraş edilen düz tarafı aşağı doğru bir tepsiye yerleştirin ve kırpma koşullarını sabit numuneye göre ayarlayın.
Geri veya ileri düğmesi ve yukarı veya aşağı düğmesiyle numune konumunu ayarlayın ve tüm numuneler daldırılana kadar tepsiyi deiyonize suyla doldurun. Tepsiyi doldurduktan sonra, başlat düğmesine basın ve kırpılmış örnekleri bir damla PBS ile bir cam slayta yerleştirin. Hedef bölgeyi içeren numuneyi stereo mikroskop altında kontrol edin ve kesilmiş numuneyi bir mililitre PBS içeren çok kuyulu bir plakaya aktarın.
PBS'yi çok kuyulu plakadan çıkarın. Yeni PBS ekleyin ve bir dakika bekletin. PBS'yi kaldırın ve CS'yi ekleyin. Numuneyi içeren çok kuyucuklu plakayı bir kurutucuya yerleştirin ve kapağı kapatın.
Ardından, kurutucunun içini eksi 0.09 megapascal'a kadar yavaşça basınçsızlaştırmak için vakum pompasını çalıştırın. Kurutucuyu eksi 0.09 megapascal'da kapattıktan sonra, vakum pompasını kapatın ve oda sıcaklığında bir saat bekletin. Kurutucuyu hafifçe açın ve yavaşça atmosferik basınca geri döndürün.
CS'nin buharlaşmasını önlemek için kuyucuklar arasındaki boşluğa deiyonize su dökün ve çok kuyulu plakaları temizlemek için karanlıkta oda sıcaklığında saklayın. CS yeşile döndüğünde, yeni bir çözümle değiştirin. Kesilmemiş örnekler yeşil kaldı ve tüm yapraklardan soyulmuş CS.In örneklerle üç aylık tedaviden sonra şeffaf hale gelmedi, düğümler yeşil kalmasına rağmen, düğümler arası düğümler bir hafta sonra beyaza döndü.
Numune dört hafta sonra şeffaf hale gelmedi. Elle kesilmiş örnekler bir haftalık CS tedavisinden sonra beyazlaştı, ancak dört hafta sonra şeffaf hale gelmedi. 130 mikrometre kalınlığa kadar kesilen numuneler, bir haftalık CS tedavisinden sonra yarı saydam hale geldi.
Numune iki hafta sonra neredeyse şeffaftı. Düğümde, CS tedavisinin bir haftasından sonra gözlemlenebilir derinlik eksi 60 mikrometre ve iki hafta sonra eksi 90 mikrometre idi. Floresan sinyaller üç haftada eksi 80 mikrometre derinlikte ve dört haftada eksi 100 mikrometre derinlikte gözlendi.
İnternodda, CS tedavisi olmadan eksi 60 mikrometre derinlikte floresan sinyaller gözlendi. Gözlemlenebilir derinlik, CS tedavisinden bir hafta ila üç hafta sonra eksi 90 mikrometre ve dört hafta sonra eksi 100 mikrometre idi. Yapraklarda floresan sinyalleri, CS tedavisi olmadan eksi 90 mikrometre derinlikte gözlendi, ancak parlaklık diğer dokulardan daha zayıftı.
Bir hafta sonra, sinyaller daha parlaktı ve eksi 120 mikrometre derinlikte gözlendi. Transkripsiyon faktörü OS MASU 15 mOrange'ın ekspresyonu genç Salkım, yaprak, düğüm, internod ve fleüretette gözlendi. Önemli olan, bitkiler veya dokular için en iyi koşulları, örneğin periyot ve vakum basıncını veya pozisyonunu ve CS tedavisini, zamanlamasını, kalınlığını, hızını ve uygun boyama solüsyonunu bulmaktır.
Zamanlama ve kürleme teknolojisinin kombinasyonu, gen ekspresyon paterninin ve tek bir bölümün çoklu dokularında hücreler arası iletişimin mekansal zamansal gözlemine izin verir.
