Nanolif dizileri, Enerji Bakanlığı Bilim Kullanıcı Tesisi Ofisi olan Nanofaz Malzeme Bilimleri Merkezi'nde üretilmiştir (Teklif No: CNMS2019-103 ve CNMS2022-A-1182). CNMS'den destek, hakemli bir teklif sistemi aracılığıyla verilir ve sonuçlarını yayınlamak isteyen başarılı başvuru sahiplerine ücretsiz olarak sağlanır (http://www.cnms.ornl.gov/user/becoming_a_user.shtml). Nanofiber dizilerin üretimindeki yardımları için Kevin Lester ve CNMS'ye teşekkür ederiz. Dr. John Caughmen, Dr. Timothy McKnight, Dr. Amber Webb, Daryl Briggs ve Travis Bee'ye deneysel tasarım üzerine eleştirel tartışmalar için teşekkür ederiz. PECVD makinesinin şeması için Dr. Adam Rondinone'ye teşekkür ederiz. Bilimsel çizimler için Leslie Carol'a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Biyogörüntüleme Bilimi Programı, ABD Enerji Bakanlığı, Bilim, Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi, DE-SC0019104 ve Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı, 2021-67013-34835 tarafından finanse edilmiştir. JMM, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı: Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü: Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi Doktora Öncesi Bursu 2021-67034-35167 tarafından desteklenmiştir.

1. VACNF üretimi (Şekil 2 ve Şekil 3)
<ol><li>Polimetil metakrilat (PMMA) 495 A4 ile silikon bir gofreti spincoat yapın, 4000 rpm'de direnç gösterir ve 180 °C'de 5 dakika pişirin. NOT: Bir sonraki adıma geçmeden önce gofreti 10 saniye soğumaya bırakın.</li>
	<li>İkinci bir direnç katmanını (PMMA 950 A2) döndürün ve 180 °C'de 5 dakika pişirin.</li>
	<li>300 mm x 10 mm'lik dizilerde belirli bir yanal aralıkta (aralık: 35 μm veya 3 μm) 3 nm çapa sahip katalizör noktalarını tanımlamak için elektron ışını litografisini kullanın.</li>
	<li>30-40 mL 1: 3 metil-izobütil keton: izopropil alkol (IPA) içinde 1.5 dakika direnç geliştirin, ardından IPA ile durulayın veN2 ile kurutun. NOT: Bir parlak alan mikroskobu (20x objektif) kullanarak nokta dizisini kontrol edin.</li>
	<li>Kalan direncin gofretini bir silikon aşındırıcıda oksijen plazmasına (descum) 6 saniye maruz bırakarak temizleyin.</li>
	<li>Önce yapışkan bir metal tabakasını (Ti veya Cr, 10 nm) biriktirmek için elektron ışını buharlaşmasını kullanın ve ardından Ni katalizörü (130 nm veya 150 nm) olan ikinci bir tabakayı biriktirin. Ti veya Ni metal biriktirme sırasında, görüş hattı biriktirme için akımı 0.2 kV'da 10 A'nın altında, basıncı 5 x 10-6 Torr'un altında ve biriktirme hızını ~1 A/s'de tutun.</li>
	<li>Alttaki direnç tabakasında biriken metali (Ni) çıkarmak için sıralı banyo sonikasyonunu kullanın ve Ni'yi doğrudan silikon gofret üzerinde biriktirin. Bu işleme kalkış denir.<ol><li>Bunun için asetonlu 3 kap hazırlayın ve gofreti asetonda 1 dakika boyunca banyo sonikasyonu; oda sıcaklığında (RT, 20 °C) 35 kHz frekansında 3 kez tekrarlayın. IPA ile durulayın ve N2 ile kurulayın. NOT: Asetonun gofret üzerinde kurumasına asla izin vermeyin. Son aseton sonikasyonundan sonra, hemen IPA ile durulayın ve ardındanN2 gazı ile kurulayın. Herhangi bir noktada gofret erken kurursa (IPA durulamasından önce), tüm fazla metal ve direncin çıkarılmaması ve asetonun bir kalıntı bırakması olasılığı vardır.</li>
	</ol></li>
	<li>Taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak katalizör şeklinin geometrisini kontrol edin. VACNF yongalarının SEM görüntülerini yakalamak için, sahneyi 30°'lik bir açıyla eğin ve ~100 pA ışın akımı ve ~5 mm çalışma mesafesi ile 1-3 kV'luk bir voltaj kullanın. NOT: Katalizör bir hokey diski (kompakt bir silindir) gibi görünmelidir (Şekil 4). Kompakt silindirin yüksekliği, silikon gofret üzerinde biriken Ni'nin kalınlığını yansıtmalıdır. Ni noktasının profili uzunsa ve üstte içbükey görünüyorsa, bir yanardağa benziyorsa (Şekil 4), katalizörün karbon nanofiberlerin9 dallanmasına neden olan çoklu Ni damlacıklarına ıslanma olasılığı daha yüksektir (Şekil 4 ve Şekil 5). Bu tür sorunlar, uzun biriktirme süreleri veya kaldırma prosedürüyle ilgili sorunlar nedeniyle metal buharlaşması sırasında dirençli erimeden kaynaklanabilir (Şekil 4 ve Şekil 5).</li>
	<li>Silikon gofreti dörde bölün ve asetilen/amonyak karışımı ile doğru akım plazma ile geliştirilmiş kimyasal buhar biriktirme odasına (dc-PECVD) yerleştirin. Nanoliflerin uzunluğunu ve konikliğini kontrol etmek için büyüme parametrelerini optimize edin (uçlar <200 nm).<ol><li>1-1,5 A akım ve 440-560 V voltaj aralığı kullanın. Lifleri büyütürken, makine ve alt tabaka 620 °C'ye kadar ısınırken amonyak akışlı bir ön işlem aşaması kullanın. Plazmayı çalıştırmadan önce karbon kaynağını (asetilen) 10 saniye açtığınızdan emin olun. NOT: PECVD makine çalışma parametrelerinin optimize edilmesi gerektiğinde çeyrek gofretler kullanılır. Uzunlukları 40 μm'den büyük ve uçları çapı 200 nm'den küçük olan lifler üretmek için aşağıdaki parametreler önerilmektedir: 130 nm'lik bir Ni katalizör kalınlığı ile 1.75 A'lık bir akım, 70 dakikalık büyüme süresi ve bir asetilen : dakikada 45 standart santimetreküp amonyak oranı (sccm): 100 sccm. 150 nm'lik bir Ni kalınlığında, 1.5 A'lık bir akım, 80 dakikalık bir büyüme süresi ve 48 sccm: 100 sccm'lik bir asetilen: amonyak oranı kullanın. Katalizör kalınlığından bağımsız olarak VACNF'leri büyütmek için aşağıdaki parametreleri kullanın: 620 °C büyüme sıcaklığı, plazma sırasında 10 torr basınç ve 20 mm duş başlığı yüksekliği (Şekil 6).</li>
	</ol></li>
	<li>Elde edilen fiberlerin geometrisini, 1 kV'luk bir ivme potansiyeli ile 30°'lik bir eğimde SEM kullanarak değerlendirin. NOT: Optimum lifler düz ve dallanmasız olacaktır. Ni katalizörünün kristal oryantasyonunu elektron ışını evaporatörü ile kontrol etmek imkansızdır. Sonuç olarak, katalizör ıslanması nedeniyle dallanan bazı lifler olacaktır9. Ayrıca, kristal oryantasyonu VACNF'lerin farklı yüksekliklere çıkmasına neden olur, bu nedenle tüm VACNF'lerde tek tip yükseklikler zordur.</li>
	<li>45 s boyunca 1000 rpm'de liflerin üzerine bir fotorezist tabakası (SPR955) eğrin. Ardından 1/4 gofreti bir küp kesme testeresi kullanarak 3 mm x 3 mm'lik diziler halinde doğrayın. Lifleri daha sonra kullanmak üzere bu noktada saklayın. NOT: Lifleri esnek bir alt tabakaya aktarmayı planlıyorsanız adım 1.11'i gerçekleştirmeyin.</li>
</ol>2.VACNF'lerin esnek bir alt tabakaya aktarılması (Şekil 7 ve Şekil 8)
<ol><li>Lifler sentezlendikten sonra, spincoat SU-8 2015, 45 s boyunca 4000 rpm'de gofretler veya çeyrek gofretler üzerine fotorezist.</li>
	<li>Gofretleri 95 °C'de 3 dakika yumuşak pişirin.</li>
	<li>Bir kontak hizalayıcı kullanarak, gofreti, 95 mJ/cm2'de elektron ışını litografisinden tanımlanan desenle hizalanan 3 mm 3 mm dizi desenli bir maske ile ortaya çıkarın. NOT: En uzun fiberden 20 μm daha büyük bir pozlama aralığına sahip bir yakınlık temas modu kullanın. İşlemin bu aşamasında liflerin devrilme olasılığı vardır.</li>
	<li>Maruz kaldıktan sonra 95 °C'de 6 dakika pişirin.</li>
	<li>Gofret'i SU-8 geliştiricisinde 15 saniye boyunca geliştirin, IPA ile durulayın ve gofreti yukarıdan aşağıya doğru hareket ettirerekN2 ile kurutun. NOT: Gofret geliştirirken, tamamen suya batırıldığından emin olun.</li>
	<li>45 s'de 3000 rpm'de ve 90 °C'de 30 s'de yumuşak fırında pişirmede koruyucu ince fotorezist tabakaya (SPR 955 CM 0.7) sahip spincoat desenli gofretler.</li>
	<li>İnce bir silikon oksit tabakasını, 100 ° C'de 22 döngü boyunca bir atomik katman birikimine yerleştirerek gofrete (2-3 nm) bırakın.</li>
	<li>Gofret'i 3 mm x 3 mm kareler halinde kesmek için bir küp kesme testeresi kullanın. Küp kesme testeresini gofret üzerinde önceden var olan desene hizalayın.</li>
	<li>3 kV ivme potansiyeli ile 30° eğimde SEM kullanarak elde edilen liflerin geometrisini değerlendirin.</li>
	<li>Cipsleri uzun süreli kullanım için saklıyorsanız burada durun (>1 hafta). Cipsleri karanlıkta saklayın.</li>
	<li>Esnek alt tabakaları sert alt tabakalardan ayırmak için, tek tek talaşları 30 dakika boyunca veya SU-8 kıvrılmaya başlayana kadar asetona yerleştirin.</li>
	<li>SU-8 filmlerini (sert alt tabakalara yapıştırılmış veya çıkarılmış) IPA ile 5 dakika ve ardından 5 dakika su ile yıkayın. Cipsleri taşırken yapışkan pedli ticari bir kutuya koyun.</li>
	<li>İSTEĞE BAĞLI: SU-8 filminin elyafsız tarafını suda çözünür bant üzerine veya ince polietilen tereftalat (PET) (12.5 μm kalınlığında) arkalıklı ince silikon kauçuğun üzerine yerleştirin.<ol><li>SU-8 filmini aktarmak için bir cımbız kullanın. Banda/silikon kauçuk-PET'e yapışmasına yardımcı olmak için SU-8 karesinin kenarlarına bastırın; Bu, liflerin kopmasını önlemek içindir. Bu noktada, VACNF filmleri hemen kullanıma hazırdır.</li>
		<li>Bir silikon kauçuk/PET tutucu hazırlamak için aşağıdakileri yapın: silikon kauçuk için 2 parçalı bir kit kullanarak iki parçayı (elastomer ve çapraz bağlayıcı) karıştırın. Ardından, bir kare PET kesin ve şeffaf plastik bir tabağa bantlayın. PET'in üzerine çok ince bir silikon kauçuk tabakası dökün ve 80 °C'de 1-2 saat kürleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sert bir substratta lifler kullanılarak bitki üzerinde yöntem (verilecek bir damla çözeltinin bir bitki yüzeyine yerleştirildiği) (Şekil 1A)
<ol><li>Kullanmadan önce aseton (%100, 5 dk), IPA (%100, 5 dk) ve ddH2O(5 dk) artımlı yıkamalarla fotorezisti çıkarın.</li>
	<li>Destek için saplanacak bitki dokusunu sert bir yüzeye yerleştirin.</li>
	<li>Bitki dokusunun yüzeyine 1 μL'lik bir damla boya veya DNA (200 ng) yerleştirin.</li>
	<li>Damlacığın üstüne, lifler damlacık ile temas edecek şekilde yönlendirilmiş olacak şekilde sert bir alt tabakaya sahip bir VACNF çipi yerleştirin. NOT: Talaşların yönü, gofretin "parlaklığı" ile belirlenebilir. Çipin parlak tarafında lifler vardır ve opak tarafında yoktur.</li>
	<li>Bir cımbızın düz tarafını kullanarak çipe dokunun. Çipin temas ettiği bitki alanını yumuşak uçlu bir işaretleyici kullanarak işaretleyin. Teslimattan sonra VACNF çiplerini çıkarın. NOT: Dokunulduğunda uygulanan kuvvet miktarı, kullanılan bitki dokusunun türüne bağlı olarak değişecektir. Liflerin kazığa oturtulmasından önce talaşlara dokunma alıştırması yapılması tavsiye edilir. Bitki dokularına zarar vermekten kaçının. Bitki dokusundaki VACNF çipinin ana hatları görüldüğünde hasar belirgindir.</li>
	<li>Kontroller için 3.1-3.5 arasındaki adımları tekrarlayın (+Boya/DNA, -Lifler; -Boya/DNA, +Lifler; ve -Boya/DNA, -Lifler). -Lifler, bir çipin lifsiz tarafıdır.</li>
	<li>Gerekirse bozulmamış bitkileri veya eksize edilmiş bitki organlarını uzun gün koşullarında (16 saat aydınlık, 8 saat karanlık) nemli odalarda saklayın. Eksize edilen organlar için, ıslak kağıt havlulu plastik bir Petri kabı kullanın.</li>
</ol>4. Çip üzerinde yöntem (burada verilecek bir çözelti damlası bir VACNF çipine yerleştirilir), sert alt tabaka (Şekil 1B)
<ol><li>Kullanmadan önce aseton (%100, 5 dk), IPA (%100, 5 dk) ve ddH2O(5 dk) artımlı yıkamalarla fotorezisti çıkarın.</li>
	<li>Sert substratlı VACNF çipinin fiber tarafına 1 μL boya damlası veya plazmit DNA (200 ng) damlatın. Damlacığı çipin ortasına yerleştirdiğinizden ve birkaç lifi kapladığınızdan emin olun. Damlacığı 15 dakika kurumaya bırakın. NOT: Talaşların yönü, gofretin "parlaklığı" ile belirlenebilir. Çipin parlak tarafında lifler vardır ve opak tarafında yoktur.</li>
	<li>Yapraklar veya diğer eksize edilmiş organlarla çalışırken, bunları sert bir yüzeyin üzerine yerleştirin. Bozulmamış bitkilerle çalışırken, VACNF'lerin uygulandığı organın altına sert bir yüzey yerleştirin.</li>
	<li>15 dakikalık kurutma adımından sonra, VACNF çipini lif tarafı bitki dokusu ile temas edecek şekilde konumlandırın. Bir cımbızın arka ucuyla çipe dokunun. NOT: Dokunulduğunda uygulanan kuvvet miktarı, kullanılan bitki dokusunun türüne bağlı olarak değişecektir. Çiplere dokunma alıştırması yapmanız önerilir.</li>
	<li>Tesis üzerinde yöntemin 3.6-3.7 adımlarını tekrarlayın.</li>
</ol>5. SU-8 filmlerindeki VACNF'lerin çip üzerinde yöntemle bitki dokusuna uygulanması (Şekil 1C)
<ol><li>SU-8 filmin elyaf tarafına 1 μL damla boya veya DNA (200 ng) yerleştirin ve 10 dakika kurumasını bekleyin. Damlacığı çipin ortasına yerleştirdiğinizden emin olun. NOT: Kullanılan alt tabakaya bağlı olarak farklı kuruma süreleri vardır.</li>
	<li>Bir çift keskin cımbız kullanarak VACNF filmini bitki yüzeyine yerleştirin. NOT: SU-8 filmleri havada ne kadar uzun süre kalırsa, filmler o kadar kırılgan hale gelir. SU-8 filmlerinin kaybolma riskini sınırlamak için, tüm tesislerin/numunelerin ve ekipmanların SU-8 filmlerinin yakınında bulunduğundan emin olun.</li>
	<li>Küçük bir makyaj aplikatörünü VACNF filminin üzerine nazikçe yuvarlayın. Esnek alt tabakaların yerleştirildiği alanları yumuşak uçlu bir işaretleyici ile işaretleyin. Esnek alt tabakaları bant kullanarak bitki yüzeyinden çıkarın. NOT: Makyaj aplikatörünü yuvarlarken uygulanan kuvvet miktarı, kullanılan bitki dokuları arasında değişecektir. Biyomolekül veya boya dağıtımını gerçekleştirmeden önce VACNF filmlerini uygulama alıştırması yapın. Bitki dokularında gözle görülür hasar, bitki dokusundaki VACNF filminin ana hatları görüldüğünde belirgindir.</li>
	<li>Kontroller için 5.1-5.3 adımlarını tekrarlayın ve bitkileri tesis üzerinde yöntemin 3.7 adımında belirtildiği gibi saklayın.</li>
</ol>6. Tüm dağıtım yöntemleri için mikroskopi ve görüntü analizi
<ol><li>Teslim edilen floresan probu/raportör için uygun emisyon ve uyarma dalga boylarını kullanarak bir konfokal mikroskop kullanarak numuneleri görüntüleyin. NOT: Geçici dönüşüm için gereken süre, bitki türüne ve verilen işaretleyiciye göre değişir. Örneğin, floresan belirteçlerin ekspresyonu Arabidopsis'te 48 saat sonra, marul yapraklarında96 saat sonra tespit edildi 7.</li>
	<li>Görüntüleme yaparken, lifleri kopmuş bir bölgeye odaklanmaya çalışın. Liflerin farklı yönleri olacaktır. Teslimatın başarısı, kopmuş liflerin görünümüne bağlı değildir. NOT: Lifler, PECVD18'deki lif oluşumundan kaynaklanan silisyum nitrür tabakasının oluşumu nedeniyle en yaygın uyarma/emisyon ayarlarıyla floresan olacaktır.</li>
	<li>Her örnek için en az 5 görüntü yakalayın. Ortaya çıkan sinyal değişecektir.</li>
	<li>ImageJ19 kullanarak floresan değerlerini 20 μm x 20 μm konfokal görüntü alanlarında7 toplam floresan (entegre yoğunluk) olarak ölçün.</li>
</ol>

Bitkilere verimli biyomolekül ve boya iletimi için karbon nanofiber dizilerinin kullanılması

<ol>
	<li>Canto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+expression+systems+in+plants:+potentialities+and+constraints.">Transient expression systems in plants: potentialities and constraints.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 896, 287-301 (2016).</li><li>Gou, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+protoplast+transient+expression+system+for+gene+functional+studies+in+strawberry+(Fragaria+vesca).">Optimization of the protoplast transient expression system for gene functional studies in strawberry (Fragaria vesca).</a> Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 141, 41-53 (2020).</li><li>Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+and+agriculture:+Opportunities+and+challenges.">Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 149, 1-26 (2017).</li><li>Ren, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+protoplast+isolation+and+transient+expression+system+for+functional+characterization+of+flowering+related+genes+in+Cymbidium+orchids.">Highly efficient protoplast isolation and transient expression system for functional characterization of flowering related genes in Cymbidium orchids.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2264 (2020).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanovehicles+for+plant+modifications+towards+pest-and+disease-resistance+traits.">Nanovehicles for plant modifications towards pest-and disease-resistance traits.</a> Trends in Plant Science. 25 (2), 198-212 (2020).</li><li>Davern, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+nanofiber+arrays:+a+novel+tool+for+microdelivery+of+biomolecules+to+plants.">Carbon nanofiber arrays: a novel tool for microdelivery of biomolecules to plants.</a> PLoS One. 11 (4), e0153621 (2016).</li><li>Morgan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+broadly+applicable+method+for+transient+transformation+of+plants+using+vertically+aligned+carbon+nanofiber+arrays.">An efficient and broadly applicable method for transient transformation of plants using vertically aligned carbon nanofiber arrays.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1051340 (2022).</li><li>Melechko, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertically+aligned+carbon+nanofibers+and+related+structures:+Controlled+synthesis+and+directed+assembly.">Vertically aligned carbon nanofibers and related structures: Controlled synthesis and directed assembly.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 97, 041301 (2005).</li><li>Melechko, A. V., Desikan, R., McKnight, T. E., Klein, K. L., Rack, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+vertically+aligned+carbon+nanofibres+for+interfacing+with+live+systems.">Synthesis of vertically aligned carbon nanofibres for interfacing with live systems.</a> Journal of Physics D: Applied Physics. 42 (19), 193001 (2009).</li><li>Nelson-Fitzpatrick, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Novel Materials for the Design of Cantilever Transducers [dissertation]. , (2011).</li><li>Fletcher, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+flexible+arrays+of+vertically+aligned+carbon+nanofiber+electrodes+to+temperature-sensitive+substrates.">Transfer of flexible arrays of vertically aligned carbon nanofiber electrodes to temperature-sensitive substrates.</a> Advanced Materials. 18 (13), 1689-1694 (2006).</li><li>Keller, S., Blagoi, G., Lillemose, M., Haefliger, D., Boisen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+thin+SU-8+films.">Processing of thin SU-8 films.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (12), 125020 (2008).</li><li>Wouters, K., Puers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusing+and+swelling+in+SU-8:+insight+in+material+properties+and+processing.">Diffusing and swelling in SU-8: insight in material properties and processing.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 20 (9), 095013 (2010).</li><li>Jamal, M., Zarafshar, A. M., Gracias, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+photo-crosslinked+polymers+enable+self-assembling+microfluidics.">Differentially photo-crosslinked polymers enable self-assembling microfluidics.</a> Nature Communications. 2, 527 (2011).</li><li>Williams, R., Goodman, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wetting+of+thin+layers+of+SiO2+by+water.">Wetting of thin layers of SiO2 by water.</a> Applied Physics Letters. 25 (10), 531-532 (1974).</li><li>Kundu, A., Nogueira Campos, M. G., Santra, S., Rajaraman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+vascular+delivery+of+agrochemicals+with+micromilled+microneedles+(&#181;MMNs).">Precision vascular delivery of agrochemicals with micromilled microneedles (&#181;MMNs).</a> Scientific Reports. 9, 14008 (2019).</li><li>Acanda, Y., Welker, S., Orbovi&#263;, V., Levy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+efficient+agroinfiltration+method+for+transient+gene+expression+in+Citrus.">A simple and efficient agroinfiltration method for transient gene expression in Citrus.</a> Plant Cell Reports. 40 (7), 1171-1179 (2021).</li><li>Pearce, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+properties+of+SiNx+coatings+as+stable+fluorescent+markers+on+vertically+aligned+carbon+nanofibers.">Synthesis and properties of SiNx coatings as stable fluorescent markers on vertically aligned carbon nanofibers.</a> AIMS Materials Science. 1 (2), 87-102 (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Crafts, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+in+plants.">Translocation in plants.</a> Plant Physiology. 13 (4), 791 (1938).</li><li>Martens, H. J., Hansen, M., Schulz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caged+probes:+a+novel+tool+in+studying+symplasmic+transport+in+plant+tissues.">Caged probes: a novel tool in studying symplasmic transport in plant tissues.</a> Protoplasma. 223, 63-66 (2004).</li><li>Liu, J., Essner, J., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+supercapacitor+based+on+coaxially+coated+manganese+oxide+on+vertically+aligned+carbon+nanofiber+arrays.">Hybrid supercapacitor based on coaxially coated manganese oxide on vertically aligned carbon nanofiber arrays.</a> Chemistry of Materials. 22 (17), 5022-5030 (2010).</li><li>Saleem, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+temperature+and+cost-effective+growth+of+vertically+aligned+carbon+nanofibers+using+spin-coated+polymer-stabilized+palladium+nanocatalysts.">Low temperature and cost-effective growth of vertically aligned carbon nanofibers using spin-coated polymer-stabilized palladium nanocatalysts.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 16, 015007 (2015).</li><li>Merkulov, V. I., Lowndes, D. H., Wei, Y. Y., Eres, G., Voelkl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+growth+of+individual+and+multiple+vertically+aligned+carbon+nanofibers.">Patterned growth of individual and multiple vertically aligned carbon nanofibers.</a> Applied Physics Letters. 76 (24), 3555-3557 (2000).</li><li>Retterer, S. T., Melechko, A., Hensley, D. K., Simpson, M. L., Doktycz, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+control+of+catalyst+nanoparticles+for+the+synthesis+of+high+density+carbon+nanofiber+arrays.">Positional control of catalyst nanoparticles for the synthesis of high density carbon nanofiber arrays.</a> Carbon. 46 (11), 1378-1383 (2008).</li><li>Rooks, M. J., Wind, S., McEuen, P., Prober, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+30-nm-scale+structures+for+electron+transport+studies+using+a+polymethylmethacrylate+bilayer+resist.">Fabrication of 30-nm-scale structures for electron transport studies using a polymethylmethacrylate bilayer resist.</a> Journal of Vacuum Science &amp; Technology B: Microelectronics Processing and Phenomena. 5 (1), 318-321 (1987).</li><li>Lee, G., Sohn, D. K., Seok, S. H., Ko, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+hole+density+variation+in+the+PECVD+reactor+showerhead+on+the+deposition+of+amorphous+carbon+layer.">The effect of hole density variation in the PECVD reactor showerhead on the deposition of amorphous carbon layer.</a> Vacuum. 163, 37-44 (2019).</li><li>Fowlkes, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+catalyst+particle+crystallographic+orientation+in+vertically+aligned+carbon+nanofiber+synthesis.">Control of catalyst particle crystallographic orientation in vertically aligned carbon nanofiber synthesis.</a> Carbon. 44 (8), 1503-1510 (2006).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu yazıda, dikey olarak hizalanmış karbon nanolif dizileri oluşturma, lifleri esnek bir alt tabakaya aktarma ve bitkilere biyomoleküllerin veya boyaların verilmesinde kullanılmak üzere bitkilere sert veya esnek bir alt tabakadaki lifleri uygulama yöntemlerini sunduk. Eklenen malzemelerin biriktirilmesi için çip üstü ve tesis üstü yöntemler olmak üzere iki genel yaklaşım tanımladık ve sert bir substrat üzerindeki liflerde ve VACNF filmleri kullanan çip üzerinde yöntemde başarılı sonuçlar gösterdik. Bu liflerin uygulanması, pratikte ve teoride geleneksel bitki dönüşüm yöntemlerinden (parçacık bombardımanı, PEG veya elektroporasyon yoluyla protoplast dönüşümü) daha basittir ve Agrobacterium aracılı dönüşüme karşı inatçı bitkiler için kullanılabilir. Bununla birlikte, yalnızca birkaç hücre dönüştürülür.
Dikey olarak hizalanmış karbon nanofiberler, kullanıcı programları aracılığıyla Oak Ridge Ulusal Nanofaz Malzeme Bilimleri Laboratuvarı Merkezi'nde üretildi. Kullanıcılar, VACNF'lerin üretimi için bu tesisi kullanmak için başvurabilirler. Alternatif olarak, VACNF yongaları, karbon kaynağı22,23 olan doğru akım plazma ile geliştirilmiş kimyasal buhar biriktirme makinelerine sahip temiz odalarda üretilebilir. Açıklanan yöntemlerle, liflerin üretimi, lif transferi ve VACNF çiplerinin/filmlerinin uygulanması için kritik olan birkaç adım vardır. Lif uygulamasının işe yaraması için, liflerin düz olması ve bitki hücrelerinde başarılı olması için uçta <200 nm'lik bir sivriltme çapına sahip olması gerekir 6,7 (Şekil 3). Belirli boyut ve aralıkta karbon nanofiberler oluşturmak için, nokta boyutu, yanal adım ve biriken katalizör miktarı dahil olmak üzere değiştirilebilen çeşitli parametreler vardır. Karbon nanolif üretimi için kullanılacak en uygun nokta boyutunu seçmek için, lifler çeşitli nokta boyutlarından büyütüldü (Şekil 5'te gösterildiği gibi). 300 nm çapların en iyi lifleri ürettiğini bulduk, bu nedenle bu nokta boyutu seçildi (Şekil 5). Doğru parametreleri bulduktan sonra, ideal geometriye (düz ve uç çapı <200 nm) sahip liflerin %>50'sine sahip çipler kullanmaya çalıştık. Liflerin geometrisini kontrol etmek için, bir VACNF çipi/filmi örneği üzerinde rastgele görüş alanlarını görüntülemek için taramalı elektron mikroskobu kullandık.
Ek olarak, bitki hücreleri içinde teslimatı sağlamak için liflerin belirli bir minimum uzunluğa sahip olması gerekir. Farklı uzunluklarda lifler üretmenin önemi, daha derin doku katmanlarına nüfuz etmek için daha uzun liflerin kullanılabilmesidir. Daha uzun lifler (>40 μm uzunluğunda) esnek filmler için gereklidir, çünkü lif transferi, lifleri tabanlarından kopararak çalışır ve liflerin üzerine SU-8 katmanlamasını gerektirir. Bu protokol için kullanılan SU-8 tabakasının çalışma kalınlığı 20-35 μm'dir. Çeşitli bitkilerin (kavisli veya düz) epidermisi içinde doğumu gerçekleştirmek için gereken minimum yükseklik 10-15 μm 6,7'dir. Sonuç olarak, VACNF filmler için >40 μm uzunluğunda lifler gereklidir. Karbon nanolifleri üretirken göz önünde bulundurulması gereken birkaç farklı parametre vardır: katalizör malzemesi, katalizör geometrisi, katalizör malzemesinin kalınlığı ve ayrıca PECVD odasındaki koşullar (gaz oranı, basınç, sıcaklık, akım, duş başlığı yüksekliği ve büyüme süresi)8,9,24,25. Morgan ve ark.7 ve Davern ve ark.6 tarafından kullanılan 25 μm'den daha uzun karbon nanolifleri üretmek için Ni katalizörü miktarını artırdık, asetilen: amonyak oranını değiştirdik ve akım ve büyüme süresini artırdık. Ek olarak, katalizör malzemesinin geometrisine daha fazla dikkat ettik. Uzun düz lifler üretmek için, biriken katalizörün bir yanardağa benzeyen bir şekilden ziyade bir hokey diski şekline sahip olması gerekiyordu (Şekil 4). Volkan yapıları, kalkıştan sonra fotorezist kalıntılarından ortaya çıkar. Volkanların oluşumunu önlemek için, elektron ışını litografisi26 sırasında bir alt kesim oluşturmak için çift katmanlı bir PMMA kullanıldı. Alttan kesme, biriken metal katalizörün kaldırılmasına yardımcı olur (Şekil 2). Katalizörün kalın tabakası, uzun VACNF'lerin büyümesi için önemlidir. VACNF'lerin morfolojisi Merkulova ve ark.24 tarafından incelenmiştir. VACNF'lerin dikey hizalanması, hem Ni katalizör ucu tipi büyümeden hem de DC potansiyelinin substrata dik hizalanmasından kaynaklanmaktadır (Şekil 6). Duş başlığı, PECVD reaktörünün geometrisini tanımlar (Şekil 6) ve elektrik alanı27 potansiyeli için kaynak görevi görür.
Elektron ışını litografisi ile katalizör noktaları dizisini tanımlamak için, bir elektron ışını direnci (polimetil metakrilat) uyguladık, ardından dirençte belirli bir şekle sahip ve gofret üzerinde belirli konumlarda küçük delikler açmak için e-ışını kullandık. İstenilen çaptaki delikler, tanımlanan aralık (adım) ile düzenli bir ızgaraya yerleştirildi ve alt tabaka makineye yüklenmeden önce elektron ışını litografi aracına istenen deseni belirten bir dosya yüklendi. Lif yüksekliğine ek olarak, başarılı lif transferi için bir diğer kritik parametre de aseton banyosunda geçirilen süredir. VACNF filmlerinin, kenarları kıvrılmaya başlayacak kadar uzun süre aseton banyosunda bırakılması gerekir; Aseton banyosunda çok az süre bırakılırlarsa, talaşları kaldırmak daha zordur ve kırılabilirler. Cipsler ne kadar eskiyse, aseton banyosunda o kadar uzun süre kalmaları gerekecektir. Aseton banyosunu takiben, filmler/yongalar, erişim asetonunu çıkarmak ve lifler üzerindeki koruyucu fotorezisti çıkarmak için izopropanol ve suya yerleştirildi.
Sıkma kaplaması yapmak için, gofretler veya yonga plakası parçaları, sıkma kaplayıcıdaki bir vakumlu aynaya yerleştirilir ve gofretin merkezi konumu, sıkma kaplayıcının test fonksiyonu kullanılarak doğrulanır. Gofretin merkezine küçük bir su birikintisi (~2,5 cm çapında) direnç uygulanır ve eğrilir (45 s için 3000 rpm) Spin kaplamadan önce ve sonra liflerin görüntüleri, lif geometrisinin (yükseklik, yönlendirme ve eğim) korunmasını gösteren Şekil 8'de yer almaktadır. Liflerin varlığı, liflerin tabanında yükselmeye neden olur ve beklenenden daha kalın tabakalara neden olur. VACNF büyümesinden sonra spin-kaplama diğer gruplar tarafından araştırılmıştır11,18.
Süreç içinde hayati öneme sahip bir diğer adım, VACNF çiplerine/filmlerine doğru miktarda kuvvet uygulanmasını sağlamaktır. Dağıtım mekanizması, cımbızın itme kuvveti yoluyla hücre duvarlarında küçük delikler açanliflere, sert alt tabakalara 6,7 dokunmasına veya esnek alt tabakalar üzerinde mini makyaj aplikatörü ile yuvarlanmasına bağlıdır. Lifler kopabilir veya kırılmayabilir ve sonuç üzerinde herhangi bir etkisi olmadan bitki hücrelerine6,7 gömülü kalabilir, ancak basıncı doğru elde etmek için boya alımı ve doku hasarı muayenesi ile birlikte pratik yapmak gerekir. Ek olarak, saptanabilir ekspresyon süresi bitki türleri ve verilen vektör türleri arasında değiştiğinden, VACNF çipleri/filmleri ile DNA dağıtımından sonra uygun görüntüleme zaman noktalarının seçilmesi önemlidir7 (Şekil 16).
Bu yöntem bitkilere geniş çapta uygulanabilir olduğu kadar, birkaç sınırlaması vardır. Örneğin, VACNF filmlerine ince bir silikon oksit tabakası eklemek, SU-8'in üzerine eklenen koruyucu fotorezist tabakası nedeniyle filmlerin her zaman tamamen hidrofilik olmasına neden olmaz. Bu sorun ortaya çıkarsa, VACNF'lere daha kalın silikon oksit katmanları uygulanabilir. Filmlerin hidrofobik mi yoksa hidrofilik mi olduğunu test etmek için suya yerleştirilebilirler. Filmler batarsa hidrofiliktir, yüzerse hidrofobiktir. Ek olarak, üretilen elyaf partileri arasında farklılıklar olabilir. dc -PECVD makinesinde lifleri büyütürken değiştirilebilecek birkaç parametre vardır; Bu protokolde açıklanan, iki farklı miktarda Ni katalizörü için bir dizi parametredir. Ek olarak, Ni katalizörünün kristal oryantasyonu28 kontrol edilemez ve bazı dallanmalar kaçınılmaz olarak liflerle sonuçlanacaktır.
Bu makale için hem sert hem de esnek substratlar kullanarak bitki hücrelerine floresein boyası ve DNA'nın verilmesini göstermiş olsak da, yöntem diğer biyomoleküller ve genetik modifikasyon yaklaşımları için geniş ölçüde uygulanabilir olmalıdır, örneğin, elma gibi bitki sistemleri için RNAi susturma veya kararlı transgenik hatların üretilmesinin yıllar alacağı diğer meyveler. Ayrıca, bu lifler genetik düzenleme materyalleri sağlamak veya bitkilerde kararlı dönüşümler için de kullanılabilir.

Bitki dönüşümü (hem geçici hem de kararlı) henüz tüm bitki dokularında ve türlerinde yaygın olarak elde edilebilir hale gelmemiştir. Bitkilerin geçici dönüşümü, plazmitlerde kodlanan genlerin geçici olarak bitkilere sokulduğu, ancak genoma kararlı bir şekilde dahil edilmediği bir süreçtir. Protoplastların partikül bombardımanı, Agrobakteri, elektroporasyon veya polietilen glikol tedavisini kullanan geleneksel yöntemler yavaştır veya hantal olabilir. Ayrıca, her bitki türüiçin geçerli değildirler 1,2,3,4. DNA iletimi için nanomalzemelerin kullanımı, henüz emekleme aşamasında olan gelişen bir alandır5. Nanomalzemeler, özellikle karbon nanolifleri, yara tepkisine neden olmadan bitki yapraklarına proteinler, dekstranlar ve boyalar vermek için başarıyla kullanılmıştır6. Bu çalışmanın amacı, bitkilere biyomoleküller veya boyalar vermek için bir tür nanomalzeme olan karbon nanofiberlerin kullanılması için ayrıntılı bir protokol sağlamaktır. Burada, çeşitli bitki organlarındaki hücrelerin geçici dönüşümüne izin veren, tercih edilen biyomolekül olarak DNA'ya odaklanıyoruz.
Daha önce, Morgan ve ark.7 , marul, N. benthamiana ve kavak yapraklarını ve Arabidopsis'in hem yapraklarını hem de köklerini geçici olarak dönüştürmek için sert silikon substrata yapıştırılmış karbon nanofiberlerin kullanımını gösterdi. Dönüşümler çeşitli organlarda başarılı olmasına rağmen, liflerin kökler veya meyveler gibi kavisli yüzeylere sahip bitki dokularına uygulanması daha zordu. Nanolifler için esnek bir desteğin, organın şekline daha iyi uyarak dağıtım verimliliğini artırabileceğini düşündük.
Burada, dikey olarak hizalanmış karbon nanofiberlerin üretilmesi ve tasarlanması, VACNF'lerin esnek substratlara aktarılması ve biyomoleküller ve boyalar sağlamak için bitkilere hem sert hem de esnek substratlar üzerinde VACNF'lerin uygulanması için kullanılan yöntemleri detaylandırıyoruz. Karbon nanolifler, Ni katalizörü ile doğru akım katalitik plazma ile geliştirilmiş kimyasal buhar biriktirme (dc C-PECVD) kullanılarak üretildi. Ni katalizör noktalarının konumu, çapı ve yüksekliği, Melechko ve ark.8,9 tarafından tarif edildiği gibi elektron ışını litografisi, metal buharlaştırma ve kaldırma işlemlerinin bir kombinasyonu kullanılarak kontrol edildi. Çift katmanlı bir e-ışın direnci kullanılarak, daha uzun lifler10 vermek için alt tabaka üzerinde daha kalın bir Ni katalizörü biriktirilebilir. Sert bir alt tabakadan esnek bir alt tabakaya lif transferi, Fletcher ve ark.11'de açıklanan yöntemlerin bir modifikasyonuna dayanır ve mevcut yöntemler, amorf bir karbon tabakasının veya kurban edilen bir fotorezist tabakanın kullanılmasından önce gelir. Elyaf transferi ile SU-8 kaldırma, SU-812,13,14'ün az pişirilmesi ve az maruz bırakılmasından kaynaklanan içsel gerilme gerilimi kullanılarak elde edilir. Karmaşık bir polimer olan SU-8, doğal olarak hidrofobiktir, bu da DNA dağıtımını kolaylaştırmak için kullanımını zorlaştırır. SU-8'in hidrofobik doğasına karşı koymak için, lifler SU-8'e gömüldükten sonra atomik katman biriktirme15 yoluyla ince bir silikon oksit tabakası uyguluyoruz. Liflerin biyomolekül/boya dağıtımı için sert bir substrat üzerine uygulanması, Davern ve ark.6'da açıklanan cımbızla dokunmanın darbe kuvvetini ve Morgan ve ark.7'de açıklanan tesis içi ve çip üstü yöntemleri kullanır. Esnek VACNF filmleri, Morgan ve ark.7'ninçip üzerinde yönteminde olduğu gibi, önce film üzerindeki DNA veya boya damlacıklarının yarı kurutulması ve ardından küçük bir makyaj aplikatörü16,17 kullanılarak filmlerin kavisli bitki yüzeyleri üzerinde yuvarlanmasıyla kavisli bitki yüzeylerine uygulanır. Şekil 1, sert ve esnek substratlardaki liflerin bitkilere uygulanması için çeşitli yaklaşımları göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13&#34; x 13&#34; White 1/4-fold heavy duty Brawny industrial shop towel 70Ct</td>
			<td>Fastenal&#160;</td>
			<td>690535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol (IPA)&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; Lid</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-401-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#34; tray</td>
			<td>Entegris</td>
			<td>H22-40-0615</td>
			<td>Wafer Carriers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accretech SS10 dicing saw</td>
			<td>Accreteck</td>
			<td>SS10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A18-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>9005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apples</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arabidopsis thaliana&#160;</td>
			<td>Seeds of accession Columbia from the laboratory of Professor Jean Greenberg at the University of Chicago</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon direct current plasma enhanced chemical vapor deposition machine</td>
			<td>Oak Ridge National Laboratory&#160;</td>
			<td>Custom-built</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cobham Green lettuce&#160;</td>
			<td>Seeds from the laboratory of Professor Richard Michelmore at the University of California, Davis</td>
			<td>No product number</td>
			<td>Butterhead lettuce</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein dye</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2456-2.5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel-box&#160;</td>
			<td>Gel-Pak</td>
			<td>&#160;AD-23C-00-X4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberg DWL 66 direct-write lithography tool&#160;</td>
			<td>Heidelberg</td>
			<td>DWL 66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institues of Health&#160;</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoproponal (IPA) used in the cleanroom at ORNL</td>
			<td>Doe and Ingalls</td>
			<td>CMOS Grade 9079-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JEOL 9300FS 100kV electron beam lithography system</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional 34120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kord-Valmark disposable polystyrene petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>11019-554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Layout Editor&#160;</td>
			<td>&#160;juspertor GmbH</td>
			<td>No product number&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Make-up applicator&#160;</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>G2PLUS</td>
			<td>500 PCS Disposable Micro Applicators Brush for Makeup and Personal Care (Head Diameter: 1.5 mm)- 5 x 100 PCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Merlin field emission scanning electron microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Merlin</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIBK/IPA&#160; (methyl isobutyl ketone/isopropanol) (1:3)</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M089025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Onions</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxford FlexAl atomic layer deposition</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>FlexAl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 495 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M130004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMMA 950 A4</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>M230004</td>
			<td>Can dilute down to A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene terephthalate (PET)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>KS-6304-21-11</td>
			<td>Type D Clear PET (Polyester) Sheet .0005&#34; Thick x 27&#34; Width x 10 Ft Length 1 pc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers</td>
			<td>Aven Inc.&#160;</td>
			<td>18032TT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pUBQ10:YFP-GW</td>
			<td>Arabidopsis Biological Resource Center</td>
			<td>CD3-1948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon etcher (used for descum)&#160;</td>
			<td>Oxford</td>
			<td>Plasmalab</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon rubber kit</td>
			<td>Smooth-On Inc</td>
			<td>Ecoflex 00-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafers</td>
			<td>Pure Wafer</td>
			<td>4N0.001-.005SSP-INV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater</td>
			<td>Brewer Sciences</td>
			<td>Model 100CB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPR 955cm 0.7&#160;</td>
			<td>Megaposit</td>
			<td>10018314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strawberries</td>
			<td>Grocery store</td>
			<td>No product number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2015</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Toxic. Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Microchem</td>
			<td>SU-8 2000 Series</td>
			<td>Handle with care. Wear chemical goggles, chemical gloves and suitable protective clothing when handling SU-8 2000 resists. Do not get into eyes, or onto skin or clothing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suss MicroTec contact aligner</td>
			<td>Suss MicroTec</td>
			<td>MA6/BA6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table top microscope</td>
			<td>Phenom XL</td>
			<td>used for checking Ni catalysts after metal deposition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermionics VE-240 e-beam evaporator</td>
			<td>Thermionics</td>
			<td>VE-240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using vertically aligned carbon nanofiber arrays on rigid or flexible substrates for delivery of biomolecules and dyes to plants

Biyomoleküllerin ve geçirimsiz boyaların bozulmamış bitkilere verilmesi büyük bir zorluktur. Nanomalzemeler, DNA'nın bitkilere verilmesi için gelecek vaat eden araçlardır. Bu yeni araçlar ne kadar heyecan verici olsa da, henüz yaygın olarak uygulanmadılar. Sert substrat (destek) üzerinde üretilen nanomalzemelerin kavisli bitki yapılarına başarılı bir şekilde uygulanması özellikle zordur. Bu çalışma, dikey olarak hizalanmış karbon nanofiber dizilerinin mikrofabrikasyonu ve bunların sert bir alt tabakadan esnek bir alt tabakaya aktarılması sürecini açıklamaktadır. Bu liflerin (sert veya esnek substratlar üzerinde) bitkilere geçici dönüşüm veya boya (örneğin floresein) iletimi için nasıl kullanılabileceğini detaylandırıyor ve gösteriyoruz. Esnek VACNF dizileri oluşturmak için VACNF'lerin sert silikon alt tabakadan esnek bir SU-8 epoksi alt tabakaya nasıl aktarılabileceğini gösteriyoruz. SU-8'in hidrofobik doğasının üstesinden gelmek için, esnek filmdeki lifler ince bir silikon oksit tabakası (2-3 nm) ile kaplandı. Bu lifleri kavisli bitki organlarına vermek için kullanmak için, VACNF filmlerinin lif tarafına 1 μL'lik bir damla boya veya DNA çözeltisi bırakıyoruz, 10 dakika bekliyoruz, filmleri bitki organına yerleştiriyoruz ve lifleri bitki hücrelerine sürmek için yuvarlanma hareketiyle bir çubuk kullanıyoruz. Bu yöntem ile kıvrımlı yüzeylere sahip bitki organlarında boya ve DNA iletimi elde ettik.

Plant transformation (both transient and stable) has yet to become widely achievable in all plant tissues and species. The transient transformation of plants is a process by which genes encoded in plasmids are temporarily introduced into plants but are not stably incorporated into the genome. Traditional methods that use particle bombardment, Agrobacteria, electroporation, or polyethylene glycol treatment of protoplasts are slow or can be cumbersome. Furthermore, they are not applicable to every plant species1,2,3,4.&#160;The use of nanomaterials for DNA delivery is a burgeoning field that is still in its infancy5. Nanomaterials, specifically carbon nanofibers have also successfully been used to deliver proteins, dextrans and dyes to plant leaves without causing wound response6. The goal of this work is to provide a detailed protocol for using one type of nanomaterial, carbon nanofibers, for delivering biomolecules or dyes to plants. Here, we focus on DNA as the biomolecule of choice, which permits the transient transformation of cells in various plant organs.
Previously, Morgan et al.7 demonstrated the use of carbon nanofibers affixed to rigid silicon substrate to transiently transform leaves of lettuce, N. benthamiana, and poplar, and both leaves and roots of Arabidopsis. Although transformations were successful on a variety of organs, fibers were more difficult to apply to plant tissues with curved surfaces, such as roots or fruits. We reasoned that a flexible backing for nanofibers might improve their efficiency of delivery by conforming better to the shape of the organ.
Herein, we detail methods utilized for fabricating and designing vertically aligned carbon nanofibers, transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants to deliver biomolecules and dyes. Carbon nanofibers were produced using direct current catalytic plasma-enhanced chemical vapor deposition (dc C-PECVD) with Ni catalyst. The position, diameter, and height of Ni catalyst dots were controlled using a combination of electron beam lithography, metal evaporation, and lift-off processes as described by Melechko et al.8,9. Using a double-layer e-beam resist, a thicker Ni catalyst can be deposited on the substrate to give longer fibers10. Fiber transfer from a rigid to a flexible substrate is based on a modification of methods described in Fletcher et al.11, with the current methods foregoing the use of an amorphous carbon layer or a sacrificial photoresist layer. SU-8 lift-off with fiber transfer is achieved by utilizing the intrinsic tensile stress resulting from underbaking and underexposing the SU-812,13,14. SU-8, a complex polymer, is naturally hydrophobic, which makes its use for facilitating DNA delivery difficult. To counteract the hydrophobic nature of SU-8, we apply a thin layer of silicon oxide via atomic layer deposition15 after fibers are embedded in SU-8. Application of fibers on a rigid substrate for biomolecule/dye delivery utilizes the impact force of tweezer tapping described in Davern et al.6 and the on-plant and on-chip methods described in Morgan et al.7. Flexible VACNF films are applied to curved plant surfaces by first semidrying DNA or dye droplets on the film as with the on-chip method from Morgan et al.7and then rolling the films on curved plant surfaces using a small makeup applicator16,17. Figure 1 depicts various approaches for applying fibers in rigid and flexible substrates to plants.

Yazar Spotlight: Karbon Nanofiber Dizilerle İnovasyon Yaparak Tesis Dönüşümünün Kilidini Açmak 

Biyomoleküllerin ve boyaların bitkilere verilmesi için sert veya esnek substratlar üzerinde dikey olarak hizalanmış karbon nanofiber dizilerinin kullanılması

We are trying to demonstrate a general method for delivery of dye or DNA into plants using carbon nanofiber arrays. Many plants are recalcitrant to traditional transformation methods. Our method can solve this problem using carbon nanofiber arrays on flexible rigid substrates.Our technique is fast and user-friendly. It can be applied to virtually any plant species or plant organ. It can also be used to deliver other reagents such as dyes and proteins.

Watch this Scientific Journal Video about Unlocking Plant Transformation by Innovating with Carbon Nanofiber Arrays at JoVE.com

Burada, dikey olarak hizalanmış karbon nanofiberlerin (VACNF'ler) mikrofabrikasyon edilmesi, VACNF'lerin esnek substratlara aktarılması ve VACNF'lerin biyomolekül ve boya dağıtımı için bitkilere hem sert hem de esnek substratlar üzerinde uygulanması için yöntemleri açıklıyoruz.

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to ...

Karbon nanofiber dizileri kullanarak boya veya DNA'nın bitkilere verilmesi için genel bir yöntem göstermeye çalışıyoruz. Birçok bitki geleneksel dönüşüm yöntemlerine karşı inatçıdır. Yöntemimiz, esnek sert yüzeyler üzerinde karbon nanofiber dizileri kullanarak bu sorunu çözebilir.Tekniğimiz hızlı ve kullanıcı dostudur. Hemen hemen her bitki türüne veya bitki organına uygulanabilir. Boyalar ve proteinler gibi diğer reaktifleri vermek için de kullanılabilir.

using-vertically-aligned-carbon-nanofiber-arrays-on-rigid-or-flexible

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Using Vertically Aligned Carbon Nanofiber Arrays on Rigid or Flexible Substrates for Delivery of Biomolecules and Dyes to Plants

924 Görüntüleme.  The University of Chicago. Karbon nanofiber dizileri kullanarak boya veya DNA'nın bitkilere verilmesi için genel bir yöntem göstermeye çalışıyoruz. Birçok bitki geleneksel dönüşüm yöntemlerine karşı inatçıdır. Yöntemimiz, esnek sert yüzeyler üzerinde karbon nanofiber dizileri kullanarak bu sorunu çözebilir.Tekniğimiz hızlı ve kullanıcı dostudur. Hemen hemen her bitki türüne veya bitki organına uygulanabilir. Boyalar ve proteinler gibi diğer reaktifleri vermek için de kullanılab...

Video: Yazar Spotlight: Karbon Nanofiber Dizilerle İnovasyon Yaparak Tesis Dönüşümünün Kilidini Açmak 

The delivery of biomolecules and impermeable dyes to intact plants is a major challenge. Nanomaterials are up-and-coming tools for the delivery of DNA to plants. As exciting as these new tools are, they have yet to be widely applied. Nanomaterials fabricated on rigid substrate (backing) are particularly difficult to successfully apply to curved plant structures. This study describes the process for microfabricating vertically aligned carbon nanofiber arrays and transferring them from a rigid to a flexible substrate. We detail and demonstrate how these fibers (on either rigid or flexible substrates) can be used for transient transformation or dye (e.g., fluorescein) delivery to plants. We show how VACNFs can be transferred from rigid silicon substrate to a flexible SU-8 epoxy substrate to form flexible VACNF arrays. To overcome the hydrophobic nature of SU-8, fibers in the flexible film were coated with a thin silicon oxide layer (2-3 nm). To use these fibers for delivery to curved plant organs, we deposit a 1 &#181;L droplet of dye or DNA solution on the fiber side of VACNF films, wait 10 min, place the films on the plant organ and employ a swab with a rolling motion to drive fibers into plant cells. With this method, we have achieved dye and DNA delivery in plant organs with curved surfaces.

Here we describe methods for microfabricating vertically aligned carbon nanofibers (VACNFs), transferring VACNFs to flexible substrates, and applying VACNFs on both rigid and flexible substrates to plants for biomolecule and dye delivery.

Biyomühendislik

On-Chip Method to Deliver Dye or Biomolecules to Plants Using VACNFs in a Flexible Substrate

Begin by preparing vertically aligned carbon nano fibers, or VACNFs. To transfer the VACNFs to a flexible substrate, first place the individual chips in acetone to separate the flexible substrate from the rigid substrate. Then, wash SU-8 films with IPA for five minutes, followed by washing with water for five minutes.Place the chips in a commercial box with a sticky pad when transporting them. Prepare a silicone rubber PET holder by mixing the elaststomer and the crosslinker from a two-part kit. Cut out a square of PET and tape it down in a clear plastic dish.Then, pour a very thin film of silicone rubber on top of the PET and cure it at 80 degrees Celsius for one to two hours. Transfer the SU-8 film to the PET holder using a pair of tweezers, and place the fiberless side of the SU-8 film on the silicone rubber. Press on the edges of the SU-8 square to help it stick to the silicone rubber PET and avoid breaking off fibers.Then, place a one microliter droplet of dye onto the fiber side of the SU-8 film and let it dry for 10 minutes. After drying, place the VACNF film onto the plant surface using a pair of sharp tweezers. Then, gently roll a small makeup applicator over the VACNF film.Mark the areas where the flexible substrates are placed with a soft tipped marker. Then remove the flexible substrates from the plant surface using tape. Repeat VACNF application for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film.The on-chip method was used to deliver fluorescein dye to curved surfaces, such as strawberries, in which a strong fluorescein signal was observed immediately. Whereas in apples, a strong fluorescein signal was seen after two hours of delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in apples.Also, a successful transient transformation of onions was done by delivering the plasmid containing yellow fluorescent protein using VACNF films.

Esnek bir substratta VACNF'leri kullanarak bitkilere boya veya biyomoleküller vermek için çip üzerinde yöntem

On-Plant Method to Deliver Dye or Biomolecules Using VACNFs in a Rigid Substrate

To begin, remove the photo resist from the VACNFs by washing with 100%acetone for five minutes, followed by a five minute wash with 100%IPA, and then double distilled water for five minutes. Then, place the plant tissue to be impaled on a hard surface for support. Place a one microliter droplet of dye onto the surface of the plant tissue.Place a VACNF chip with a rigid substrate down the top of the droplet, with the fibers oriented such that they will come into contact with the droplet. Using the flat side of a pair of tweezers, tap the chip, mark the area of the plant that the chip came into contact with using a soft tipped marker. Remove the VACNF chips after delivery.Repeat these steps for controls, such as placing dye on the fiberless side of a film, using the film without dye, and using the fiberless side of a film. Store intact plants or excised plant organs in humid chambers in long day conditions. For excised organs, use a plastic Petri dish with wet paper towels.Using this method, fluorescein dye was delivered to Arabidopsis leaves. Images taken at different time points, showed that the fluorescein dye was observed immediately after delivery. Similarly, delivery of a plasmid containing yellow fluorescent protein was achieved in Arabidopsis leaves.