Yazarlar bu çalışmada kullanılan bitkiler için Mant Acon'a teşekkür eder. Finansman, ABD Tarım Bakanlığı (USDA) CRIS projesi 8062-22410-007-000-D ve USDA NIFA hibesi 2020-70029-33176 tarafından sağlandı.

1. Deneysel bileşik enjeksiyonu için narenciye bitkilerinin üretimi
<ol><li>Küçük saksı narenciye ağaçlarını köklü vejetatif kesimlerden veya tohumlardan çoğaltın. Saksı narenciye hatlarını 16 saat/8 saat aydınlık/karanlık gün boyu ve 28 °C'de büyütün.</li>
	<li>Deney için uygun büyüklükteki narenciye bitkilerini seçin. Tarif edilen uygulamalar, bitkilerin 12 cm ile 100 cm yüksekliğinde, gövde çapları 4-14 mm arasında olmasını gerektirmiştir. Yeni yıkama büyümesi gerekiyorsa, deneyden önce bitkileri kesin.</li>
</ol>2. DPI cihazının ve kalıp bileşenlerinin üç boyutlu baskısı
<ol><li>Baskı yatağına ince bir polivinil asetat bazlı yapıştırıcı tabakası uygulayın.</li>
	<li>Naylon filamenti 3D yazıcıya yükleyin ve yazıcıyı üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. İstenilen şeyi içe aktarın. STL dosyası (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2, Ek Dosya 3, Ek Dosya 4, Ek Dosya 5, Ek Dosya 6, Ek Dosya 7, Ek Dosya 8, Ek Dosya 9, Ek Dosya 10, Ek Dosya 11, Ek Dosya 12, Ek Dosya 13 ve Ek Dosya 14), ayarlayın ve yazdırmaya başlayın.</li>
	<li>Parçayı baskı yatağından çıkarın. Polivinil asetat bazlı yapıştırıcıyı basılı bileşenin tabanından suyla durulayın ve destek yapılarını çıkarın.</li>
	<li>DPI bileşenini iki kat şeffaf parlak sprey boya ile püskürtün.</li>
</ol>3. Plastisol halka kalıbının imalatı
<ol><li>Bir taban üzerinde birbirine yapışmış plastik bloklar kullanarak dikdörtgen bir muhafaza oluşturarak desen parçalarını tutacak kadar büyük bir kalıp formunu birleştirin (Ek Şekil S1A).</li>
	<li>RTV silikon monomerini ve katalizörü 10: 1 oranında karıştırın ve 1 dakika boyunca kabarcık sokmadan karıştırın. Gıda boyası (3 damla/25 mL silikon karışımı) ve el sabunu (1 mL sabun/25 mL silikon karışımı) ekleyerek renklendirin (Ek Şekil S1B).</li>
	<li>Tabanı tamamen örtmek için yeterli olan kalıp formuna ince bir silikon tabakası dökün. Yüzeyi düzleştirmek için bastırın ve silikonun ayarlanması için 24 saat bekleyin (Ek Şekil S1C).</li>
	<li>Yukarıda açıklandığı gibi, desen üzerindeki orta delik çekirdek baskısını kaplayacak kadar derin olan ikinci bir silikon tabakası dökün ( Ek Şekil S1D'de desenin üst kısmında görülebilir). Deseni, orta delikli çekirdek baskısı aşağı bakacak şekilde sıvı silikona yerleştirin. Hiçbir kabarcığın sıkışmadığından ve desenlerin iyi ayrıldığından ve dokunmadığından emin olun (Ek Şekil S1E).</li>
	<li>Desenleri, ayarlanırken silikondan dışarı kaymalarını önlemek için ağır bir nesne ve / veya bantla sabitleyin. Yeni dökülen tabakanın ayarlanması için 24 saat bekleyin (Ek Şekil S1F).</li>
	<li>Seviye desenin üst kısmıyla aynı hizaya gelene kadar ek silikon katmanları dökün. İyileşmek için 24 saat bekleyin (Ek Şekil S1G).</li>
	<li>Kalıbı serbest bırakmak için birbirine yapışmış plastik blokları sökün. Desenleri kaldırın (Ek Şekil S1H). Kalıbı yırtılma veya deformitelere karşı kontrol edin (Ek Şekil S1I).</li>
</ol>4. Plastisol halkalarının dökümü
<ol><li>Kalıbın iç kısmını, tüm çekirdek bileşenlerini ve O-ringleri yemeklik yağ ile kaplayın (Ek Şekil S2A, B). Orta direk çekirdeğinin ortasındaki çentiğin etrafına bir O-halka yerleştirin ve çekirdeği plastisol halka kalıbının orta deliğine yerleştirin (Ek Şekil S2C).</li>
	<li>Dağıtım kanalı çekirdeğini plastisol halka kalıbının yanındaki deliğe yerleştirin. Dağıtım kanalı çekirdeğinin sonundaki V şeklindeki ucu, orta direk çekirdeğindeki O-halkası ile hizalanacak şekilde yönlendirin (Ek Şekil S2D,E).</li>
	<li>Plastisol'ü mikrodalgada 10 sn'lik kısa patlamalar için ısıtın (Ek Şekil S2F, G). Kabarcıkları önlemek için plastisol hafifçe karıştırın (Ek Şekil S2H). Çözelti 160 °C ile 170 °C arasında bir sıcaklığa ulaşana kadar ısıtmayı ve karıştırmayı tekrarlayın (Ek Şekil S2I). DİKKAT: Plastisolün aşırı ısınması toksik dumanların salınmasına neden olabilir. Prosedürü iyi havalandırılan bir alanda veya duman davlumbazında gerçekleştirin. Plastisol'ü 170 °C'nin üzerinde ısıtmayın.</li>
	<li>Erimiş plastisolü, kabarcıklar sokmadan kalıbın dış kenarına yakın plastisol halka kalıbına dökün (Ek Şekil S2J). Plastisol halkalarının soğuması için 1 saat bekleyin (Ek Şekil S2K). Halkaları kalıptan çıkarın. Deneysel testlerde kullanmadan önce DPI cihazına uygun şekilde oturduğundan emin olun (Ek Şekil S2L).</li>
</ol>5. DPI cihazının tesise bağlanması
<ol><li>Cihaz bağlantısı için bagajda pürüzsüz, sağlıklı bir yer bulun. Herhangi bir çarpma veya düğümden kaçının, çünkü bunlar cihaz sızıntısına katkıda bulunabilir.</li>
	<li>Gövde yüzeyi ile 90° açıyla gövdenin ortasından yatay olarak bir delik açmak için 2 mm çapında bir matkap ucu kullanın (Ek Şekil S3A). Engelsiz bir delik oluşturmak üzere temizlemek ve pürüzsüzleştirmek için matkap ucunu delikten birkaç kez geçirin (Ek Şekil S3B).</li>
	<li>Bileşik dağıtım kanalının karşı tarafındaki plastisol halkasında dikey bir dilim oluşturun (Ek Şekil S3C). Halkayı tesisin etrafına yerleştirin ve dağıtım kanalını daha önce delinmiş delikle hizalayın (Ek Şekil S3D). NOT: Halka, sızıntıları önlemek için gövdenin etrafına sıkıca oturmalıdır; Farklı büyüklükteki bitki gövdeleri için plastisol halkalar yapmak için çeşitli çaplarda çekirdek tertibatları kullanılabilir.</li>
	<li>DPI cihazını plastisol halkasına ekleyerek birbirine sıkıca oturduğundan emin olun. DPI cihaz ağzını plastisol halka dağıtım kanalı ve delinmiş delik ile hizalayın (Ek Şekil S3E). NOT: Deliği ve DPI cihaz ağzını hizalamak için bir matkap ucu kullanmak yararlı olabilir.</li>
	<li>Aparatı yerinde tutmak için silikon bantla sıkıca sarın (Ek Şekil S3F). Tesis üzerinde uygun hizalama ve oryantasyonu sağlamak için tamamen monte edilmiş ve takılı cihazı kontrol edin.</li>
</ol>6. DPI cihazını kullanarak ilgilenilen bileşiğin uygulanması
<ol><li>DPI cihazını ilgilenilen çözelti ile doldurmak için bir şırınga veya pipet kullanın (Ek Şekil S3G). Havayı iç kanaldan dışarı çekmek ve hava kabarcıklarının bitki vaskülatürüne girmesini önlemek için DPI cihazının karşı tarafındaki silikon bant ve plastisol halkasına nüfuz etmek için bir şırınga kullanın (Ek Şekil S3H). Çıkarılan herhangi bir bileşiği DPI cihazına geri yerleştirin.</li>
	<li>Alanı güçlendirmek ve yırtılmaları önlemek için şırınga tarafından oluşturulan deliğin üzerine ek bir küçük silikon bant yaması ekleyin. Aparatı bağlantı noktasında gözle görülür sızıntılar açısından kontrol edin ve cihaz rezervuarında sabit bir sıvı seviyesi kontrolü yapın. NOT: Test çözeltisinin israfını önlemek için başlangıçta sızıntıları test etmek için su kullanılabilir.</li>
	<li>DPI cihazının açık ucunu balmumu sızdırmazlık filmi ile örtün ve bir conta oluşturmak ve deneysel bileşiğin buharlaşmasını azaltmak için aşağı çekin. Bir vakumun gelişmesini önlemek için balmumu filminde bir şırınga ucu ile tek bir delik açın ve daha sonra cihazı yeniden doldurun (Ek Şekil S3I).</li>
	<li>Bileşenlerin düzgün bir şekilde hizalandığından emin olmak için aparatı günlük olarak kontrol edin (Ek Şekil S3J) ve rezervuarın kurumasını önlemek için bir şırınga kullanarak sıvıyı doldurun. İstenilen miktarda deneysel çözelti sunulana kadar bu işlemi tekrarlayın. NOT: Bileşikler belirli bir cihazdan 1 aya kadar başarıyla verilebilir. Bu zaman dilimini aşan çözelti alım süreleri, deney kurulumundan önce ampirik olarak test edilmelidir.</li>
</ol>7. Narenciye bitkileri ile vasküler hareketi gözlemlemek için CFDA kullanma
<ol><li>DPI cihazını 25 cm boyundaki sitron (Citrus medica L.) tesislerine takın, DPI cihazınaH2O kontrolünde veya CFDA'da% 20 DMSO'nun tek bir 2,0 mL işlemini uygulayın ve 24 saat boyunca alımına izin verin. Bu protokolü takip etmek için, 2 mM ve% 20 DMSO'luk nihai bir CFDA konsantrasyonu üretmek için 400 μL CFDA stok çözeltisine 1,6 mLH2O ekleyerek (stok çözeltisi% 100 dimetil sülfoksit [DMSO] içinde çözünmüş 10 mM CFDA içerir) çalışan CFDA çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>Bitkinin çeşitli dokularının kesitlerini yapın ve bitki dokularındaki CFDA'yı görselleştirmek için 498 nm dalga boyunu içeren bir floresan filtreli bir stereoskop veya bileşik mikroskop kullanın. Dokudaki otofloresanı hesaba katmak için görüntüleriH2O kontrollerindeki% 20 DMSO ile karşılaştırın.</li>
</ol>8. Streptomisin tedavisini takiben yaprak numunelerinde CLas titresindeki değişikliklerin ölçülmesi
<ol><li>0,75 m boyunda serada yetiştirilen CLas ile enfekte olmuş Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia") bitkilerini kullanarak, her bitkiden iki HLB semptomatik yaprağının yaprak sapını ve midribini toplayın, küçük bölümlere ayırın, her doku tipini bir araya getirin ve 6,35 mm çapında çelik bir top içeren 2 mL darbeye dayanıklı numune tüplerinde ayrı ayrı saklayın.</li>
	<li>3,4 m/s'de iki adet 15 s'lik döngü için programlanmış bir homojenizatör kullanarak numuneyi öğütün. Toplam nükleik asidi daha önce tarif edildiği gibi ekstrakte edin19.</li>
	<li>Tablo 1'de tanımlanan qPCR karışımını ve Tablo 2'de tanımlanan reaksiyon koşullarını kullanarak CLas ile enfekte olmuş yaprak numuneleri üzerinde qPCR gerçekleştirin. Daha fazla analiz için sağlam CLas enfeksiyonları gösteren bitkileri kullanın (sağlam enfeksiyon genellikle CLas 16S LasLong (LL) astar seti için qPCR tabanlı Ct değerleri < 30 olarak tanımlanır). NOT: Bakteriyel titre, daha önce20 açıklandığı gibi, göreceli genom eşdeğerlerini tahmin etmek için CLas 16S Las Long (LL) ve narenciye dehidrin DNA primerleri kullanılarak tahmin edilmektedir.</li>
	<li>Yukarıda özetlenen minimum enfeksiyon titresini karşılayan narenciye bitkilerini DPI cihazlarıyla donatın ve bunları istenen konsantrasyonda 2.0 mLH2O çözeltisi veya streptomisin çözeltisinin bir kerelik işlemine tabi tutun. Bu çalışmayı takip etmek için,H2O'daçözünmüş 9.5 mg / mL (toplamda 19 mg) streptomisinin tek bir 2.0 mL tedavisi kullanın.</li>
	<li>Yaprak örneklerini tedaviden 7 gün, 14 gün ve 28 gün sonra toplayın. Örneklenen yaprakları, yukarıda açıklandığı gibi aynı protokolü kullanarak CLas titresi için test edin.</li>
	<li>Tedaviden 60 gün sonra,H2O veya streptomisin ile muamele edilen bitkilerin fotoğraflarını alın. Enfeksiyon şiddetini puanlamak için CLas enfeksiyonunun görsel gözlemlerini kullanın. Hafif enfeksiyon belirtileri olarak yaprak yıkama büyümesi ile birlikte interveinal kloroz ve ven mantarı gösteren yaprakların% <50'sini ve interveinal kloroz ve ven mantarlaşması olan yaprakların% 50'sinden fazlasını ve ayrıca yaprak emilimini ve bitki büyümesinin bodurluğunu daha şiddetli enfeksiyonların belirtileri olarak arayın.</li>
</ol>9. İmidakloprid tedavisini takiben D. citri'nin mortalitesinin ölçülmesi
<ol><li>Yeni floş büyümesini teşvik etmek için 0,5 m boyundaki sitron (Citrus medica L.) bitkilerini 12 cm yüksekliğe kadar budayın. NOT: Yıkama büyümesinin hızı, bitki sağlığına ve yılın zamanına bağlı olabilir; Bu nedenle, deneysel tasarım sırasında bunu dikkate alın.</li>
	<li>1-2 cm uzunluğunda >6 floş geliştikten sonra, bitkileri yetişkin D. citri içeren kafeslere sokun.Yumurtaların birikmesine izin vermek için bitkileri kafeslerde 24 saat bekletin.</li>
	<li>Döşemeden 1-2 gün sonra üç yıkama çekiminde temsili yumurta sayımı yapın ve ardından DPI cihazlarını uygulayın. Bu cihazları 2.0 mL su kontrolü veya istenen imidacloprid konsantrasyonu (% 21.8 aktif bileşen) ile doldurun. Bu protokolü takip etmek için 528 μL / L, 52.8 μL / L ve 5.28 μL / L imidakloprid kullanın. NOT: Yumurta sayımları yıkıcı bir önlemdir, bu nedenle bu aşamadaki sayımlar, aynı bitkinin sayılmamış floşundaki yumurta sayısını tahmin etmek için kullanılır ve deneyin sonunda yapılan sonraki nimf ortaya çıkma sayımları için bir temel oluşturmaya yardımcı olur.</li>
	<li>Kalan floş sürgünlerin en az üçünde D. citri ortaya çıkma oranını toplayın. Bileşik girişinden 7 gün sonra temsili bitki fotoğrafları alın.</li>
</ol>

Doğrudan İnfüzyon Cihazı Kullanılarak Bitkilerde Molekül Verilmesi

<ol>
	<li>Hu, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+spatiotemporal+dynamics+of+oxytetracycline+and+its+control+effect+against+citrus+huanglongbing+via+trunk+injection.">Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection.</a> Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).</li><li>Bendix, C., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enemy+within:+Phloem-limited+pathogens.">The enemy within: Phloem-limited pathogens.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).</li><li>Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+plant+transformation-+A+review.">Methods of plant transformation- A review.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).</li><li>Qaim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+new+plant+breeding+technologies+for+food+security+and+sustainable+agricultural+development.">Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development.</a> Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).</li><li>Siegrist, M., Hartmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consumer+acceptance+of+novel+food+technologies.">Consumer acceptance of novel food technologies.</a> Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).</li><li>Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radially+sectored+hydraulic+pathways+in+the+xylem+of+Thuja+occidentalis+as+revealed+by+the+use+of+dyes.">Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes.</a> International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).</li><li>Mehdi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symplasmic+phloem+unloading+and+radial+post-phloem+transport+via+vascular+rays+in+tuberous+roots+of+Manihot+esculenta.">Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).</li><li>Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+fluorescent+antibiotic+conjugate+in+planta+utilizing+fluorescence+lifetime+imaging.">Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging.</a> Planta. 253 (2), (2021).</li><li>Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+and+axial+water+movement+in+adult+trees+recorded+by+stable+isotope+tracing.">Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing.</a> Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).</li><li>Nie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liping+Hu,+Haiyan+Zhang,+Jixiang+Zhang,+Zhenxian+Zhang,+Lingyun+Zhang,+The+predominance+of+the+apoplasmic+phloem-unloading+pathway+is+interrupted+by+a+symplasmic+pathway+during+Chinese+jujube+fruit+development.">Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).</li><li>Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shootward+movement+of+CFDA+tracer+loaded+in+the+bottom+sink+tissues+of+Arabidopsis.">Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).</li><li>Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zhe+Sun,+Yanxi+Shi,+from+apoplasmic+to+symplasmic+phloem+unloading+during+storage+roots+formation+and+bulking+of+sweet+potato.">Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato.</a> Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).</li><li>Erdos, T., Ullmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+streptomycin+on+the+incorporation+of+amino-acids+labeled+with+carbon-14+into+ribonucleic+acid+and+protein+in+a+cell-free+system+of+a+Mycobacterium.">Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium.</a> Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Motaung, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloronicotinyl+insecticide+imidacloprid:+Agricultural+relevance,+pitfalls+and+emerging+opportunities.">Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities.</a> Crop Protection. 131, 105097 (2020).</li><li>Berger, C., Laurent, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trunk+injection+of+plant+protection+products+to+protect+trees+from+pests+and+diseases.">Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases.</a> Crop Protection. 124, 104831 (2019).</li><li>Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trunk+injection+as+a+tool+to+deliver+plant+protection+materials-An+overview+of+basic+principles+and+practical+considerations.">Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations.</a> Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).</li><li>Wise, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trunk+injection:+A+discriminating+delivering+system+for+horticulture+crop+IPM.">Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM.</a> Entomology, Ornithology &amp; Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).</li><li>Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asian+citrus+psyllid+adults+inoculate+Huanglongbing+bacterium+more+efficiently+than+nymphs+when+this+bacterium+is+acquired+by+early+instar+nymphs.">Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).</li><li>Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth,+health+and+Liberibacter+asiaticus+titer+in+diverse+citrus+scions+on+mandarin+versus+trifoliate+hybrid+rootstocks+in+a+field+planting+with+severe+Huanglongbing.">Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing.</a> Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).</li><li>Akaike, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+the+statistical+model+identification.">A new look at the statistical model identification.</a> IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).</li><li>Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+hairpin+RNAs+and+small+RNAs+into+woods+and+herbaceous+plants+by+trunk+injection+and+petiole+absorption.">Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).</li><li>Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+excised-leaf+assay+method+to+test+inoculativity+of+Asian+citrus+psyllid+(Hemiptera:+Psyllidae)+with+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+associated+with+citrus+Huanglongbing+disease.">New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease.</a> Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).</li></ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur. Bu yayında ticaret, firma veya şirket adlarının kullanılması, okuyucunun bilgisi ve rahatlığı içindir. Bu tür bir kullanım, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı veya Tarımsal Araştırma Servisi tarafından herhangi bir ürün veya hizmetin, uygun olabilecek başkalarının hariç tutulması için resmi bir onay veya onay teşkil etmez. ABD Tarım Bakanlığı (USDA), tüm program ve faaliyetlerinde ırk, renk, ulusal köken, yaş, engellilik ve uygulanabilir olduğunda, cinsiyet, medeni durum, ailevi durum, ebeveynlik durumu, din, cinsel yönelim, genetik bilgi, siyasi inançlar, misilleme temelinde veya bir bireyin gelirinin tamamı veya bir kısmı herhangi bir kamu yardım programından elde edildiği için ayrımcılığı yasaklamaktadır. Yasaklı bazların tümü tüm programlar için geçerli değildir. Program bilgilerinin (Braille, büyük baskı, ses bandı vb.) iletişimi için alternatif araçlara ihtiyaç duyan engelli kişiler, USDA'nın TARGET Merkezi ile (202) 720-2600 (ses ve TDD) numaralı telefondan iletişime geçmelidir. Ayrımcılık şikayetinde bulunmak için USDA, Direktör, Medeni Haklar Ofisi, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, D.C. 20250-9410 adresine yazın veya (800) 795-3272 (sesli) veya (202) 720-6382 (TDD) numaralı telefonları arayın. USDA eşit fırsat sağlayıcısı ve işverendir.

DPI cihazının bitkilere eksojen bileşik dağıtımı için uygun bir yöntem olarak kabul edilmesi için, çeşitli doku tiplerine sağlam ve tutarlı bileşik alımına katkıda bulunması gerekir. CFDA'yı kullanan deney, hem akropetal hem de bazipetal bileşik hareketinin yanı sıra yaprağın hem vasküler sisteminde hem de mezofil hücrelerinde açıkça göstermiştir. Ek olarak ve muhtemelen bu DPI cihazında kullanılan sıkılmış delik, bileşik alımı için büyük miktarda yüzey alanı sağladığından, CFDA, gövde enjeksiyonukullanan bitkilerde önceki boya alım çalışmalarında görüldüğü gibi, sadece cihaza bitişik vaskülatürün küçük bir alt kümesinde değil, gövdenin tüm bölümlerinde nispeten eşit miktarlarda mevcuttu 6. Ek olarak, yeşil floresan proteini ve çiçek boyasının verilmesi DPI cihazı kullanılarak test edildi ve bu bileşiklerin CFDA'ya benzer bir dağılımı gözlendi (veriler gösterilmedi). Bu veriler, cihazın sistematik olarak boyut ve moleküler yapıya göre değişen çeşitli bileşikler sunmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, yaprak gelişim aşamasına bağlı olarak bileşik alımında farklılıklar olduğunu, genç gelişmekte olan yaprakların yaşlı yerleşik yapraklardan daha fazla bileşik aldığını belirtmek gerekir. Bu, kaynak dokuya karşı lavaboda bulunan vaskülatür özelliklerindeki değişikliklerden kaynaklanabilir ve belirli bir deney için optimize edilmelidir. 
DPI cihazı, CFDA, GFP ve çiçek boyasının görselleştirilmesi için yeterli bileşik alımı gösterdi ve ayrıca sırasıyla streptomisin ve imidaklopridin antibakteriyel ve böcek öldürücü etkilerini göstermek için yeterli sürdü. Her iki bileşik de tek bir 2.0 mL tedaviden 1 hafta sonra hedef organizma canlılığında değişikliklere neden oldu. Bu veriler, DPI cihazının, mikrobiyal ve böcek zararlılarının kontrolü için çok çeşitli bileşiklerin yaşayabilirliğini test etmek için tüm bitki tahlillerinde kullanılabileceğini göstermektedir. Dahası, vasküler sistemle doğrudan teması nedeniyle, bu cihaz kökler veya epidermal hücreler tarafından verimli bir şekilde alınmayan bileşikleri test etmek için bir fırsat bile sağlayabilir. Özellikle ilgi çekici olan RNA girişimi (RNAi) olacaktır, çünkü bu, konakçı bitki, patojen veya patojen vektörü içindeki gen ekspresyonunu modüle etmek için kullanılabilir. Saç tokası RNA'sını elma ve üzüm bitkilerinin gövdesindeki delinmiş bir delikten geçiren önceki araştırmalar, RNA moleküllerinin ksilem dokusuyla sınırlı olduğunu gösterdi ve bu moleküllerin sadece çiğneme ve ksilem özsuyu besleyen organizmalara karşı etkili olabileceğini düşündürdü22. DPI cihazının benzer bir delinmiş delik dağıtım sistemi kullandığı göz önüne alındığında, bu cihazla birlikte verilen saç tokası RNA'sının da ksilem dokusuyla sınırlı olabileceği düşünülmektedir. Bununla birlikte, DPI cihazından streptomisin tedavisinden sonra floem sınırlı CLas titresinde gözlenen azalma, bu antibiyotiğin floemde mevcut olduğunu kuvvetle düşündürmektedir. Bu nedenle, DPI cihazı kullanılarak verilen bileşiklerin vasküler dağılımının boyutlarına ve kimyalarına bağlı olması muhtemeldir ve her molekül ayrı ayrı değerlendirilmelidir.
Piyasada piyasada satılan bir dizi DPI cihazı olmasına rağmen, burada açıklanan cihaz şirket içinde üretilebilir ve değiştirilebilir. Bu şekilde, kullanılan bitki türüne ve deneysel tasarıma göre iyileştirmeler ve büyüklükte değişiklikler yapılabilir ve ticari ürünlere bağlı değildir. Ek olarak, cihaz bitkiye yarı kalıcı olarak bağlanır, yani belirli bir bileşiğin çoklu işlemleri, bitkiyi birden fazla bileşik enjeksiyonu ile yeniden yaralamak zorunda kalmadan aynı anda gerçekleştirilebilir. Uyarı notunda, cihaz düzgün takılmazsa sızıntı yapabilir. Sonuç olarak, bileşik bitkiye teslim edilmek yerine çevreye kaybolur. Bu nedenle, kurulum sırasında ve sonraki ilk birkaç gün boyunca cihazı herhangi bir sızıntı belirtisi açısından kontrol etmeye özen gösterilmelidir. Ağaçta bir delik açmak potansiyel olarak zararlı olsa da, bu yöntem sağlam ve tutarlı bileşik alımını sağlamak için seçilmiştir. Ek olarak, bu deneylerde DPI cihazının takılmasından bitki sağlığı üzerinde olumsuz bir etki görülmemiştir. Bununla birlikte, belirli bir deney boyunca canlılığını kaybedebilecek olanların yerini almak için deneysel tasarıma ekstra bitkiler dahil edilmelidir. Son olarak, bu cihaz bileşikleri tanıtmak için pasif akış kullandığından, farklı bitki türleri veya aynı türün gelişim aşamaları arasındaki alım oranını tahmin etmek zor olabilir. Bu, bileşik alımının hızı sınırlayıcı bir faktörse deneyleri karmaşıklaştırabilir. En iyi sonuçlar için, deneyler, bitkinin 1 haftaya kadar sürebilen 2.5 mL bileşiği tamamen emmesi için yeterli zaman sağlanacak şekilde planlanmalıdır. Sonuç olarak, bu DPI cihazı, antimikrobiyal veya insektisidal bileşiklerin in planta aktivitesinin CLas ve vektörü D. citri'ye karşı hızlı bir şekilde değerlendirilmesi için etkili bir araçtır, böylece sistemik etkinlik ve bitki performansı üzerindeki etkisi hakkında daha önce sunulan müstakil yaprak tahlili23'ten daha fazla bilgi sağlar. Kuşkusuz, bu sistem için uygulama çeşitliliği, bu çalışmada açıklanan özel kullanımların çok ötesine ulaşmaktadır.

Bitkilerin ticari ve peyzaj ortamlarında yönetimi genellikle bitki büyümesini ve sağlığını optimize etmek için kimyasal bileşiklerin kullanılmasını gerektirir. Bu moleküllerin nasıl verildiği, molekülün türüne, molekülün işlevine, bitkinin türüne ve mevcut yönetim sistemine bağlıdır. Yaprak ve toprak uygulamaları en kolay dağıtım stratejileridir, ancak bazı moleküllerin alımındaki sınırlamalar doğrudan teslimatı gerektirir. Bu moleküllerin bir örneği, bitki içinde sistemik olarak hareket ettiklerinde en iyi şekilde işlev gören ancak basit topikal uygulamalarla etkili bir şekilde sağlanamayan terapötik moleküllerdir1. Bu, narenciye yeşillendirme hastalığı olarak da adlandırılan Huanglongbing (HLB) için geçerlidir. HLB, bitkinin dışında kültürlenemeyen floem sınırlı bir bakteri olan Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) veya böcek vektörü Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2 ile ilişkili bir hastalıktır.
Varsayılan terapötik moleküller gen ürünleri ise, bu bileşikleri ifade eden transgenik bitkiler oluşturularak test edilebilirler. Bununla birlikte, transgenik bitki üretimi zaman ve kaynak yoğun olabilir, oldukça genotipe bağımlıdır ve gen susturma3 ile inhibe edilebilir. Ek olarak, bu transgenikler umut verici sonuçlar gösterse bile, düzenleyici ve kamusal algı kısıtlamaları ticari kabul edilme olasılığını azaltır 4,5. Bununla birlikte, bileşiklerin eksojen uygulaması, biyolojik ve sentetik moleküllerin test edilmesini basitleştirir, çünkü bir molekülün etkilerini test etmek için zaman ve kaynakları azaltan kararlı veya geçici olarak eksprese eden transgenik bitkilerin üretimini gerektirmez. Eksojen bileşiklerin etkili ve verimli sistemik bitki dağıtımı için bir yöntem, çok çeşitli araştırma ve tarama amaçları için kullanılabilir.
Bu uygulamalardan biri, bir bitkinin vasküler sistemi içindeki sistemik molekül hareketinin analizidir; bu, floresan, görünür veya benzersiz kimyasal izotoplar 6,7,8,9 olsun, izlenebilir belirteçler kullanılarak yapılabilir. Yaygın olarak kullanılan bir floresan belirteç, hücre içi esterazlar tarafından 5,6-karboksifloresein (CF) içine parçalanan ve daha sonra floresan ve membran geçirimsiz10 haline gelen membran geçirgen bir boya olan 5,6-karboksifloresein-diasetattır (CFDA). CFDA, floem taşınımını, lavabo ve kaynak ilişkilerini ve bitki dokusundaki vaskülatür paternini izlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır11,12.
Bu belirteçlere ek olarak, bazı bileşikler verimliliği artırmak veya herbisitler durumunda bitkiyi öldürmek için bitkinin fizyolojisini doğrudan değiştirebilir. Hem insektisitler hem de antimikrobiyal bileşikler, özellikle HLB varlığında bitki verimliliğini arttırmanın bir yoludur. CLas'ı kontrol etmek için kullanılan bir antimikrobiyal molekülün bir örneği streptomisin'dir. Streptomisin, başlangıçta Streptomyces griseus'tan izole edilen ve protein biyosentezinin inhibisyonu yoluyla bakteriyel büyümeyi inhibe ettiği gösterilen bir aminoglikozit antibiyotiğidir13. İnsektisitler açısından, HLB araştırmasının ana hedefi, CLas'ı ağaçtan ağaca ileten D. citri'dir 14. Bu amaçla, imidakloprid gibi neonikotinoidler, böcek zararlılarını kontrol etmek için altın standart oldukları için yaygın olarak kullanılmaktadır15. Tüm bu çeşitli kullanımlar, mevcut tesis yönetimi stratejilerinin önemli yönleridir ve yeni ürünlerin geliştirilmesi, verimli tarama analizlerine bağlıdır.
Bileşiklerin odunsu bitkilere sokulması için kullanılan bir yöntem, gövdeye doğrudan enjeksiyondur. Önceden delinmiş enjeksiyon bölgeleri için ihtiyaçlarına göre değişen çeşitli sistemler tasarlanmıştır ve bu sistemler basınca dayalı enjeksiyon veya pasif akışkullanır 16. Basınca dayalı sistemler belirli bir bileşiğin hızlı bir şekilde sokulmasına izin vermesine rağmen, sıvıyı bloke edilmiş veya embolize edilmiş vaskülatür yoluyla zorlamanın neden olduğu potansiyel fiziksel hasarın dikkate alınması gerekir17. Bileşiklerin yaprak veya damla damlası uygulamasının uygulanması daha az zaman alıcı olmasına rağmen, doğrudan bitki enjeksiyonu, hava veya toprağa verilen zararlar nedeniyle ilgilenilen bileşiğin israfını azaltır ve ayrıca bileşiklerin dış ortama maruz kalmayı azaltarak aktif bir durumda olduğu süreyi uzatabilir18. Bu yönlerin her ikisi de pahalı reaktifleri korumak ve araştırma ortamlarında replikalar arasında tutarlılık sağlamak için önemlidir.
Bu çalışma, ilgilenilen bileşiklerin bir konakçı bitkiyi nasıl etkilediğini değerlendirmek için kullanılabilecek yenilikçi bir doğrudan bitki infüzyonu (DPI) cihazının tasarımını, yapımını ve kullanımını açıklamaktadır. Hem cihazın kendisini hem de yapımıyla ilişkili çeşitli bileşenleri üretmek için standart bir 3D yazıcı kullanıldı. Bu şirket içi inşaat yöntemi, araştırmacıların cihazı ve cihaz bileşenlerini kendi özel deneysel ihtiyaçlarına göre değiştirmelerine olanak tanır ve ticari olarak temin edilebilen bitki enjeksiyon cihazlarına olan bağımlılığı azaltır. Cihaz kurulumu basit ve verimlidir ve tüm yardımcı bileşenler kolayca temin edilebilir ve ucuzdur. Sistem çeşitli bitki türleriyle kullanılmak üzere tasarlanmış olmasına rağmen, burada sunulan örnekler saksı narenciye bitkileri ile ilgilidir. Ek olarak, bu çalışma, bu cihazın ölümcül olmasına neden olmadan genç narenciye bitkilerine sistematik olarak birden fazla bileşik türünü verimli bir şekilde verebildiğini göstermektedir. Test edilen bileşikler, bitkideki bileşik dağılımını değerlendirmek için kullanılan CFDA'yı ve bu bileşiklerin antimikrobiyal ve böcek öldürücü etkilerinin DPI yoluyla verildiğinde gözlemlendiğini doğrulamak için kullanılan streptomisin ve imidakloprid'i içeriyordu.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 cm Diameter Steel Balls</td>
			<td>Ballistic Products Inc.</td>
			<td>#SHT #T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>382903029952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 Syringe Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Screw Cap Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-PR-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-SW-FDVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>S-FW-OEVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/64th Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well qPCR Machine</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SP-BX43-BI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>69401-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloss Clear Spray Paint</td>
			<td>Rustoleum</td>
			<td>249117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grey Lego Baseplate</td>
			<td>Lego</td>
			<td>11024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Cordless Drill</td>
			<td>Makita</td>
			<td>6349D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidacloprid 2F</td>
			<td>Quali-Pro</td>
			<td>83080133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Plastisol Medium Hardness</td>
			<td>Fusion X Fishing Lures</td>
			<td>XSOL-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Silicone 70 Shore A O-Ring</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Varies by Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Stick Cooking Spray</td>
			<td>PAM</td>
			<td>64144030217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plant II</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740770.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly Viyl Acetate Based Glue</td>
			<td>Elmers</td>
			<td>E301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Varies by DNA sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A5003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent Silicone RTV Rubber</td>
			<td>Aero Marine Products</td>
			<td>AM 115T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Silicone Tape</td>
			<td>Maxwell</td>
			<td>KE30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truncated Oncocin 112</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Varies by peptide sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 1 x 6 Lego Piece</td>
			<td>Lego</td>
			<td>300901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Nylon</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-MF-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct infusion device for molecule delivery in plants

Bitkilerde terapötik bileşiklerin işlevinin test edilmesi, tarımsal araştırmanın önemli bir bileşenidir. Yaprak ve toprak damlatma yöntemleri rutindir, ancak değişken alım ve test edilen moleküllerin çevresel parçalanması gibi dezavantajları vardır. Ağaçların gövde enjeksiyonu iyi bilinmektedir, ancak bunun için çoğu yöntem pahalı, tescilli ekipman gerektirir. Huanglongbing için çeşitli tedavileri taramak için, bu bileşikleri, floem sınırlı bakteri Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) ile enfekte olmuş veya floem besleyen CLas böcek vektörü Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) ile enfekte olmuş küçük serada yetiştirilen narenciye ağaçlarının vasküler dokusuna iletmek için basit, düşük maliyetli bir yönteme ihtiyaç vardır.
Bu tarama gereksinimlerini karşılamak için, tesisin gövdesine bağlanan bir doğrudan bitki infüzyonu (DPI) cihazı tasarlanmıştır. Cihaz, naylon tabanlı bir 3D baskı sistemi ve kolayca elde edilebilen yardımcı bileşenler kullanılarak yapılmıştır. Bu cihazın bileşik alım etkinliği, floresan marker 5,6-karboksifloresein-diasetat kullanılarak narenciye bitkilerinde test edilmiştir. Markörün bitkiler boyunca düzgün bileşik dağılımı rutin olarak gözlenmiştir.
Ayrıca, bu cihaz sırasıyla CLas ve D. citri üzerindeki etkilerini belirlemek için antimikrobiyal ve böcek öldürücü moleküller vermek için kullanıldı. Aminoglikozit antibiyotik streptomisin, cihaz kullanılarak CLas ile enfekte olmuş narenciye bitkilerine verildi ve bu da CLas titresinde tedaviden 2 haftadan 4 haftaya kadar bir azalmaya neden oldu. Neonikotinoid insektisit imidacloprid'in D. citri istilasına uğramış narenciye bitkilerine verilmesi, 7 gün sonra psyllid mortalitesinde önemli bir artışa neden olmuştur. Bu sonuçlar, bu DPI cihazının, molekülleri test etmek ve araştırma ve tarama amaçlarını kolaylaştırmak için bitkilere iletmek için yararlı bir sistemi temsil ettiğini göstermektedir.

The management of plants in commercial and landscape settings often requires the use of chemical compounds to optimize the plant growth and health. How these molecules are delivered depends on the type of molecule, the function of the molecule, the type of plant, and the management system in place. Foliar and soil applications are the easiest delivery strategies, but limitations in the uptake of some molecules necessitate direct delivery. An example of these molecules is therapeutic molecules that function best when they move systemically within the plant but cannot be effectively delivered by simple topical applications1. This is the case with Huanglongbing (HLB), also called citrus greening disease. HLB is a disease associated with a phloem-limited bacterium, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), which cannot be cultured outside of the plant, or its insect vector, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
If the putative therapeutic molecules are gene products, they can be tested by creating transgenic plants expressing these compounds. However, transgenic plant production can be time- and resource-intensive, is highly genotype-dependent, and can be inhibited by gene silencing3. In addition, even if these transgenics show promising results, regulatory and public perception constraints reduce the likelihood of their commercial acceptance4,5. The exogenous application of compounds, however, simplifies the testing of biological and synthetic molecules because it does not require the production of stable or transiently expressing transgenic plants, which reduces the time and resources for testing a molecule&#39;s effects. A method for the effective and efficient systemic plant delivery of exogenous compounds could be used for a wide variety of research and screening purposes.
One of these applications is the analysis of systemic molecule movement within a plant&#39;s vascular system, which can be done using trackable markers, whether they are fluorescent, visible, or unique chemical isotopes6,7,8,9. One commonly used fluorescent marker is 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA), which is a membrane-permeable dye that is degraded by intracellular esterases into 5,6-carboxyfluorescein (CF) and, subsequently, becomes fluorescent and membrane-impermeable10. CFDA has been extensively used to monitor phloem transport, sink and source relationships, and vasculature patterning in plant tissue11,12.
In addition to these markers, certain compounds may directly alter the plant&#39;s physiology to increase the productivity or kill the plant in the case of herbicides. Both insecticides and antimicrobial compounds are a means of increasing plant productivity, especially in the presence of HLB. An example of an antimicrobial molecule that is used to control CLas is streptomycin. Streptomycin is an aminoglycoside antibiotic that was originally isolated from Streptomyces griseus and has been shown to inhibit bacterial growth through the inhibition of protein biosynthesis13. In terms of insecticides, the main target for HLB research is D. citri, which transmits CLas from tree to tree14. For this purpose, neonicotinoids, such as imidacloprid, are commonly utilized, as they are the gold standard for controlling insect pests15. All these varied uses are important aspects of current plant management strategies, and the development of novel products is dependent on efficient screening assays.
One method that is used for the introduction of compounds into woody plants is direct injection into the trunk. A variety of systems have been designed that vary in their needs for predrilled injection sites, and these systems utilize either pressure-based injection or passive flow16. Although pressure-based systems allow for the quick introduction of a given compound, the potential physical damage caused by forcing liquid through blocked or embolized vasculature needs to be considered17. Although the foliar or drench application of compounds is less time-intensive to implement, direct plant injection reduces waste of the compound of interest due to losses to the air or soil and can also lengthen the time that compounds are in an active state by reducing the exposure to the outside environment18. Both these aspects are important for preserving expensive reagents and ensuring consistency among replicates in research settings.
This study describes the design, construction, and use of an innovative direct plant infusion (DPI) device, which can be used to assess how compounds of interest affect a host plant. A standard 3D printer was used to manufacture both the device itself and several components associated with its construction. This in-house construction method allows researchers to modify the device and device components based on their specific experimental needs and reduces the reliance on commercially available plant injection devices. The device setup is simple and efficient, and all the auxiliary components are readily available and inexpensive. Although the system was designed for use with a variety of plant species, the examples presented here pertain to potted citrus plants. Additionally, this study demonstrates that this device is capable of efficiently delivering multiple types of compounds systemically to young citrus plants without causing lethality. The compounds tested included CFDA, which was used to assess the compound distribution in the plant, and streptomycin and imidacloprid, which were used to verify that the antimicrobial and insecticidal effects of these compounds were observed when delivered via DPI.

Yazar Spotlight: Bitkilerde Molekül Dağıtımı için Doğrudan İnfüzyon Cihazı  

Bitkilerde Molekül Dağıtımı için Doğrudan İnfüzyon Cihazı

Delivering a therapeutic molecule to where a pathogen resides in a plant can be challenging. Treating Candidatus Liberibacter asiaticus, or CLas, a bacteria that is limited to the phloem, poses one of the biggest challenges in delivering molecules against it, especially when using conventional methods such as spray applications. The ease of printing the direct plant infusion device and its simple implementation makes it accessible to anyone.This enables the widespread screening of molecules for their potential therapeutic effect in trees. An added benefit is that the diffusion of molecules utilizes the natural process of plant transpiration. Our research improved efficiency and precision of molecular delivery in plants, which can be used for a range of research applications.By screening hundreds of molecules on small plants, we can eliminate the need for larger trees, leading to a reduction in cost and space utilization.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants at JoVE.com

Bu el yazmasında, moleküllerin bakterilere (Candidatus Liberibacter asiaticus) veya böcek vektörüne (Diaphorina citri, Kuwayama) karşı etkinliğini taramak için yeni bir doğrudan bitki infüzyon cihazı tanımlanmaktadır.

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

Bir patojenin bir bitkide bulunduğu yere terapötik bir molekül vermek zor olabilir. Candidatus Liberibacter asiaticus'un veya floemle sınırlı bir bakteri olan CLas'ın tedavisi, özellikle sprey uygulamaları gibi geleneksel yöntemler kullanıldığında, moleküllerin buna karşı verilmesinde en büyük zorluklardan birini oluşturur. Doğrudan bitki infüzyon cihazının basım kolaylığı ve basit uygulaması, herkes tarafından erişilebilir olmasını sağlar.Bu, ağaçlardaki potansiyel terapötik etkileri için moleküllerin yaygın olarak taranmasını sağlar. Ek bir fayda, moleküllerin difüzyonunun doğal bitki terleme sürecini kullanmasıdır. Araştırmamız, bir dizi araştırma uygulaması için kullanılabilecek bitkilerde moleküler teslimatın verimliliğini ve hassasiyetini artırdı.Küçük bitkilerde yüzlerce molekülü tarayarak, daha büyük ağaçlara olan ihtiyacı ortadan kaldırabilir, bu da maliyet ve alan kullanımında bir azalmaya yol açabilir.

direct-infusion-device-for-molecule-delivery-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

1.3K Görüntüleme.  United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory. Bir patojenin bir bitkide bulunduğu yere terapötik bir molekül vermek zor olabilir. Candidatus Liberibacter asiaticus'un veya floemle sınırlı bir bakteri olan CLas'ın tedavisi, özellikle sprey uygulamaları gibi geleneksel yöntemler kullanıldığında, moleküllerin buna karşı verilmesinde en büyük zorluklardan birini oluşturur. Doğrudan bitki infüzyon cihazının basım kolaylığı ve basit uygulaması, herkes tarafından erişilebilir olmasını sağlar.Bu, ağaçla...

Video: Yazar Spotlight: Bitkilerde Molekül Dağıtımı için Doğrudan İnfüzyon Cihazı  

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

Biyoloji

﻿3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings

3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings  

To begin 3D printing the direct plant infusion or DPI device and mold components, apply a thin layer of polyvinyl acetate-based glue on the print bed of the printer. Load nylon filament into the printer and prepare the printer per the manufacturer's instructions. After importing the desired STL files, set up the printer and start printing.Once the piece is removed from the print bed after printing, rinse the polyvinyl acetate-based glue from the base of the printed component with water. Spray the printed DPI device and other components with two coats of clear gloss spray paint. To fabricate the plastisol ring mold, assemble a mold form by building a rectangular enclosure using snap-together plastic blocks on a base.It should be large enough to hold the pattern pieces. Mix the room temperature vulcanizing silicone or RTV silicone monomer and the catalyst together at a 10:1 ratio by stirring for one minute. Color the solution by adding three drops of food coloring and one milliliter of hand soap per 25 milliliters of silicone mixture.Then, pour a thin layer of the silicone solution into the mold form sufficiently to fully cover the bottom of the mold form. Tamp to flatten the surface of the poured silicone, and wait for 24 hours to set the silicone. Once the silicone is set, pour another layer of silicone deep enough to cover the center hole core print of the pattern.Insert the pattern into the liquid silicone with the center hole core print facing down. Ensure that no bubbles are trapped and the patterns are well separated and not touching each other. Secure the patterns with either a heavy object or tape to prevent them from floating out of the silicone while it sets.Once set, pour additional layers of silicone into the mold form until the level is flush with the top of the pattern. Let the silicone cure for 24 hours. Disassemble the snap-together plastic blocks to release the mold.Then, remove the patterns from the mold and inspect the mold for tears or deformities. For casting the plastisol rings, coat the interior of the mold, all the core components, and the O-rings with cooking oil. Place an O-ring around the notch in the middle of the center post core, and place the core in the center hole of the plastisol ring mold.Insert the delivery channel core into the space on the side of the plastisol ring mold. Orient the V-shaped tip at the end of the delivery channel core to align with the O-ring on the center post core. Next, heat plastisol in the microwave for short bursts of 10 seconds till the solution reaches 160 to 170 degrees Celsius.In between, stir the plastisol gently to avoid bubbles. Pour the molten plastisol into the plastisol ring mold near the outside edge of the mold without introducing bubbles. Wait one hour for the plastisol rings to cool.Then, remove the rings from the mold. The DPI device was eight centimeters in height and three centimeters in width. It had a single central reservoir contiguous with the spout.The total volume that can be contained within these components is 2.0 milliliters. The 1.8 centimeter tall and 2.7 centimeter wide plastisol ring also contained two channels. One to accommodate the DPI device spout and another of variable diameter for fitting around the trunk of the tree.When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree.

Doğrudan Bitki İnfüzyon (DPI) Cihazının 3D Baskısı ve Plastisol Halkaların İmalatı

Attachment of the Direct Plant Infusion (DPI) Device to Citrus Plants for Compound Injection

Propagate small potted citrus trees from rooted vegetative cuttings or seeds. Grow the potted citrus lines at 28 degrees Celsius, maintaining a proper day length. Select citrus plants of the appropriate size for the experiment.To attach the 3D-printed Direct Plant Infusion or DPI device to the trunk of the plant, find a smooth, healthy site on the trunk without bumps or knots. Using a two-millimeter-diameter drill bit, horizontally drill a hole through the center of the stem at an angle of 90 degrees to the trunk surface. Run the drill bit through the hole several times to create an unobstructed, smooth hole.Then create a vertical slice in the plastisol ring on the opposite side of the compound delivery channel. Fit the ring around the plant, aligning the delivery channel with the previously-drilled hole. Attach the DPI device to the plastisol ring, ensuring they fit snugly together, and align the DPI device spout with the plastisol ring delivery channel and the drilled hole.Wrap it tightly with silicone tape to hold the apparatus in place. Inspect the fully assembled and attached device to ensure proper alignment and orientation. The groove around the vertical channel allowed additional compound uptake through the bark.When assembled properly, the plastisol ring flushed against the DPI device and the spout lined up with a hole drilled in the tree.

Doğrudan Bitki İnfüzyonu (DPI) cihazının bileşik enjeksiyon için narenciye bitkilerine bağlanması

Applying Compounds to Citrus Plants Using a Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion (DPI) Device

To apply compounds to the plants using the Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion, or DPI device, ensure the device is properly fitted to the plants. When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree. Use a syringe or pipette to fill the DPI device with the compound solution of interest.Using a syringe, penetrate the silicone tape and plastisol ring opposite to the DPI device to extract air from the interior channel. Replace any extracted compound back into the DPI device. Add an additional small patch of silicone tape over the hole created by the syringe to reinforce the area and prevent tears.Inspect the apparatus for visible leakages at the attachment point and inspect the device reservoir for a stable liquid level. Cover the open end of the DPI device with a wax sealing film and pull it down to form a seal to reduce the evaporation of the experimental compound. Poke a single a hole in the wax film with a syringe tip to prevent the development of a vacuum, and subsequently refill the device.Check the apparatus daily to ensure proper alignment of the components, and top off the liquid using a syringe to avoid the reservoir running dry til the desired amount is delivered. When two milliliters of two millimolar CFDA dye was introduced to the plant using the DPI device, a fluorescent signal was detected in the vasculature of the treated plant, but was absent in the controlled plant treated with 20%DMSO in water. This signal was observed within 24 hours of treatment, evenly throughout the dissected plant tissue types.Treatment of streptomycin on Candidatus Liberibacter Asiaticus or CLass positive plants showed a reduction in the mean bacterial titer to 28 days after treatment compared to the control. The treated plants showed a lower mean CLas titer over all combined time points. The streptomycin treated plants as compared to the controls showed an occasional increase in new healthy flush growth after 60 days.Imidacloprid treatment on plants significantly reduced nymph emergence at the highest Imidacloprid concentration compared to the corresponding egg count. This was visually apparent in the reduction in nymph honeydew production.