DMS-MaP, RNA yapısının anlık görüntüsünü almamızı ve farklı koşullar altında nasıl değiştiğini öğrenmemizi sağlayan dizileme tabanlı bir yöntemdir. Kristalografi ve elektron mikroskobu gibi geleneksel yapı belirleme yöntemlerinin aksine, DMS-MaP hücrelerde ve dekonvolüt RNA yapı topluluklarında kullanılabilir. RNA yapısının çok sayıda biyolojik fenomende etkileri olduğu için, yöntemimiz biyolojik araştırmanın hemen hemen her alanına mekanik bakış açısı sağlayabilir.
Yeniden katlanan tamponun 89 mikrolitresini, son hacmi 100 mikrolitreye sahip her reaksiyon için belirlenmiş 1,5 mililitrelik bir tüpe aktararak başlayın. Tüpü, kimyasal bir başlığın altına yerleştirilmiş bir termoshaker'da 37 santigrat derecede önceden ısıtın. Bir PCR tüpüne 10 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin ve içine bir ila 10 pikomol RNA aktarın.
RNA'yı denatüre etmek için bir dakika boyunca 95 santigrat derecede bir termosikler içinde inkübe edin. Ve sonra RNA'nın yanlış katlanmasını önlemek için tüpü hemen bir buz bloğuna yerleştirin. Şimdi, RNA'yı yeniden düzeltmek için, numuneyi 37 santigrat derecede yeniden katlanan tamponu içeren belirlenmiş tüpe ekleyin ve 10 ila 20 dakika boyunca inkübe etmeden önce iyice karıştırın.
Daha sonra, RNA örneğini içeren tüpe 10.5 molar konsantrasyona sahip bir mikrolitre% 100 Dimetil Sülfat veya DMS ekleyin ve reaksiyon karışımını dakikada 800 ila 1.400 rotasyonda sallarken beş dakika boyunca inkübe edin. Beş dakikalık reaksiyondan sonra, 60 mikrolitre% 100 beta-merkaptoetanol ile söndürün ve vortekslemeden önce iyice karıştırın ve RNA'yı hemen buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra RNA'yı temizleyin ve 10 mikrolitre nükleaz içermeyen suda süzün.
RNA'yı bir spektrofotometre kullanarak sayısallaştırın. Son olarak, modifiye edilmiş RNA'yı eksi 80 santigrat derecede saklayın. Reaksiyon karışımını PCR tüpüne ekledikten sonra, 10 mikrolitre nükleaz içermeyen suda salınımlı modifiye RNA'nın en az 100 nanogramını PCR tüpüne aktarın.
Karışımı bir termosiklusta 30 dakika ila 1,5 saat boyunca 57 santigrat derecede inkübe edin. 500 nükleotid içeren bir ürün yapmak için 30 dakika yeterlidir. Daha sonra, bir mikrolitre dört molar sodyum hidroksit ekleyin, pipetle iyice karıştırın ve RNA'yı bozmak için üç dakika boyunca 95 santigrat derecede inkübe edin ve TGIRT'yi tamamlayıcı DNA'dan serbest bırakın.
Primerleri çıkarmak için sütun tabanlı bir yaklaşım kullanarak, tamamlayıcı DNA'yı temizleyin. Ve yükseltmek için PCR yapın. Kütüphane hazırlığına geçmeden önce PCR ürününün iki mikrolitresini bir agaroz jeli üzerinde çalıştırarak PCR başarısını doğrulayın.
Ardından, parçaları sıralama için indekslemeden önce bir spektrofotometre kullanarak çıkarılan parçaları ölçün. İstenilen enfeksiyon aşamasına kadar yetiştirilen virüs bulaşmış hücreleri, gerekli biyogüvenlik seviyesine sahip özel ve uygun bir duman davlumbazına aktarın. Hücreleri içeren kültür ortamına% 2.5 hacimli DMS ekleyin ve kabı parafilm ile kapatın.
Kabı hemen beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, DMS içeren ortamı dikkatlice pipetleyin ve uygun kimyasal atıklara atın. Daha sonra hücrelere yavaşça 10 mililitre durdurma tamponu ekleyin, hücreleri kazıyın ve 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.
Tüpü 3.000 g'da üç dakika boyunca santrifüj ederek hücreleri toplayın. Süper natantı çıkarın ve hücre peletini 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın. Yıkamadan sonra kalan PBS'yi mümkün olduğunca dikkatlice çıkarın.
RNA ekstraksiyonunu gerçekleştirmek için peleti uygun miktarda RNA izolasyon reaktifi içinde çözün. Daha sonra, RNA izolasyon reaktifindeki bir mililitre homojenize hücreye 200 mikrolitre kloroform ekleyin ve hücre çözeltisi parlak pembeye dönene kadar 15 ila 20 saniye boyunca vorteks yapın. Faz ayrımı gerçekleşene kadar bekleyin, bu da altta pembe lipit fazının yerleşmesiyle gösterilir.
Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarmadan önce tüpü dört santigrat derecede 15 dakika boyunca yaklaşık 20.000 g hızda döndürün. RNA'yı temizleyin ve yeterli miktarda nükleaz içermeyen su içinde süzün. Daha sonra, tercih edilen yaklaşımı kullanarak ribozomal RNA tükenmesini gerçekleştirdikten sonra, RNA'yı yeterli miktarda nükleaz içermeyen suda süzün ve bir spektrofotometre kullanarak sayısallaştırın.
Saflaştırılmış RNA, RT-PCR'de tekrar kullanılabilir. Söz konusu web sunucusu kullanılarak DMS-MaP verileri rahatlıkla analiz edilebilir. Okumalar bir referansla eşlenir ve baz başına mutasyonlar sayılır.
Ortaya çıkan popülasyon ortalaması dosyaları, iyi bilinen RNA yapı tahmin yazılımında kısıtlamalar olarak kullanılabilir. Ortaya çıkan minimum serbest enerji yapıları, VARNA gibi bir yazılım kullanılarak görselleştirilebilir. Şu an itibariyle, sadece DREAM'in kararlı versiyonu RNA yapı topluluklarını dekonvolüte edebilir.
Ancak, bu özelliği tüm topluluk için daha erişilebilir hale getirme çalışmaları devam etmektedir. Bir T7 polimeraz promotörünün bağlanmasıyla uzatılan gBlock fragmanının in vitro transkripsiyonu,% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde 300 nükleotitte tek bir bant olarak ortaya çıkan, ilgilenilen RNA'yı üretti. DMS modifiye RNA üzerinde gerçekleştirilen gen-spesifik RT-PCR'nin başarısı,% 2'lik bir agaroz jeli üzerinde 300 baz çiftinde tek bir bant ile gösterildi.
İndekslenmiş parça beklendiği gibi yaklaşık 150 baz çifti daha yüksek görünüyordu. DMS tedavisi, virüs enfeksiyonundan dört gün sonra sitopatik etki gösteren HCT-8 hücrelerine uygulandı. Ekstrakte edilen toplam RNA, agaroz jeli üzerinde, 40S ve 60S alt birimlerini hesaba katan iki parlak bant olarak ortaya çıktı.
Ribozomal RNA tükenmesinden sonra, iki parlak bant kayboldu ve karşılık gelen şeritte bir yayma bıraktı. Kütüphane hazırlandıktan sonra, örnekler farklı boyut dağılımlarına sahipti ve bir yayma olarak ortaya çıktı. Bant 200 ila 500 nükleotid arasında eksize edildi ve adaptör dimerleri ayrıldı.
SARS-CoV-2 genomunun yapı modeli, açık konformasyonlu bazların, baz eşleştirmesi yapanlara kıyasla daha yüksek reaktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Baz reaktivite profili, urasil ve guaninin düşük reaktivite değerlerine sahip olduğunu ve DMS tarafından değiştirilmediğini göstermiştir. Yöntemimizle, hücrelerdeki yapıları boyut kısıtlamaları olmadan yüksek verimli bir şekilde tahmin edebiliyoruz.
Kontrol ölçümleri çok önemlidir, çünkü yapı tahminlerinin doğruluğu hakkında fikir verirler. Tahminin doğruluğunu daha fazla doğrulamak için, yapıyı rahatsız eden veya değiştiren daha fazla deney yapılmalıdır.
