Siber üretim, herhangi bir yeni mitokondriyal DNA mutasyonunun patojenik rolünü anlamak ve atriplazmi yüzdesini hastalığın ciddiyeti ile ilişkilendirmek için hala en gelişmiş protokoldür. Bu teknik, hastanın nükleer arka planının katkısının bulunmadığı homojen bir nükleer sistemde biyokimyasal araştırma yapılmasına izin verir. Bu teknik, mitokondriyal DNA'nın bir mutasyonunun patojenitesinin doğrulanmasına izin verir.
ve biyokimyasal düzeyde etkisini incelemeyi mümkün kılar Fibroblastları içeren 35 milimetrelik bulaşıkları kalsiyum ve magnezyum olmadan iki mililitre 1X PBS kullanarak iki kez yıkayın. Bulaşıkların dış yüzeyini% 70 etanol ile temizleyin ve alkol buharlaşana kadar bekleyin. Kapakları bulaşıklardan ve vidalı kapakları şişelerden çıkarın.
Her kabı kapağı baş aşağı olacak şekilde her 250 mililitrelik santrifüj şişesinin altına yerleştirin. Her şişeye yavaşça 32 mililitre çekirdeklenme ortamı ekleyin, böylece ortamın yemeğe girmesine ve hücrelerle temas etmesine izin verin. Uzun bir cam mera pipeti kullanarak bulaşıklardaki kabarcıkları çıkarın ve ucu bir bunsen alevinde kıvırın.
Her şişeyi vidalı kapakla kapatın ve santrifüje aktarın. 37 santigrat derecede 20 dakika santrifüj yapın ve 8.000 x G.Ortamı şişelerden aspire edin ve atın. Şişeleri daha önce% 70 etanol ile püskürtülen steril bir gazlı bez üzerinde ters çevirerek bulaşıkları çıkarın.
Bulaşıkların dış yüzeyini ve kapaklarını% 70 etanol ile temizleyin ve etanol buharlaştıktan sonra bulaşıkları kapatın. Devam etmeden önce, canlı hücreler için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak sitoplast oluşumunu kontrol edin. Sitokalasin tarafından indüklenen çekirdeklerinin ekstrüzyonu nedeniyle aşırı derecede uzatılmış fibroblastları arayın.
Her 35 milimetrelik çanağa 1.000, 143 satır sıfır hücre ekleyin. % 5 FBS ile desteklenmiş iki mililitre kültür ortamında yeniden askıya alınır. 143 sıra sıfır hücreyi hayaletlerin üzerine yerleştirmek için bulaşıkları nemlendirilmiş bir karbondioksit inkübatöründe üç saat bekletin.
Üç saatlik inkübasyondan sonra, ortamı aspire edin ve atın. Aderans hücrelerini serum veya MEM olmadan iki mililitre DMEM yüksek glikoz ortamı ile iki kez yıkayın, ardından ortamı aspire edin ve atın. Hücrelere 500 mikrolitre polietilen glikol çözeltisi ekleyin ve tam olarak bir dakika inkübe edin.
Polietilen glikol çözeltisini aspire edin ve atın. Hücreleri üç kez iki mililitre DMEM yüksek glikoz ile serumsuz veya MEM ile yıkayın. İki mililitre füzyon ortamı ekleyin ve% 5 karbondioksit ile inkübatörde 37 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin.
Kalan kültür tabaklarındaki hücreleri tripsinize edin Onları sayın ve bir veya daha fazla Petri kabına tohumlayın Klonlar ortaya çıkana kadar takviyeli kültürde çanak başına 50 ila 100 hücre ekleyin. Sonra birkaç gün büyümelerine izin verin. Bir stereo mikroskop kullanarak, klonları klonlama silindirleri veya pipet ucu ile Petri kabından alın.
Farklı klonları bir araya getirmekten kaçınmaya çalışın ve bunları her biri 200 mikrolitre takviyeli kültür ortamı içeren 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Cybridler, mitokondriyal miyopati, ensefalopati laktik asidoz ve inme benzeri ataklarla ilişkili en yaygın mitokondriyal DNA mutasyonlarından biri olan heteroplazmik M2343A2G'yi taşıyan bir hastadan türetilen fibroblastlardan başlayarak üretildi. Değişken sayıda tandem tekrarının analizi, siber DNA'nın, hastanın siber DNA'sının 143 B genomu ile değiştirilmesini doğrulayan sıfır sıralı hücrelerle aynı olduğunu gösterdi.
Kısıtlama fragman uzunluğu polimorfizmi veya dizileme analizleri, mitokondriyal DNA mutasyonunun varlığını ve heteroplazmi yüzdesini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokolü denerken, nükleon ve mitokondriyal DNA'nın doğru genetik varlığının yanı sıra yeniden doldurulmuş sibridlerdeki mitokondriyal DNA miktarını doğrulamak önemlidir.
