O DMS-MaP é um método baseado em sequenciamento que nos permite obter um instantâneo da estrutura do RNA e aprender como ele muda sob diferentes condições. Em contraste com os métodos convencionais de determinação de estrutura, como cristalografia e microscopia eletrônica, o DMS-MaP pode ser usado em células e conjuntos de estrutura de RNA deconvoluto. Como a estrutura do RNA tem implicações em uma infinidade de fenômenos biológicos, nosso método poderia fornecer insights mecanicistas sobre quase qualquer campo de pesquisa biológica.
Comece transferindo 89 microlitros do tampão redobrável para um tubo designado de 1,5 mililitro para cada reação com um volume final de 100 microlitros. Pré-aqueça o tubo a 37 graus Celsius em um termoshaker colocado sob um capuz químico. Adicione 10 microlitros de água livre de nuclease em um tubo de PCR e transfira de um a 10 picomoles de RNA nele.
Incube-o em um termociclador a 95 graus Celsius por um minuto para desnaturar o RNA. E, em seguida, coloque imediatamente o tubo em um bloco de gelo para evitar o desdobramento do RNA. Agora, para remodelar o RNA, adicione a amostra ao tubo designado contendo o tampão de redobramento a 37 graus Celsius e misture-o bem antes de incubá-lo por 10 a 20 minutos.
Em seguida, adicione um microlitro de 100% de sulfato de dimetilo, ou DMS, com uma concentração de 10,5 molares no tubo que contém a amostra de RNA, e incube a mistura de reação por cinco minutos enquanto agita-a a 800 a 1.400 rotações por minuto. Após a reação de cinco minutos, apague-o com 60 microlitros de 100% de beta-mercaptoetanol e misture-o bem antes do vórtice e coloque imediatamente o RNA no gelo. Em seguida, limpe o RNA e eluia-o em 10 microlitros de água livre de nuclease.
Quantifique o RNA usando um espectrofotômetro. Finalmente, armazene o RNA modificado a menos 80 graus Celsius. Depois de adicionar a mistura de reação no tubo de PCR, transfira pelo menos 100 nanogramas do RNA modificado eluído em 10 microlitros de água livre de nuclease para o tubo de PCR.
Incubar a mistura a 57 graus Celsius por 30 minutos a 1,5 horas em um termociclador. 30 minutos é suficiente para fazer um produto contendo 500 nucleotídeos. Em seguida, adicione um microlitro de quatro hidróxido de sódio molar a ele, misture bem por pipeta e incube a 95 graus Celsius por três minutos para degradar o RNA e liberar TGIRT do DNA complementar.
Usando uma abordagem baseada em coluna para remover os primers, limpe o DNA complementar. E execute PCR para amplificá-lo. Verifique o sucesso da PCR executando dois microlitros do produto de PCR em um gel de agarose antes de prosseguir para a preparação da biblioteca.
Em seguida, quantifique os fragmentos extraídos usando um espectrofotômetro antes de indexar os fragmentos para sequenciamento. Transfira as células infectadas pelo vírus cultivadas para o estágio desejado de infecção para um exaustor dedicado e apropriado com o nível de biossegurança exigido. Adicione 2,5% de volume de DMS ao meio de cultura que contém as células e sele o recipiente com parafilme.
Incube imediatamente o recipiente a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, pipetar cuidadosamente e descartar o meio contendo DMS em resíduos químicos apropriados. Em seguida, adicione suavemente 10 mililitros de tampão de parada nas células, raspe as células e transfira-as para um tubo cônico de 15 mililitros.
Pellet para baixo das células centrifugando o tubo por três minutos a 3.000 g. Remova o sobrenadante e lave o pellet da célula duas vezes com 10 mililitros de PBS. Remova cuidadosamente o PBS residual, tanto quanto possível, após a lavagem.
Dissolva o pellet em uma quantidade apropriada de reagente de isolamento de RNA para realizar a extração de RNA. Em seguida, adicione 200 microlitros de clorofórmio a um mililitro de células homogeneizadas no reagente de isolamento de RNA e vortex-o por 15 a 20 segundos até que a solução celular fique rosa brilhante. Espere até que a separação de fases tenha ocorrido, o que é indicado pela fase lipídica rosa que se instala na parte inferior.
Gire o tubo a uma velocidade de cerca de 20.000 g por 15 minutos a quatro graus Celsius antes de transferir a fase aquosa superior para um novo tubo. Limpe o RNA e eluia em um volume suficiente de água livre de nuclease. Em seguida, depois de realizar a depleção de RNA ribossomal usando a abordagem preferida, elua o RNA em um volume adequado de água livre de nuclease e quantifique-o usando um espectrofotômetro.
O RNA purificado pode ser usado novamente em RT-PCR. Usando o servidor web mencionado, os dados DMS-MaP podem ser convenientemente analisados. As leituras são mapeadas para uma referência e as mutações por base são contadas.
Os arquivos de média populacional resultantes podem ser usados como restrições em um software de previsão de estrutura de RNA bem conhecido. As estruturas mínimas de energia livre resultantes podem ser visualizadas usando software como o VARNA. A partir de agora, apenas a versão estável de DREAM pode deconvoluir conjuntos de estruturas de ARN.
No entanto, o trabalho para tornar esse recurso mais acessível a toda a comunidade está em andamento. A transcrição in vitro do fragmento gBlock alongado pela fixação de um promotor de polimerase T7 gerou o RNA de interesse, aparecendo como uma única banda a 300 nucleotídeos em um gel de agarose a 1%. O sucesso da RT-PCR gene-específica realizada no RNA modificado pelo DMS foi indicado por uma única banda a 300 pares de bases em um gel de 2%agarose.
O fragmento indexado apareceu aproximadamente 150 pares de bases mais alto, como esperado. O tratamento com DMS foi realizado em células HCT-8 com efeito citopático quatro dias após a infecção pelo vírus. O RNA total extraído apareceu no gel de agarose como duas bandas brilhantes, representando as subunidades 40S e 60S.
Após a depleção do RNA ribossômico, as duas bandas brilhantes desapareceram, deixando um esfregaço na pista correspondente. Após o preparo da biblioteca, as amostras apresentaram distribuições de tamanho variável e apareceram como um esfregaço. A banda foi excisada entre 200 e 500 nucleotídeos, e os dímeros adaptadores foram separados.
O modelo de estrutura do genoma do SARS-CoV-2 mostrou que as bases com conformação aberta têm maior reatividade em comparação com aquelas envolvidas no emparelhamento de bases. O perfil de reatividade das bases indicou que o uracilo e a guanina apresentaram baixos valores de reatividade e não foram modificados pelo DMS. Com o nosso método, somos capazes de prever estruturas em células de uma maneira de alto rendimento, sem restrições de tamanho.
As métricas de controle são muito importantes, pois fornecem informações sobre a precisão das previsões de estrutura. Para verificar ainda mais a precisão da previsão, mais experimentos que perturbem ou alterem a estrutura devem ser realizados.
