Bu araştırma, RSA, JMB ve AA'ya PID2019-105128RB-I00 hibe numarası ve PFS ve RML'ye PGC2018-095795-B-I00 hibe numarası ile finanse edilmiş, her ikisi de MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ve hibe numaraları B31_20R (RSA, JMA ve AA) ve E35_17R (PFS ve RML) tarafından finanse edilmiş ve Gobierno de Aragón tarafından finanse edilmiştir. RSA'nın çalışmaları, Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE'den bir hibe ile desteklendi. Yazarlar, Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza'nın kullanımını kabul etmek ister.

NOT: Tüm kültür ortamları ve tampon bileşimleri Tablo 1'de belirtilmiştir. Sibrid üretiminden önce, hücre hatları arasındaki her iki genomda genetik farklılıkların varlığını doğrulamak için donör ve alıcı hücrelerden hem mitokondriyal hem de nükleer DNA profilleri yazılmalıdır. Bu çalışmada, ticari olarak temin edilebilen bir L929 hücre hattı ve laboratuvarımızda kendiliğinden oluşan türetilmiş hücre hattı L929dt kullanılmıştır (daha fazla bilgi içinbkz. 13 ). Bu hücre hatları, mt-Nd2 genlerinin dizisinde, sibridizasyon işlemi tamamlandıktan sonra mtDNA'nın saflığını doğrulamak için kullanılabilecek iki farklılık gösterir13. Bu durumda, nükleer arka planın saflığı antibiyotik duyarlılığı ile doğrulandı, çünkü L929dt hücrelerinin aksine, L929 genetisine dirençliydi.
1. Rodamin 6G tedavisi ile mitokondriyal tükenme (alıcı hücreler)
NOT: Başarılı cybrid üretimi için ilk adım, alıcı hücrelerdeki mitokondriyal fonksiyonları tamamen ve geri dönüşümsüz olarak ortadan kaldırmaktır. Bu amaçla, her hücre hattı için rodamin 6G ile uygun konsantrasyon ve tedavi süresinin önceden belirlenmesi gerekmektedir. Bu yeterli konsantrasyon, ilaca bağlı hücre ölümünün hemen altında olmalıdır (tedavi sırasında hücreleri öldürmeyen en yüksek seviye). En uygun koşullar tanımlandıktan sonra aşağıdakileri gerçekleştirin.
<ol><li>Tohum 10 6 hücreyi6 delikli bir plakada tam kültür ortamı kullanarak (ayrıntılar için Tablo 1'e bakın) ve hücre hattına bağlı olarak 3-10 gün boyunca 3-10 gün boyunca optimum rodamin 6G konsantrasyonu ile günlük olarak muamele edin. Geleneksel konsantrasyonlar 3-10 gün boyunca 2 ila 5 μg / mL arasında değişir20,21. Bu çalışmada, L929 türevi hücreler için, 7 gün boyunca 2.5 μg / mL rhodamine 6G, seçilen tedavi13,22 idi.</li>
	<li>Hücreleri canlı tutmak için, hücre kültürü ortamını 50 μg / mL idrar ve 100 μg / mL piruvat ile destekleyin ve her 24 saatte bir yenileyin.</li>
	<li>Tedaviden sonra ve füzyondan önce, rhodamine 6G ile muamele edilmiş hücrelerin ortamını, rhodamine 6G olmadan hücre kültürü ortamını tamamlamak için değiştirin ve bunları% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde 3-4 saat boyunca bu ortamda bırakın. NOT: Rodamin 6G toksik etkisi geri dönüşümsüzdür ve fonksiyonel olmayan mitokondrili hücreler20'yi geri kazanmamalıdır. Bu nedenle, tedaviden sonra, fonksiyonel mitokondri almayan hücreler, idrar takviyeli kültür ortamında bile ölmelidir. Bu nedenle, nükleer seleksiyon gerekli olmamalıdır. Bununla birlikte, mitokondri olmadan rodamin 6G ile tedavi edilen hücrelerin kontrol füzyonu önerilir.</li>
</ol>2. Genleşme ve mitokondriyal izolasyon (donör hücreler)
<ol><li>Yaklaşık 25 x 106 hücre elde etmek için rodamin 6G tedavisinin zaman atlaması sırasında mitokondri donör hücrelerini genişletin.</li>
	<li>7. günde, 50 mL'lik bir tüpte katlanarak büyüyen hücreleri hasat edin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüjleme yoluyla toplayın. Hücreleri soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile 3 kat yıkayın ve RT'de 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüjleme ile çökeltin. Şu andan itibaren, soğuk reaktifler kullanarak ve tüpleri buz üzerinde hücreler veya mitokondri ile tutarak mitokondriyal ekstraksiyonun tüm adımlarını 4 ° C'de gerçekleştirin.</li>
	<li>Üçüncü santrifüjlemeden sonra, bir vakum pompasına bağlı bir cam pipet kullanarak süpernatantı aspirasyon yoluyla atın ve paketlenmiş hücreleri, hücre pelet hacminin 7 katına eşit bir hipotonik tampon hacminde yeniden askıya alın. Ardından, hücre süspansiyonunu bir homojenizatör tüpüne aktarın ve hücrelerin 2 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek şişmesine izin verin.</li>
	<li>600 rpm'de dönen motor tahrikli bir havaneyle bağlı homojenizatörde 8 ila 10 strok gerçekleştirerek hücre zarlarını kırın. NOT: Hücre zarı bozulmasının adımı hücre tipleri arasında değişebilir; Bu nedenle, her hücre tipi için optimize edilmelidir.</li>
	<li>İzotonik bir ortam oluşturmak için hücre süspansiyonuna aynı hacimde hipertonik tampon ekleyin (hücre pelet hacminin 7 katı).</li>
	<li>Homojenatı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'de sabit bir rotorda santrifüj edin. Daha sonra, çekirdeklerle veya sağlam hücrelerle kontaminasyonu önlemek için peletten büyük bir marj bırakarak süpernatantın sadece 3 / 4'ünü toplayın ve başka bir tüpe aktarın. Aynı işlemi iki kez tekrarlayın. Süpernatantın tutulması ve peletin atılması gerektiğini unutmayın.</li>
	<li>Mitokondriyal fraksiyonu (süpernatan) kaydedin. 1,5 mL tüplere aktarın ve 4 ° C'de 2 dakika boyunca maksimum hızda (18.000 x g) santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve mitokondri ile zenginleştirilmiş peleti tampon A ile yıkayın, iki tüpün içeriğini bir araya getirin ve adım 2.7'de tarif edildiği gibi aynı koşullarda santrifüj yapın. Tüm malzeme sadece bir tüpte olana kadar aynı işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>300 μL tampon A ile ek bir yıkama yapın ve Bradford tahlili23'ü kullanarak mitokondriyal protein konsantrasyonunu ölçün. Her bir sibridizasyon testi için, transfer prosedürü için en uygun mitokondri miktarı belirlenmelidir (bizim durumumuzda, 106 hücre başına 10-40 μg mitokondriyal protein arasında bir konsantrasyon).</li>
	<li>Aynı zamanda, rhodamine 6G ile önceden işlenmiş hücreleri, 15 mL'lik bir tüpte toplayarak ve RT'de 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüj yaparak füzyon için hazırlayın.</li>
	<li>Hem reseptör hücrelerde mitokondriyal fonksiyonun ortadan kaldırılmasının hem de donörlerden organel saflaştırmasının uygun şekilde gerçekleştirildiğinden emin olmak için, az sayıda rodamin 6G ile muamele edilmiş hücreleri ve izole edilmiş mitokondrileri, 6 kuyucuklu bir plakada tam kültür ortamını kullanarak tohumlayın ve kuyucukların hiçbirinde hayatta kalan hücrelerin kalmadığını kontrol etmek için bir ay boyunca kültürleyin (Şekil 2).</li>
	<li>Buna paralel olarak, mitokondriyal fraksiyondaki çekirdek kirleticilerinin yokluğunu, nükleer proteinlerin (yani, lamin beta, histon H3, vb.) immünotespiti veya bir nükleer genin kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) amplifikasyonu (yani, SDH, 18S rRNA, vb.) NOT: Kontaminasyonları önlemek için, laminer akış davlumbaz altında çalışan aseptik koşullarda tüm adımların gerçekleştirilmesi önerilir.</li>
</ol>3. Füzyon ve cybrid üretimi
<ol><li>Füzyona devam etmek için, izole mitokondri pelletine (10-40 μg mitokondriyal protein) rhodamine 6G ile muamele edilmiş hücrelerin 106'sını dikkatlice ekleyin ve hücrelerin mitokondri ile karışmasına izin vermek için 5 dakika boyunca 520 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>100 μL polietilen glikol (PEG,% 50) ekleyin ve peleti 30 s boyunca hafifçe askıya alın. Ardından, 30 saniye daha el değmeden dinlenmeye bırakın.</li>
	<li>Son olarak, karışımı taze tam hücre kültürü ortamına sahip 6 delikli bir plakaya aktarın ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübatöre yerleştirin. Birkaç gün sonra (genellikle 1 hafta), transmitokondriyal sibritler büyümeye başlamalıdır (Şekil 2), bu da analizlerinden önce ayrı ayrı seçilebilen veya bir havuzda karıştırılabilen klonlara yol açmalıdır.</li>
</ol>4. Hem mitokondriyal hem de nükleer arka planın doğrulanması
NOT: Yeni hücre hattı kurulduktan ve hücreler katlanarak büyümeye başladıktan sonra, mitokondriyal ve nükleer DNA'larının saflığı doğrulanmalıdır. Bu nedenle, orijinal hücre hatları, tanınabilir hale getirmek için genomlarında farklı mutasyonlar veya polimorfizmler barındırmalıdır.
<ol><li>Toplam DNA izolasyonu<ol><li>Ticari bir genomik DNA ekstraksiyon kiti kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız) veya fenol-kloroform-izoamil alkol ekstraksiyonu ve alkol çökeltme24 kullanarak standart bir protokol uygulayarak cybrid üretimi için kullanılan tüm hücre hatlarının genomik DNA'sını izole edin.</li>
	</ol></li>
	<li>mtDNA değerlendirmesi (Şekil 3) NOT: mtDNA'nın saflığını analiz etmek için dizileme, kısıtlama parça uzunluğu polimorfizmi (RFLP) analizi veya alele özgü qPCR gibi çeşitli teknikler gerçekleştirilebilir. RFLP tarafından mtDNA dizi varyasyonlarının varlığını doğrulamak için, sonraki protokol adımlarını izleyin.<ol><li>PCR ile nükleotid değişimini içeren bir mtDNA fragmanını güçlendirin.<ol><li>Burada, L929dt hücreleri, L929 hücrelerinde bulunmayan bir mt-Nd2 geni (m.4206C>T) içinde, 4206 pozisyonunda bir mtDNA mutasyonu sunar. İletimkokondriyal sibritlerde bu ikamenin varlığını doğrulamak için, standart bir protokol ve aşağıdaki primerleri kullanarak PCR ile 397 bp'lik bir parçayı yükseltin: 1) 5'-AAGCTATCGGG CCCATACCCCG-3' (3862-3884 pozisyonları) ve 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGGGCG -3' (4236-4258 pozisyonları).</li>
		</ol></li>
		<li>İstenilen nükleotid ikamesinin RFLP ile varlığını, dizi değişimini tanıyan ve her iki hücre çizgisi için farklı bir kesim paterni oluşturan spesifik bir endonükleaz kullanarak analiz edin. NOT: L929dt mtDNA varyantı mevcut olduğunda (4206T), adım 4.2.1'de elde edilen amplikon, 306 bp, 52 bp ve 39 bp'lik üç DNA parçası üreten SspI için iki kısıtlama bölgesi içerir (bkz. 52 ve 39 bantlarını oluşturan kısıtlama sitesi, vahşi tip (WT) sürüm C4206 mevcut olduğunda ve 91 bp'lik yeni bir bant göründüğünde bozulur. Bu nedenle, SspI için tam sindirim için bir iç kontrol analize dahil edilmiştir. Sindirim reaksiyonu, üreticinin talimatlarını izleyerek 37 ° C'de gerçekleştirilir.</li>
		<li>Kısıtlama parçalarını elektroforez ile ayırın ve bant desenini karşılaştırın.<ol><li>Sindirim yapıldıktan sonra, elde edilen kısıtlama parçalarını% 10 poliakrilamid-Tris-borat-EDTA (TBE) jellerinde elektroforez ile analiz edin (1x TBE bileşimi için Tablo 1'e bakınız). RT'de 15 dakika boyunca 1x TBE'de bir ethidyum bromür çözeltisinde jel boyamadan sonra DNA fragmanlarını görselleştirin (jel boyama çözeltisi bileşimi için Tablo 1'e bakınız).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Nükleer DNA genotiplemesi NOT: Nükleer DNA genotiplemesi, RFLP analizi için kullanılan önceki DNA ekstraksiyon örneği kullanılarak yapılmalıdır.<ol><li>Ticariye özgü oligonükleotidlerden oluşan bir havuz kullanarak 16 lokusu (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 ve AMEL) güçlendirin (bkz.</li>
		<li>Daha önce elde edilen parçaları ayırmak için genetik bir analizör kullanarak elektroforez yapın. NOT: Güçlendirildikten sonra, farklı lokuslar kapiler bir sistem kullanılarak elektroforez ile analiz edilir (bakınız Malzeme Tablosu). Parçalar, ticari bir polimerle doldurulmuş 50 cm uzunluğunda bir kapiler içinde ayrılır. Katot ve anot tamponları, Malzeme Tablosunda gösterildiği gibi ticari olarak da temin edilebilir. Elektroforez 19.5 kV'de 60 °C'de 20 dakika süreyle uygulanır.</li>
		<li>Her bir güçlendirilmiş lokusa karşılık gelen alelleri belirlemek için biyoinformatik araçlar kullanın (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Nükleer DNA profilinin mitokondri reseptör hücre hattı profili ile eşleşip eşleşmediğini kontrol etmek için adım 4.3.3'te elde edilen verileri nükleer DNA profili veritabanı (Tablo 1) ile karşılaştırın (Şekil 4).</li>
	</ol></li>
</ol>

Süspansiyon Büyüten Kanser Hücrelerinden İletim Cybrid Üretimi

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Otto Warburg, kanser hücrelerinin metabolizmalarını değiştirdiğini ve mitokondriyal solunumu azaltırken "aerobik glikoliz"i3,4 güçlendirdiğini bildirdiğinden, mitokondrinin kanser dönüşümü ve ilerlemesindeki rolüne olan ilgi katlanarak artmıştır. Son yıllarda, mtDNA'daki mutasyonlar ve mitokondriyal disfonksiyon, birçok kanser tipi25'in ayırt edici özellikleri olarak kabul edilmiştir. Bugüne kadar, çok sayıda ç...

Enerji metabolizmasının yeniden programlanması, 1930'larda Otto Warburg tarafından ilk kez gözlemlenen kanser1'in ayırt edici bir özelliğidir2. Aerobik koşullar altında, normal hücreler glikozu piruvat'a dönüştürür, bu da asetil-coA üretir, mitokondriyal makineyi besler ve hücresel solunumu teşvik eder. Bununla birlikte, Warburg, normoksik koşullar altında bile, çoğu kanser hücresinin glikoliz işleminden elde edilen piruvatı laktata dönüştürdüğünü ve enerji elde etme yollarını değiştirdiğini göstermiştir. Bu metabolik ayarlama "Warburg etkisi" olarak bilinir ve bazı kanser hücrelerinin, ATP'yi aerobik süreçten daha az verimli bir şekilde üretmesine rağmen, hızlı büyüme ve bölünme için enerjik taleplerini karşılamalarını sağlar 3,4,5. Son yıllarda, çok sayıda çalışma, kanser progresyonunda metabolizmanın yeniden programlanmasının anlamını desteklemiştir. Bu nedenle, tümör enerjileri kansere karşı ilginç bir hedef olarak kabul edilir1. Enerjik metabolizmada ve temel öncüllerin tedarikinde merkezi bir merkez olarak, mitokondri, bugüne kadar sadece kısmen anladığımız bu hücre adaptasyonlarında kilit bir rol oynamaktadır.
Yukarıdakilere paralel olarak, mitokondriyal DNA (mtDNA) mutasyonları, bu metabolik yeniden programlamanın olası nedenlerinden biri olarak önerilmiştir; bu, bozulmuş bir elektron taşıma zinciri (ETC) performansına yol açabilir 6 ve bazı kanser hücrelerinin hayatta kalmak için neden glikolitik metabolizmalarını geliştirdiğini açıklayacaktır. Gerçekten de, mtDNA'nın kanser hücrelerinde mutasyonlar biriktirdiği, tümörlerin en az% 50'sinde mevcut olduğu bildirilmiştir7. Örneğin, Yuan ve ark. tarafından yürütülen yeni bir çalışma, böbrek, kolorektal ve tiroid kanserlerinde hipermutasyona uğramış ve kesilmiş mtDNA moleküllerinin varlığını bildirmiştir8. Dahası, birçok çalışma, bazı mtDNA mutasyonlarının daha agresif bir tümör fenotipi ve kanser hücrelerinin metastatik potansiyelindeki bir artışla ilişkili olduğunu göstermiştir 9,10,11,12,13,14,15,16.
Mitokondriyal genomun kanser progresyonundaki belirgin ilgisine rağmen, bu mutasyonların incelenmesi ve hastalığa katkıları, şu anda mevcut olan deneysel modellerdeki ve teknolojilerdeki sınırlamalar nedeniyle zor olmuştur17. Bu nedenle, mitokondri DNA'sının kanser hastalığının gelişimi ve ilerlemesindeki gerçek etkisini anlamak için yeni tekniklere ihtiyaç vardır. Bu çalışmada, geleneksel sibridizasyon yöntemlerinin ana zorluklarının üstesinden gelen, izole mitokondri ile rodamin 6G ile önceden işlenmiş hücrelerin yeniden popülasyonuna dayanan, süspansiyon büyüyen kanser hücrelerinden transmitokondriyal sibrid üretimi için bir protokol sunuyoruz18,19. Bu metodoloji, karşılık gelen ρ0 hücre hattının mevcudiyetine bakılmaksızın herhangi bir çekirdek donörünün kullanılmasına ve geleneksel teknikleri izleyerek enükleasyonu zor olan hücrelerden mitokondri transferine (yani, yapışkan olmayan hücre hatları) izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3500XL Genetic Analyzer&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4406016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>08-772-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AmpFlSTR Identifiler Plus PCR Amplification Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4427368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anode Buffer Container 3500 Series</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4393927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>5000002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cathode Buffer Container 3500 Series</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4408256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>131026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium Bromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E8751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer Teflon pestle</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>196102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L929 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniProtean Tetra4 Gel System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Custom products</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyacrylamide Solution 30%</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>A3626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POP-7</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4393714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAmp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine-6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R4127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serum Fetal Bovine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SspI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin/penicillin</td>
			<td>PAN biotech</td>
			<td>P06-07100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>PanReac</td>
			<td>P14030b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U3750</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transmitochondrial cybrid generation using cancer cell lines

Son yıllarda, mitokondri ve kanser arasındaki bağlantıyı tespit etmeye adanmış çalışmaların sayısı önemli ölçüde artmıştır. Bununla birlikte, mitokondri ve tümörigenezdeki değişiklikleri içeren bağlantıyı tam olarak anlamak ve tümörle ilişkili mitokondriyal fenotipleri tanımlamak için daha fazla çabaya ihtiyaç vardır. Örneğin, mitokondrinin tümörigenez ve metastaz süreçlerine katkısını değerlendirmek için, mitokondrinin farklı nükleer ortamlardaki tümör hücrelerinden etkisini anlamak önemlidir. Bu amaçla, olası bir yaklaşım, sözde cybrid hücrelerini elde etmek için mitokondrinin farklı bir nükleer arka plana aktarılmasından oluşur. Geleneksel sibridizasyon tekniklerinde, mtDNA'dan (ρ0, nükleer donör hücre) yoksun bir hücre hattı, enüklee hücrelerden veya trombositlerden türetilen mitokondri ile yeniden doldurulur. Bununla birlikte, enükleasyon işlemi, invaziv hücrelerde birçok durumda kısmen veya tamamen kaybolan bir özellik olan kültür plakasına iyi hücre yapışmasını gerektirir. Ek olarak, geleneksel yöntemlerde bulunan bir diğer zorluk, saf nükleer ve mitokondriyal DNA arka planları elde etmek için endojen mtDNA'nın mitokondriyal alıcı hücre hattından tamamen çıkarılmasını sağlamak ve üretilen sibritte iki farklı mtDNA türünün varlığından kaçınmaktır. Bu çalışmada, izole mitokondri ile rodamin 6G ile önceden işlenmiş hücrelerin yeniden popülasyonuna dayanan süspansiyon büyüyen kanser hücrelerine uygulanan bir mitokondriyal değişim protokolü sunuyoruz. Bu metodoloji, geleneksel yaklaşımların sınırlamalarının üstesinden gelmemizi sağlar ve böylece kanser ilerlemesi ve metastazındaki mitokondriyal rolün anlaşılmasını genişletmek için bir araç olarak kullanılabilir.

Reprogramming energy metabolism is a hallmark of cancer1 that was observed for the first time by Otto Warburg in the 1930s2. Under aerobic conditions, normal cells convert glucose into pyruvate, that then generates acetyl-coA, fuelling the mitochondrial machinery and promoting cellular respiration. Nevertheless, Warburg demonstrated that, even under normoxic conditions, most cancer cells convert pyruvate obtained from the glycolysis process into lactate, shifting their way to obtain energy. This metabolic adjustment is known as the &#34;Warburg effect&#34; and enables some cancer cells to supply their energetic demands for rapid growth and division, despite generating ATP less efficiently than the aerobic process3,4,5. In recent decades, numerous works have supported the implication of metabolism reprogramming in cancer progression. Hence, tumor energetics is considered an interesting target against cancer1. As a central hub in energetic metabolism and in the supply of essential precursors, mitochondria play a key role in these cell adaptations that, to date, we only partially understand.
In line with the above, mitochondrial DNA (mtDNA) mutations have been proposed as one of the possible causes of this metabolic reprogramming, which could lead to an impaired electron transport chain (ETC) performance6 and would explain why some cancer cells enhance their glycolytic metabolism to survive. Indeed, it has been reported that mtDNA accumulates mutations within cancer cells, being present in at least 50% of tumors7. For example, a recent study carried out by Yuan et al. reported the presence of hypermutated and truncated mtDNA molecules in kidney, colorectal, and thyroid cancers8.&#160;Moreover, many works have demonstrated that certain mtDNA mutations are associated with a more aggressive tumor phenotype and with an increase in the metastatic potential of cancer cells9,10,11,12,13,14,15,16.
Despite the apparent relevance of the mitochondrial genome in cancer progression, the study of these mutations and their contribution to the disease have been challenging due to limitations in the experimental models and technologies currently available17. Thus, new techniques to understand the real impact of mitochondria DNA in cancer disease development and progression are needed. In this work, we introduce a protocol for transmitochondrial cybrid generation from suspension-growing cancer cells, based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria, that overcomes the main challenges of traditional cybridization methods18,19. This methodology allows the use of any nuclei donor regardless of the availability of their corresponding &#961;0 cell line and the transfer of mitochondria from cells that, following the traditional techniques, would be difficult to enucleate (i.e., non-adherent cell lines).

Yazar Spotlight: Kanser Hücre Hatlarını Kullanarak İletim Cybrid Üretimi  

Kanser Hücre Hatlarını Kullanarak İletimkokondriyal Cybrid Üretimi

This research aims to better understand the contribution of mitochondrion in cancer progression and metastasis. The transmitochondrial cybrid generation can help us to elucidate how and at what level mitochondrial genotypes are involved in the aggressiveness of a tumor cell. One of the technologies to obtain information on mitochondrial role in cancer is cybrid generation.We combine this tool with a variety of other methods that include donative electrophoresis, respiration analysis and other mitochondrial functional assays, flow cytometry, proteomics, et cetera. The plasticity of cancer cells together with the interaction networks between nuclear and mitochondrial genes, increases the complexity of our experiments and data interpretation. This is one of the reasons why is necessary to develop a new experimental approaches.One of the most exciting findings from our research has been the discovery of two mitochondrial DNA mutations associated with detachment of cells from the play dish resembling metastasis generation and making the cells completely dependent on aerobic glycolysis, and also making them more tumorigenic and metastatic in in vivo models. This mitochondria exchange protocol can be applied to suspension growing cancer cells. The chronology can overcome the limitations of traditional approaches where the nucleation process and the complete removal of mitochondrial DNA from mitochondrial recipient cell lines often become a real challenge.

Yukarıda sunulan protokolü izledikten sonra, korunmuş bir nükleer arka plana sahip, ancak yeni bir mitokondri genotipine sahip bir homoplazmik cybrid hücre hattı, Şekil 1 ve Şekil 2'deki şemalarda gösterildiği gibi elde edilmelidir. Sibritlerde bulunan mitokondriyal ve nükleer DNA'nın saflığı, Şekil 3'te gösterildiği gibi RFLP ve Şekil 4'te gösterildiği gibi nükleer DNA genotiplem...

Watch this Scientific Journal Video about Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines at JoVE.com

Bu protokol, süspansiyon büyüyen kanser hücrelerinden cybrid üretimi için bir tekniği, mitokondrinin tümörojenik süreçteki rolünü incelemek için bir araç olarak tanımlamaktadır.

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Bu araştırma, mitokondriyonun kanser progresyonu ve metastazındaki katkısını daha iyi anlamayı amaçlamaktadır. İletimkokondriyal sibrid üretimi, mitokondriyal genotiplerin bir tümör hücresinin agresifliğine nasıl ve hangi seviyede dahil olduğunu aydınlatmamıza yardımcı olabilir. Kanserde mitokondriyal rol hakkında bilgi edinen teknolojilerden biri de sibrid üretimidir.Bu aracı, donatif elektroforez, solunum analizi ve diğer mitokondriyal fonksiyonel tahliller, akış sitometrisi, proteomikler vb. İçeren çeşitli diğer yöntemlerle birleştiriyoruz. Kanser hücrelerinin plastisitesi, nükleer ve mitokondriyal genler arasındaki etkileşim ağları ile birlikte, deneylerimizin ve veri yorumlamamızın karmaşıklığını arttırmaktadır. Yeni deneysel yaklaşımlar geliştirmek için gerekli olan nedenlerden biri de budur.Araştırmamızın en heyecan verici bulgularından biri, metastaz oluşumuna benzeyen ve hücreleri tamamen aerobik glikolize bağımlı hale getiren ve aynı zamanda in vivo modellerde daha tümörojenik ve metastatik hale getiren hücrelerin oyun çanağından ayrılmasıyla ilişkili iki mitokondriyal DNA mutasyonunun keşfi olmuştur. Bu mitokondri değişim protokolü, büyüyen kanser hücrelerinin askıya alınmasına uygulanabilir. Kronoloji, çekirdeklenme sürecinin ve mitokondriyal DNA'nın mitokondriyal alıcı hücre hatlarından tamamen çıkarılmasının sıklıkla gerçek bir zorluk haline geldiği geleneksel yaklaşımların sınırlamalarının üstesinden gelebilir.

transmitochondrial-cybrid-generation-using-cancer-cell-lines

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

1.6K Görüntüleme.  University of Zaragoza. Bu araştırma, mitokondriyonun kanser progresyonu ve metastazındaki katkısını daha iyi anlamayı amaçlamaktadır. İletimkokondriyal sibrid üretimi, mitokondriyal genotiplerin bir tümör hücresinin agresifliğine nasıl ve hangi seviyede dahil olduğunu aydınlatmamıza yardımcı olabilir. Kanserde mitokondriyal rol hakkında bilgi edinen teknolojilerden biri de sibrid üretimidir.Bu aracı, donatif elektroforez, solunum analizi ve diğer mitokondriyal fonksiyonel tahliller, ...

Video: Yazar Spotlight: Kanser Hücre Hatlarını Kullanarak İletim Cybrid Üretimi  

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more efforts are still needed to fully understand the link involving alterations in mitochondria and tumorigenesis, as well as to identify tumor-associated mitochondrial phenotypes. For instance, to evaluate the contribution of mitochondria in tumorigenesis and metastasis processes, it is essential to understand the influence of mitochondria from tumor cells in different nuclear environments. For this purpose, one possible approach consists of transferring mitochondria into a different nuclear background to obtain the so-called cybrid cells. In the traditional cybridization techniques, a cell line lacking mtDNA (&#961;0, nuclear donor cell) is repopulated with mitochondria derived from either enucleated cells or platelets. However, the enucleation process requires good cell adhesion to the culture plate, a feature that is partially or completely lost in many cases in invasive cells. In addition, another difficulty found in the traditional methods is achieving complete removal of the endogenous mtDNA from the mitochondrial-recipient cell line to obtain pure nuclear and mitochondrial DNA backgrounds, avoiding the presence of two different mtDNA species in the generated cybrid. In this work, we present a mitochondrial exchange protocol applied to suspension-growing cancer cells based on the repopulation of rhodamine 6G-pretreated cells with isolated mitochondria. This methodology allows us to overcome the limitations of the traditional approaches, and thus can be used as a tool to expand the comprehension of the mitochondrial role in cancer progression and metastasis.

This protocol describes a technique for cybrid generation from suspension-growing cancer cells as a tool to study the role of mitochondria in the tumorigenic process.

Kanser Araştırmaları

Mitochondrial Depletion by Rhodamine 6G for Transmitochondrial Cybrid Generation

To perform mitochondrial depletion of the mitochondrial recipient cell line, seed 1 million cells in a six-well plate using complete culture medium containing 10%FBS and Penicillin-Streptomycin. Treat the cells daily with the optimal concentration of Rhodamine 6G for three to seven days, depending on the type of cell line. To keep the cells alive, supplement the cell culture medium with 50 micrograms per milliliter of uridine and 100 micrograms per milliliter of pyruvate.After treatment and prior to fusion with a mitochondria isolated from the donor cell line, remove the medium of Rhodamine 6G treated cells and add complete cell culture medium without Rhodamine 6G. Incubate the cells at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for three to four hours. Finally, to prepare the Rhodamine 6G pretreated cells for the fusion, collect them in a 15-milliliter tube, and centrifuge the tube at room temperature and 520G for five minutes.Note that the pellet acquires a neon pink color due to Rhodamine 6G treatment.

Transmitochondrial Cybrid Üretimi için Rhodamine 6G ile Mitokondriyal Tükenme

Mitochondrial Isolation for Transmitochondrial Cybrid Generation

Once around 25 million mitochondria donor cells are obtained on day seven, harvest the exponentially grown cells in a 50-milliliter tube and collect them by centrifuging at room temperature and 520g for five minutes. Wash the cells with cold phosphate-buffered saline and sediment them by centrifugation at room temperature in 520g for five minutes. Now onwards, perform the whole mitochondrial extraction at four degrees Celsius using cold reagents and keep the cells or mitochondria on ice.After the third centrifugation, discard the supernatant by aspiration using a glass pipette coupled to a vacuum pump and resuspend the packed cells in a volume of hypotonic buffer equal to seven times the cell pellet volume. Then transfer the cell suspension into a homogenizer tube and let the cells swell by incubating them on ice for two minutes. Break the cell membranes by performing 8 to 10 strokes in the homogenizer coupled to a motor-driven pestle rotating at 600 rotations per minute.Into the cell homogenate, add the hypotonic buffer equal to seven times the volume of the initial pellet to generate an isotonic environment. Transfer the homogenate into a 15-milliliter tube and centrifuge it in a fixed rotor at 1, 000g and four degrees Celsius for five minutes. Then collect only 3/4 of the supernatant, leaving a large margin from the pellet to avoid contamination with nuclei or intact cells and transfer it to another tube.After repeating the process twice, transfer the supernatant containing the mitochondrial fraction into 1.5-milliliter tubes. Centrifuge the tubes at the maximum speed of 18, 000g for two minutes at four degrees Celsius. Discard the supernatant and wash the mitochondria-enriched pellet with buffer A.Combine the content of the two tubes into one and centrifuge as demonstrated before.Repeat the process until all the material is in only one tube. Wash the pellet obtained from the last centrifugation using 300 microliters of buffer A.Quantify the mitochondrial protein concentration using the Bradford assay. Before fusion with the mitochondrial recipient cell line, evaluate the absence of nuclei contaminants in the mitochondrial fraction by immunodetection of nuclear proteins.Alternatively perform quantitative polymerase chain reaction or QPCR amplification of a nuclear gene.

İletimsel Cybrid Üretimi için Mitokondriyal İzolasyon

Fusion and Transmitochondrial Cybrid Generation

For transmitochondrial cybrid generation, use the mitochondrial recipient cells that have been depleted to mitochondria by Rhodamine 6G treatment, and perform fusion with mitochondria isolated from the mitochondria donor cells. Ensure proper mitochondrial function abolishment in recipient cells and organelle purification from donor cells by seeding a small number of Rhodamine 6G-treated cells and isolated mitochondria in complete culture medium in a six-well plate. Check for no surviving cells remaining in the wells after one month of culture.To proceed with the fusion, carefully add the Rhodamine 6G-treated cells to the isolated mitochondria pellet. Then centrifuge at 520g for five minutes to allow the cells to mix with the mitochondria. Add 100 microliters of 50%polyethylene glycol and gently resuspend the pellet for 30 seconds Then allow the suspension to rest untouched for another 30 seconds.Finally, transfer the mix into a six-well plate with fresh complete cell culture medium, and place it in the incubator at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide. Usually, after about one week, transmitochondrial cybrids should start growing, giving rise to clones that can be individually selected or mixed in a pool prior to their analysis. The restriction fragments obtained from the restriction fragment length polymorphism, or RFLP, analysis of wild-type mitochondria differed from the mutant one.The RFLP analysis of the new transmitochondrial cell lines indicated that restriction fragments were identical to those obtained in their respective mitochondrial donors and different from those generated with the recipient cell lines. Further, the difference in a typical DNA nuclear genotyping profile of the two cell lines used in the hybridization process could also be used to confirm nuclear DNA purity.