Este protocolo descreve um método de baixo custo para a realização de ensaios de viabilidade de drogas utilizando organoides derivados de câncer de ovário de pacientes. As principais vantagens dessa técnica são a utilização de materiais e equipamentos laboratoriais de baixo custo e prontamente disponíveis. Este método pode ser usado antes de realizar caras telas de drogas de alto rendimento.
Embora o método lide com a realização de ensaios de viabilidade de drogas em organoides de câncer de ovário derivados de pacientes, ele pode ser aplicado a qualquer sistema organoide, incluindo aqueles que são derivados de murina. Para começar, observe o extrato da membrana basal ou BME contendo organoides sob um microscópio de campo claro para garantir 70 a 90% de confluência. Usando uma pipeta, adicione um a dois mililitros de meio base pré-aquecido ao poço contendo os organoides e dissociar mecanicamente os organoides pipetando-os para cima e para baixo.
Transfira toda a suspensão organoide para um tubo cônico de 15 mililitros e avance o tubo por cinco a 10 segundos para desagregar ainda mais as células. Em seguida, centrifugar as células a 1,107 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Usando uma pipeta de canal único, aspirar e descartar o sobrenadante.
Ressuspenda o pellet em um mililitro de reagente de dissociação organoide pré-aquecido a 37 graus Celsius e transfira a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Incubar a amostra durante sete minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, centrifugar o resultado em suspensão celular a 1,107 G por cinco minutos à temperatura ambiente.
Após descartar o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de meio base pré-aquecido. Reconstituir as células em uma mistura de meios base e BME, mantendo uma concentração final de 20.000 células por 10 microlitros. Placa uma gota de três microlitros das células ressuspensas por poço de uma placa preta opaca de 96 poços.
Incubar a placa em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius por 15 minutos. Finalmente, adicione 100 microlitros de meios organoides avançados pré-aquecidos a cada poço antes de incubar a placa a 37 graus Celsius por 24 a 72 horas. Realizar o tratamento medicamentoso dos organoides dois dias após o plaqueamento.
Realizar ensaio de viabilidade nos organoides sete dias após o tratamento medicamentoso. Adicione 100 microlitros de reagente de ensaio de viabilidade a cada poço, elevando o volume total para 200 microlitros, e agite a placa a 80 RPM por cinco minutos. Em seguida, deixe a placa incubar à temperatura ambiente por mais 25 minutos.
Enquanto isso, ligue o leitor de placas de bioluminescência e abra o software de controle ocular. Navegue para se conectar ao instrumento"e selecione Infinite 200Pro"Select luminescence"and default script"Next no menu suspenso, escolha BD 96 FB Falcon BD Falcon 96 Flat Black"como o tipo de placa para definir os parâmetros de luminescência. Atribua atenuação como nenhuma.
Tempo de integração como 1000 milissegundos e tempo de liquidação como zero milissegundos. Finalmente, descubra a placa, carregue-a no leitor de placas e pressione start"para começar. Imagens de campo claro foram adquiridas para os dois diferentes organoides derivados do paciente, ou PDOs, usados no protocolo.
DOP um, derivado de biópsia tumoral e DOP dois, derivado de ascite. Os resultados do ensaio de viabilidade revelaram a porcentagem de células vivas na DOP um e DOP dois após ambos terem sido tratados com concentrações variáveis de carboplatina. A taxa de crescimento calculada, ou valores de RG, foram plotados contra as concentrações de carboplatina correspondentes, e as métricas de RG revelaram que o valor de GR50 para DOP um foi muito maior do que para DOP dois.
Isso indicou que a DOP era mais resistente à quimioterapia com platina Durante o revestimento, é crucial que a gota de três microlitros da suspensão celular seja colocada diretamente no centro do poço. Se a gotícula for colocada perto da borda do poço, pode causar o colapso da gota, afetando os resultados do ensaio.
