Bu protokol, hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri kullanılarak ilaç canlılığı deneyleri gerçekleştirmek için düşük maliyetli bir yöntemi açıklar. Bu tekniğin temel avantajları, düşük maliyetli ve kolayca bulunabilen malzeme ve laboratuvar ekipmanlarının kullanılmasıdır. Bu yöntem, pahalı, yüksek verimli ilaç taramaları yapılmadan önce kullanılabilir.
Yöntem, hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidlerinde ilaç canlılık testlerinin yapılmasıyla ilgilense de, murin türevli olanlar da dahil olmak üzere herhangi bir organoid sisteme uygulanabilir. Başlamak için, %70 ila 90 birleşme sağlamak için bazal membran ekstraktını veya organoidler içeren BME'yi parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin. Bir pipet kullanarak, organoidleri içeren kuyucuğa bir ila iki mililitre önceden ısıtılmış baz ortam ekleyin ve organoidleri yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik olarak ayırın.
Tüm organoid süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri daha da ayrıştırmak için tüpü beş ila 10 saniye boyunca vorteksleyin. Ardından, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1.107 G'de santrifüjleyin. Tek kanallı bir pipet kullanarak, süpernatanı aspire edin ve atın.
Pelet, 37 santigrat dereceye önceden ısıtılmış bir mililitre organoid ayrışma reaktifi içinde yeniden süspanse edin ve süspansiyonu 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Numuneyi 37 santigrat derecede yedi dakika inkübe edin. Daha sonra sonucu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1.107 G'de hücre süspansiyonunda santrifüjleyin.
Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini bir mililitre önceden ısıtılmış baz ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri, 10 mikrolitre başına 20.000 hücrelik bir nihai konsantrasyonu koruyarak, baz ortam ve BME karışımında sulandırın. Siyah opak 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına yeniden süspanse edilmiş hücrelerin üç mikrolitrelik bir damlacığını plakalayın.
Plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Son olarak, plakayı 24 ila 72 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce her bir oyuğa 100 mikrolitre önceden ısıtılmış gelişmiş organoid ortam ekleyin. Organoidlerin ilaçla tedavisini kaplamadan iki gün sonra gerçekleştirin.
İlaç tedavisinden yedi gün sonra organoidler üzerinde canlılık testi yapın. Her bir oyuğa 100 mikrolitre canlılık tahlil reaktifi ekleyin, toplam hacmi 200 mikrolitreye getirin ve plakayı beş dakika boyunca 80 RPM'de sallayın. Ardından plakanın oda sıcaklığında 25 dakika daha inkübe etmesine izin verin.
Bu arada, biyolüminesans plaka okuyucuyu açın ve gözle kontrol yazılımını açın. Cihaza bağlanmak için gidin"ve Infinite 200Pro'yu seçin"Lüminesansı seç"ve varsayılan komut dosyası"Açılır menüden sonra, lüminesans parametrelerini ayarlamak için plaka tipi olarak BD 96 FB Falcon BD Falcon 96 Düz Siyah"ı seçin. Zayıflamayı yok olarak atayın.
Entegrasyon süresi 1000 milisaniye ve yerleşme süresi sıfır milisaniyedir. Son olarak, plakayı açın, plaka okuyucuya yükleyin ve başlamak için başlat düğmesine basın. Protokolde kullanılan iki farklı hasta kaynaklı organoid veya PDO için Brightfield görüntüleri elde edildi.
Bir tümör biyopsisinden türetilen PDO bir ve asitten türetilen PDO iki. Canlılık testinin sonuçları, her ikisi de değişen konsantrasyonlarda karboplatin ile muamele edildikten sonra PDO bir ve PDO ikideki canlı hücrelerin yüzdesini ortaya çıkardı. Hesaplanan büyüme hızı veya GR değerleri, karşılık gelen karboplatin konsantrasyonlarına karşı çizildi ve GR ölçümleri, PDO bir için GR50 değerinin PDO iki için olandan çok daha yüksek olduğunu ortaya koydu.
Bu, PDO birin platin kemoterapisine daha dirençli olduğunu gösterdi Kaplama sırasında, hücre süspansiyonunun üç mikrolitrelik damlacığının doğrudan kuyunun ortasına yerleştirilmesi çok önemlidir. Damlacık, kuyu kenarına yakın bir yere yerleştirilirse, damlacığın çökmesine neden olarak tahlil sonuçlarını etkileyebilir.
