Gli autori desiderano ringraziare Mant Acon per le piante utilizzate in questo studio. Il finanziamento è stato fornito dal progetto CRIS 8062-22410-007-000-D del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) e dalla sovvenzione NIFA USDA 2020-70029-33176.

1. Produzione di piante di agrumi per iniezione di composti sperimentali
<ol><li>Propagare piccoli alberi di agrumi in vaso da talee vegetative radicate o semi. Coltivare le linee di agrumi in vaso sotto una lunghezza giorno/buio di 16 h/8 h e a 28 °C.</li>
	<li>Seleziona piante di agrumi della dimensione appropriata per l'esperimento. Le applicazioni descritte richiedevano che le piante fossero comprese tra 12 cm e 100 cm di altezza con diametri del tronco di 4-14 mm. Se è necessaria una nuova crescita a filo, tagliare le piante prima dell'esperimento.</li>
</ol>2. Stampa tridimensionale del dispositivo DPI e dei componenti dello stampo
<ol><li>Applicare un sottile strato di colla a base di polivinilacetato sul piano di stampa.</li>
	<li>Caricare il filamento di nylon nella stampante 3D e preparare la stampante secondo le istruzioni del produttore. Importare il file . STL (file supplementare 1, file supplementare 2, file supplementare 3, file supplementare 4, file supplementare 5, file supplementare 6, file supplementare 7, file supplementare 8, file supplementare 9, file supplementare 10, file supplementare 11, file supplementare 12, file supplementare 13 e file supplementare 14), impostare e avviare la stampa.</li>
	<li>Rimuovere il pezzo dal piano di stampa. Risciacquare la colla a base di polivinilacetato dalla base del componente stampato con acqua e rimuovere eventuali strutture di supporto.</li>
	<li>Spruzzare il componente DPI con due mani di vernice spray lucida trasparente.</li>
</ol>3. Fabbricazione dello stampo ad anello plastisol
<ol><li>Assemblate uno stampo abbastanza grande da contenere i pezzi del modello costruendo un involucro rettangolare usando blocchi di plastica a scatto su una base (Figura supplementare S1A).</li>
	<li>Mescolare il monomero siliconico RTV e il catalizzatore insieme in un rapporto 10: 1 e mescolare senza introdurre bolle per 1 minuto. Colorare aggiungendo colorante alimentare (3 gocce/25 ml di miscela di silicone) e sapone per le mani (1 mL di sapone/25 ml di miscela di silicone) (Figura supplementare S1B).</li>
	<li>Versare un sottile strato di silicone nella forma dello stampo che è sufficiente a coprire completamente il fondo. Tamponare per appiattire la superficie e attendere 24 ore per il fissaggio del silicone (figura supplementare S1C).</li>
	<li>Versare un secondo strato di silicone, come descritto sopra, che sia abbastanza profondo da coprire la stampa del nucleo del foro centrale sul motivo (visibile nella parte superiore del motivo nella figura supplementare S1D). Inserire il motivo nel silicone liquido con la stampa del nucleo del foro centrale rivolta verso il basso. Assicurarsi che nessuna bolla sia intrappolata e che i modelli siano ben separati e non si tocchino (Figura supplementare S1E).</li>
	<li>Fissare i modelli con un oggetto pesante e / o nastro adesivo per evitare che fluttuino fuori dal silicone mentre si imposta. Attendere 24 ore per impostare il nuovo strato versato (Figura supplementare S1F).</li>
	<li>Versare ulteriori strati di silicone fino a quando il livello è a filo con la parte superiore del motivo. Attendere 24 ore per la polimerizzazione (Figura supplementare S1G).</li>
	<li>Smontare i blocchi di plastica a scatto per rilasciare lo stampo. Rimuovere i modelli (figura supplementare S1H). Ispezionare lo stampo per verificare la presenza di strappi o deformità (Figura supplementare S1I).</li>
</ol>4. Colata degli anelli plastisol
<ol><li>Rivestire l'interno dello stampo, tutti i componenti principali e gli O-ring con olio da cucina (Figura supplementare S2A, B). Posizionare un O-ring attorno alla tacca al centro del nucleo del palo centrale e posizionare il nucleo nel foro centrale dello stampo ad anello plastisol (Figura supplementare S2C).</li>
	<li>Inserire il nucleo del canale di consegna nel foro sul lato dello stampo ad anello plastisol. Orientare la punta a forma di V all'estremità del nucleo del canale di mandata per allinearlo con l'O-ring sul nucleo del montante centrale (figura supplementare S2D,E).</li>
	<li>Riscaldare plastisol nel microonde per brevi raffiche di 10 s (Figura supplementare S2F, G). Mescolare plastisol delicatamente per evitare bolle (Figura supplementare S2H). Ripetere il riscaldamento e l'agitazione fino a quando la soluzione raggiunge una temperatura compresa tra 160 °C e 170 °C (figura supplementare S2I). ATTENZIONE: Il surriscaldamento del plastisol può portare al rilascio di fumi tossici. Eseguire la procedura in un'area ben ventilata o in una cappa aspirante. Non riscaldare il plastisol a temperatura superiore a 170 °C.</li>
	<li>Versare il plastisol fuso nello stampo ad anello plastisol vicino al bordo esterno dello stampo senza introdurre bolle (Figura supplementare S2J). Attendere 1 h affinché gli anelli plastisol si raffreddino (Figura supplementare S2K). Rimuovere gli anelli dallo stampo. Assicurarsi che il dispositivo DPI sia correttamente adattato prima dell'uso in saggi sperimentali (figura supplementare S2L).</li>
</ol>5. Fissaggio del dispositivo DPI all'impianto
<ol><li>Trova un sito liscio e sano sul tronco per l'attacco del dispositivo. Evitare urti o nodi, in quanto possono contribuire alla perdita del dispositivo.</li>
	<li>Utilizzare una punta da trapano da 2 mm di diametro per praticare un foro orizzontalmente attraverso il centro dello stelo con un angolo di 90° con la superficie del tronco (figura supplementare S3A). Far passare la punta del trapano attraverso il foro più volte per pulirlo e levigarlo per creare un foro non ostruito (Figura supplementare S3B).</li>
	<li>Create una fetta verticale nell'anello plastisol sul lato opposto del canale di erogazione del composto (Figura supplementare S3C). Montare l'anello attorno all'impianto e allineare il canale di mandata con il foro precedentemente praticato (figura supplementare S3D). NOTA: L'anello deve adattarsi perfettamente al tronco per evitare perdite; I gruppi di nuclei con vari diametri possono essere utilizzati per realizzare anelli plastisol per steli di piante di diverse dimensioni.</li>
	<li>Aggiungere il dispositivo DPI all'anello plastisol, assicurandosi che si adattino perfettamente. Allineare il beccuccio del dispositivo DPI con il canale di erogazione dell'anello plastisol e il foro praticato (figura supplementare S3E). NOTA: può essere utile utilizzare una punta da trapano per allineare il foro e il beccuccio del dispositivo DPI.</li>
	<li>Avvolgere ermeticamente con nastro di silicone per tenere l'apparecchio in posizione (figura supplementare S3F). Ispezionare il dispositivo completamente assemblato e collegato per garantire il corretto allineamento e orientamento sull'impianto.</li>
</ol>6. Applicazione del composto di interesse utilizzando il dispositivo DPI
<ol><li>Utilizzare una siringa o una pipetta per riempire il dispositivo DPI con la soluzione di interesse (figura supplementare S3G). Utilizzare una siringa per penetrare il nastro di silicone e l'anello plastisol sul lato opposto del dispositivo DPI per estrarre l'aria dal canale interno ed evitare l'introduzione di bolle d'aria nella vascolarizzazione della pianta (Figura supplementare S3H). Sostituire qualsiasi composto estratto nel dispositivo DPI.</li>
	<li>Aggiungere un'ulteriore piccola patch di nastro di silicone sopra il foro creato dalla siringa per rinforzare l'area e prevenire strappi. Ispezionare l'apparecchio per individuare perdite visibili nel punto di attacco e ispezionare il serbatoio del dispositivo per un livello di liquido stabile. NOTA: l'acqua può essere utilizzata inizialmente per verificare la presenza di perdite per evitare sprechi della soluzione di prova.</li>
	<li>Coprire l'estremità aperta del dispositivo DPI con pellicola sigillante di ceralacca e tirare verso il basso per formare un sigillo e ridurre l'evaporazione del composto sperimentale. Praticare un singolo foro nella pellicola di cera con la punta di una siringa per evitare lo sviluppo di un vuoto e successivamente riempire nuovamente il dispositivo (Figura supplementare S3I).</li>
	<li>Controllare quotidianamente l'apparecchio per garantire il corretto allineamento dei componenti (figura supplementare S3J) e rabboccare il liquido utilizzando una siringa per evitare che il serbatoio si asciughi. Ripetere questo processo fino a quando non è stata introdotta la quantità desiderata di soluzione sperimentale. NOTA: i composti possono essere introdotti con successo da un determinato dispositivo per un massimo di 1 mese. Le durate di assorbimento della soluzione che superano questo lasso di tempo devono essere testate empiricamente prima della configurazione sperimentale.</li>
</ol>7. Utilizzo di CFDA per osservare il movimento vascolare con piante di agrumi
<ol><li>Collegare il dispositivo DPI a piante di cedro (Citrus medica L.) alte 25 cm, applicare un singolo trattamento da 2,0 ml di DMSO al 20% nel controllo H2O o CFDA al dispositivo DPI e lasciarlo assorbire per 24 ore. Per seguire questo protocollo, preparare la soluzione CFDA funzionante aggiungendo 1,6 ml di H 2 O a 400 μL di soluzione madre CFDA (la soluzione madre contiene 10 mM CFDA disciolti in 100% dimetil solfossido [DMSO]) per generare una concentrazione finale di CFDA di2mM e 20% di DMSO.</li>
	<li>Crea sezioni trasversali di vari tessuti della pianta e usa uno stereoscopio o un microscopio composto con un filtro fluorescente che include la lunghezza d'onda di 498 nm per visualizzare il CFDA nei tessuti vegetali. Confronta le immagini con il DMSO del 20% nei controlli H2O per tenere conto dell'autofluorescenza nel tessuto.</li>
</ol>8. Misurazione delle variazioni del titolo CLas in campioni di foglie dopo trattamento con streptomicina
<ol><li>Utilizzando piante di Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia") alte 0,75 m di altezza, raccogliere il picciolo e la nervatura centrale di due foglie sintomatiche HLB da ciascuna pianta, tagliarle in piccole sezioni, raggruppare ogni tipo di tessuto e conservarle separatamente in provette resistenti agli urti da 2 ml contenenti una sfera d'acciaio di 6,35 mm di diametro.</li>
	<li>Macinare il campione utilizzando un omogeneizzatore programmato per due cicli da 15 s a 3,4 m/s. Estrarre l'acido nucleico totale come descritto in precedenza19.</li>
	<li>Eseguire la qPCR sui campioni di foglie infette da CLas utilizzando la miscela qPCR definita nella Tabella 1 e le condizioni di reazione definite nella Tabella 2. Utilizzare piante che mostrano infezioni da CLas robuste (l'infezione robusta è generalmente definita come valori di Ct basati su qPCR < 30 per il set di primer CLas 16S LasLong (LL)) per ulteriori analisi. NOTA: Il titolo batterico viene stimato utilizzando CLas 16S Las Long (LL) e primer del DNA di deidrina degli agrumi per stimare gli equivalenti del genoma relativo, come descritto in precedenza20.</li>
	<li>Equipaggiare le piante di agrumi che soddisfano il titolo minimo di infezione sopra descritto con dispositivi DPI e sottoporle a un trattamento una tantum di 2,0 ml di soluzione di H2O o soluzione di streptomicina alla concentrazione desiderata. Per seguire questo studio, utilizzare un singolo trattamento da 2,0 ml di streptomicina 9,5 mg / ml (19 mg in totale) sciolta in H2O.</li>
	<li>Raccogliere campioni di foglie a 7 giorni, 14 giorni e 28 giorni dopo il trattamento. Analizzare le foglie campionate per il titolo CLas utilizzando lo stesso protocollo descritto sopra.</li>
	<li>A 60 giorni dopo il trattamento, ottenere fotografie delle piante trattate con H2O o streptomicina. Utilizzare osservazioni visive dell'infezione CLas per valutare la gravità dell'infezione. Cerca il <50% delle foglie che mostrano clorosi interveinale e tappatura delle vene insieme alla crescita del rossore fogliare come segni di infezione lieve e più del 50% delle foglie con clorosi interveinale e tappatura delle vene, nonché abscissione fogliare e arresto della crescita della pianta come segni di infezioni più gravi.</li>
</ol>9. Misurazione della mortalità di D. citri dopo trattamento con imidacloprid
<ol><li>Potare piante di cedro (Citrus medica L.) alte 0,5 m ad un'altezza di 12 cm per favorire la crescita di nuove vampate. NOTA: La velocità di crescita a filo può dipendere dalla salute della pianta e dal periodo dell'anno; Quindi, tenetene conto durante la progettazione sperimentale.</li>
	<li>Dopo che >6 vampate, lunghe 1-2 cm, si sono sviluppate, introdurre le piante in gabbie contenenti D. citri adulto. Lasciare le piante nelle gabbie per 24 ore per consentire la deposizione delle uova.</li>
	<li>Condurre conteggi delle uova rappresentativi su tre germogli a filo 1-2 giorni dopo la deposizione e successivamente applicare i dispositivi DPI. Riempire questi dispositivi con 2,0 ml di un controllo dell'acqua o la concentrazione desiderata di imidacloprid (21,8% di principio attivo). Per seguire questo protocollo, utilizzare 528 μL/L, 52,8 μL/L e 5,28 μL/L di imidacloprid. NOTA: I conteggi delle uova sono una misura distruttiva, quindi i conteggi in questa fase vengono utilizzati per stimare il numero di uova sul flusso non contato della stessa pianta e aiutano a fornire una linea di base per i successivi conteggi di emergenza delle ninfe che vengono condotti alla fine dell'esperimento.</li>
	<li>Raccogliere il tasso di emergenza di D. citri su almeno tre dei germogli di lavaggio rimanenti. Acquisire fotografie rappresentative delle piante 7 giorni dopo l'introduzione del composto.</li>
</ol>

Somministrazione di molecole nelle piante utilizzando un dispositivo di infusione diretta

<ol>
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Gli autori non hanno conflitti di interesse. L'uso di nomi commerciali, di aziende o società in questa pubblicazione è per informazione e comodità del lettore. Tale uso non costituisce un'approvazione ufficiale o un'approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti o del Servizio di Ricerca Agricola di qualsiasi prodotto o servizio ad esclusione di altri che potrebbero essere adatti. Il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (USDA) proibisce la discriminazione in tutti i suoi programmi e attività sulla base di razza, colore, origine nazionale, età, disabilità e, ove applicabile, sesso, stato civile, stato familiare, stato parentale, religione, orientamento sessuale, informazioni genetiche, convinzioni politiche, rappresaglia o perché tutto o parte del reddito di un individuo deriva da qualsiasi programma di assistenza pubblica. Non tutte le basi proibite si applicano a tutti i programmi. Le persone con disabilità che necessitano di mezzi alternativi per la comunicazione delle informazioni sul programma (Braille, stampa a caratteri grandi, audiocassetta, ecc.) devono contattare il TARGET Center dell'USDA al numero (202) 720-2600 (voce e TDD). Per presentare una denuncia di discriminazione, scrivere a USDA, Direttore, Ufficio per i diritti civili, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, DC 20250-9410, o chiamare (800) 795-3272 (voce) o (202) 720-6382 (TDD). USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.

Affinché il dispositivo DPI sia considerato un metodo praticabile per la somministrazione di composti esogeni nelle piante, deve contribuire a un assorbimento di composti robusto e coerente in una varietà di tipi di tessuto. L'esperimento che utilizzava CFDA ha mostrato chiaramente sia il movimento del composto acropetale che basitale, così come sia nel sistema vascolare che nelle cellule mesofille della foglia. Inoltre, e presumibilmente perché il foro trivellato utilizzato in questo dispositivo DPI fornisce una grande quantità di superficie per l'assorbimento del composto, il CFDA era presente in quantità relativamente uguali in tutte le sezioni dello stelo, non solo in un piccolo sottoinsieme della vascolarizzazione adiacente al dispositivo, come è stato visto in precedenti studi sull'assorbimento del colorante nelle piante che utilizzano l'iniezione del tronco6. Inoltre, la somministrazione di proteine fluorescenti verdi e colorante floreale è stata testata utilizzando il dispositivo DPI ed è stata osservata una distribuzione di questi composti simile al CFDA (dati non mostrati). Questi dati suggeriscono che il dispositivo può essere utilizzato per fornire sistemicamente una varietà di composti che variano in dimensioni e struttura molecolare. Tuttavia, vale la pena notare che c'erano differenze nell'assorbimento del composto in base allo stadio di sviluppo delle foglie, con foglie in via di sviluppo più giovani che occupavano più composti rispetto alle foglie più vecchie stabilite. Ciò può essere dovuto ai cambiamenti nelle proprietà vascolari presenti nel tessuto sink rispetto al tessuto sorgente e dovrebbe essere ottimizzato per un determinato esperimento. 
Il dispositivo DPI ha mostrato un assorbimento di composti sufficiente per la visualizzazione di CFDA, GFP e colorante floreale, e ha anche preso abbastanza per mostrare gli effetti antibatterici e insetticidi della streptomicina e dell'imidacloprid, rispettivamente. Entrambi questi composti hanno provocato cambiamenti nella vitalità dell'organismo bersaglio 1 settimana dopo un singolo trattamento da 2,0 ml. Questi dati suggeriscono che il dispositivo DPI potrebbe essere utilizzato in saggi di intere piante per testare la fattibilità di un'ampia varietà di composti per il controllo di parassiti microbici e insetti. Inoltre, grazie al suo contatto diretto con il sistema vascolare, questo dispositivo può anche offrire l'opportunità di testare composti che non vengono assorbiti in modo efficiente dalle radici o dalle cellule epidermiche. Di particolare interesse sarebbe l'interferenza dell'RNA (RNAi), in quanto potrebbe essere utilizzata per modulare l'espressione genica all'interno della pianta ospite, del patogeno o del vettore patogeno. Ricerche precedenti che hanno introdotto l'RNA a forcina attraverso un foro praticato nel tronco delle piante di mele e uva hanno mostrato che le molecole di RNA erano limitate al tessuto xilematico, suggerendo che queste molecole possono essere efficaci solo contro gli organismi masticatori e che si nutrono di linfa xilematica22. Dato che il dispositivo DPI utilizza un sistema di rilascio simile a foro perforato, è ovvio che l'RNA a forcina consegnato con questo dispositivo può anche essere limitato al tessuto xilematico. Tuttavia, la diminuzione osservata del titolo delle CLas limitate dal floema dopo il trattamento con streptomicina dal dispositivo DPI suggerisce fortemente che questo antibiotico era presente nel floema. Pertanto, è probabile che la distribuzione vascolare dei composti erogati utilizzando il dispositivo DPI dipenda dalle loro dimensioni e dalla loro chimica e ogni molecola debba essere valutata su base individuale.
Sebbene sul mercato siano disponibili numerosi dispositivi DPI disponibili in commercio, il dispositivo qui descritto può essere prodotto internamente ed è modificabile. In questo modo, è possibile apportare miglioramenti e cambiamenti nelle dimensioni in base alle specie vegetali e al disegno sperimentale utilizzato, e non dipende da prodotti commerciali. Inoltre, il dispositivo è collegato in modo semi-permanente alla pianta, il che significa che più trattamenti di un determinato composto possono essere eseguiti contemporaneamente senza dover ferire nuovamente la pianta con più iniezioni di composti. Su una nota cautelativa, il dispositivo può perdere se non installato correttamente. Di conseguenza, il composto viene perso nell'ambiente invece di essere consegnato alla pianta. Pertanto, è necessario prestare attenzione a ispezionare il dispositivo per eventuali segni di perdite durante l'installazione e i primi giorni successivi. Sebbene praticare un foro nell'albero sia potenzialmente dannoso, questo metodo è stato scelto per garantire un assorbimento di composti robusto e coerente. Inoltre, non sono stati osservati effetti avversi sulla salute delle piante dall'attacco del dispositivo DPI in questi esperimenti. Tuttavia, nel disegno sperimentale dovrebbero essere incluse piante extra per sostituire quelle che possono perdere vigore nel corso di un determinato esperimento. Infine, poiché questo dispositivo utilizza il flusso passivo per introdurre composti, può essere difficile prevedere il tasso di assorbimento tra diverse specie vegetali o fasi di sviluppo della stessa specie. Ciò può complicare gli esperimenti se la velocità di assorbimento dei composti è un fattore limitante. Per ottenere i migliori risultati, gli esperimenti dovrebbero essere pianificati in modo da fornire tempo sufficiente affinché la pianta assorba completamente i 2,5 ml di composto, che può richiedere fino a 1 settimana. In conclusione, questo dispositivo DPI è uno strumento efficace per la valutazione rapida dell'attività in pianta di composti antimicrobici o insetticidi contro CLas e il suo vettore, D. citri, fornendo così maggiori informazioni sull'efficacia sistemica e sull'influenza sulle prestazioni delle piante rispetto al saggio fogliare staccato precedentemente presentato23. Indubbiamente, la varietà di applicazioni per questo sistema va ben oltre gli usi specifici descritti in questo studio.

La gestione delle piante in contesti commerciali e paesaggistici richiede spesso l'uso di composti chimici per ottimizzare la crescita e la salute delle piante. Il modo in cui queste molecole vengono consegnate dipende dal tipo di molecola, dalla funzione della molecola, dal tipo di pianta e dal sistema di gestione in atto. Le applicazioni fogliari e del suolo sono le strategie di consegna più semplici, ma le limitazioni nell'assorbimento di alcune molecole richiedono la consegna diretta. Un esempio di queste molecole sono le molecole terapeutiche che funzionano meglio quando si muovono sistemicamente all'interno della pianta ma non possono essere efficacemente fornite da semplici applicazioni topiche1. Questo è il caso di Huanglongbing (HLB), chiamato anche malattia dell'inverdimento degli agrumi. L'HLB è una malattia associata a un batterio limitato al floema, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), che non può essere coltivato al di fuori della pianta, o al suo insetto vettore, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Se le molecole terapeutiche putative sono prodotti genici, possono essere testate creando piante transgeniche che esprimono questi composti. Tuttavia, la produzione di piante transgeniche può richiedere molto tempo e risorse, è altamente dipendente dal genotipo e può essere inibita dal silenziamento genico3. Inoltre, anche se questi transgenici mostrano risultati promettenti, i vincoli normativi e di percezione pubblica riducono la probabilità della loro accettazione commerciale 4,5. L'applicazione esogena di composti, tuttavia, semplifica la sperimentazione di molecole biologiche e sintetiche perché non richiede la produzione di piante transgeniche stabili o che esprimono transitoriamente, il che riduce i tempi e le risorse per testare gli effetti di una molecola. Un metodo per la somministrazione sistemica efficace ed efficiente di composti esogeni da parte delle piante potrebbe essere utilizzato per un'ampia varietà di scopi di ricerca e screening.
Una di queste applicazioni è l'analisi del movimento sistemico delle molecole all'interno del sistema vascolare di una pianta, che può essere effettuata utilizzando marcatori tracciabili, siano essi fluorescenti, visibili o isotopi chimici unici 6,7,8,9. Un marcatore fluorescente comunemente usato è la 5,6-carbossifluoresceina-diacetato (CFDA), che è un colorante permeabile alla membrana che viene degradato dalle esterasi intracellulari in 5,6-carbossifluoresceina (CF) e, successivamente, diventa fluorescente e impermeabile alla membrana10. Il CFDA è stato ampiamente utilizzato per monitorare il trasporto del floema, le relazioni tra sink e source e il pattern vascolare nel tessuto vegetale11,12.
Oltre a questi marcatori, alcuni composti possono alterare direttamente la fisiologia della pianta per aumentare la produttività o uccidere la pianta nel caso degli erbicidi. Sia gli insetticidi che i composti antimicrobici sono un mezzo per aumentare la produttività delle piante, specialmente in presenza di HLB. Un esempio di una molecola antimicrobica che viene utilizzata per controllare CLas è la streptomicina. La streptomicina è un antibiotico aminoglicosidico originariamente isolato da Streptomyces griseus e ha dimostrato di inibire la crescita batterica attraverso l'inibizione della biosintesi proteica13. In termini di insetticidi, l'obiettivo principale per la ricerca HLB è D. citri, che trasmette CLas da albero ad albero14. A tale scopo, i neonicotinoidi, come l'imidacloprid, sono comunemente utilizzati, in quanto sono il gold standard per il controllo degli insetti nocivi15. Tutti questi diversi usi sono aspetti importanti delle attuali strategie di gestione degli impianti e lo sviluppo di nuovi prodotti dipende da saggi di screening efficienti.
Un metodo utilizzato per l'introduzione di composti nelle piante legnose è l'iniezione diretta nel tronco. Sono stati progettati una varietà di sistemi che variano nelle loro esigenze per i siti di iniezione preforati e questi sistemi utilizzano l'iniezione basata sulla pressione o il flusso passivo16. Sebbene i sistemi basati sulla pressione consentano la rapida introduzione di un determinato composto, il potenziale danno fisico causato dalla forzatura del liquido attraverso la vascolarizzazione bloccata o embolizzata deve essere considerato17. Sebbene l'applicazione fogliare o inzuppata di composti richieda meno tempo da attuare, l'iniezione diretta delle piante riduce lo spreco del composto di interesse a causa delle perdite nell'aria o nel suolo e può anche allungare il tempo in cui i composti sono in uno stato attivo riducendo l'esposizione all'ambiente esterno18. Entrambi questi aspetti sono importanti per preservare i reagenti costosi e garantire la coerenza tra le repliche nelle impostazioni di ricerca.
Questo studio descrive la progettazione, la costruzione e l'uso di un innovativo dispositivo di infusione diretta delle piante (DPI), che può essere utilizzato per valutare come i composti di interesse influenzano una pianta ospite. Una stampante 3D standard è stata utilizzata per produrre sia il dispositivo stesso che diversi componenti associati alla sua costruzione. Questo metodo di costruzione interno consente ai ricercatori di modificare il dispositivo e i componenti del dispositivo in base alle loro specifiche esigenze sperimentali e riduce la dipendenza dai dispositivi di iniezione delle piante disponibili in commercio. La configurazione del dispositivo è semplice ed efficiente e tutti i componenti ausiliari sono prontamente disponibili e poco costosi. Sebbene il sistema sia stato progettato per l'uso con una varietà di specie vegetali, gli esempi qui presentati riguardano piante di agrumi in vaso. Inoltre, questo studio dimostra che questo dispositivo è in grado di fornire in modo efficiente più tipi di composti sistemicamente alle giovani piante di agrumi senza causare letalità. I composti testati includevano CFDA, che è stato utilizzato per valutare la distribuzione del composto nella pianta, e streptomicina e imidacloprid, che sono stati utilizzati per verificare che gli effetti antimicrobici e insetticidi di questi composti sono stati osservati quando somministrati tramite DPI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 cm Diameter Steel Balls</td>
			<td>Ballistic Products Inc.</td>
			<td>#SHT #T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>382903029952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 Syringe Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Screw Cap Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-PR-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-SW-FDVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>S-FW-OEVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/64th Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well qPCR Machine</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SP-BX43-BI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>69401-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloss Clear Spray Paint</td>
			<td>Rustoleum</td>
			<td>249117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grey Lego Baseplate</td>
			<td>Lego</td>
			<td>11024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Cordless Drill</td>
			<td>Makita</td>
			<td>6349D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidacloprid 2F</td>
			<td>Quali-Pro</td>
			<td>83080133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Plastisol Medium Hardness</td>
			<td>Fusion X Fishing Lures</td>
			<td>XSOL-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Silicone 70 Shore A O-Ring</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Varies by Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Stick Cooking Spray</td>
			<td>PAM</td>
			<td>64144030217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plant II</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740770.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly Viyl Acetate Based Glue</td>
			<td>Elmers</td>
			<td>E301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Varies by DNA sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A5003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent Silicone RTV Rubber</td>
			<td>Aero Marine Products</td>
			<td>AM 115T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Silicone Tape</td>
			<td>Maxwell</td>
			<td>KE30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truncated Oncocin 112</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Varies by peptide sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 1 x 6 Lego Piece</td>
			<td>Lego</td>
			<td>300901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Nylon</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-MF-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct infusion device for molecule delivery in plants

Testare la funzione dei composti terapeutici nelle piante è una componente importante della ricerca agricola. I metodi fogliari e di drenaggio del suolo sono di routine, ma presentano degli svantaggi, tra cui l'assorbimento variabile e la ripartizione ambientale delle molecole testate. L'iniezione del tronco degli alberi è ben consolidata, ma la maggior parte dei metodi per questo richiede costose attrezzature proprietarie. Per lo screening di vari trattamenti per Huanglongbing, è necessario un metodo semplice e a basso costo per fornire questi composti al tessuto vascolare di piccoli alberi di agrumi coltivati in serra infettati dal batterio limitato dal floema Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) o infestati dall'insetto vettore CLas che si nutre di floema Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
Per soddisfare questi requisiti di screening, è stato progettato un dispositivo di infusione diretta delle piante (DPI) che si collega al tronco della pianta. Il dispositivo è realizzato utilizzando un sistema di stampa 3D basato su nylon e componenti ausiliari facilmente ottenibili. L'efficacia di assorbimento del composto di questo dispositivo è stata testata nelle piante di agrumi utilizzando il marcatore fluorescente 5,6-carbossifluoresceina-diacetato. È stata regolarmente osservata una distribuzione uniforme del marcatore in tutte le piante.
Inoltre, questo dispositivo è stato utilizzato per fornire molecole antimicrobiche e insetticide per determinare i loro effetti rispettivamente su CLas e D. citri. La streptomicina antibiotica aminoglicoside è stata somministrata nelle piante di agrumi infette da CLas utilizzando il dispositivo, il che ha comportato una riduzione del titolo CLas da 2 settimane a 4 settimane dopo il trattamento. La somministrazione dell'insetticida neonicotinoide imidacloprid nelle piante di agrumi infestate da D. citri ha comportato un aumento significativo della mortalità degli psillidi dopo 7 giorni. Questi risultati suggeriscono che questo dispositivo DPI rappresenta un sistema utile per fornire molecole nelle piante per i test e facilitare scopi di ricerca e screening.

The management of plants in commercial and landscape settings often requires the use of chemical compounds to optimize the plant growth and health. How these molecules are delivered depends on the type of molecule, the function of the molecule, the type of plant, and the management system in place. Foliar and soil applications are the easiest delivery strategies, but limitations in the uptake of some molecules necessitate direct delivery. An example of these molecules is therapeutic molecules that function best when they move systemically within the plant but cannot be effectively delivered by simple topical applications1. This is the case with Huanglongbing (HLB), also called citrus greening disease. HLB is a disease associated with a phloem-limited bacterium, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), which cannot be cultured outside of the plant, or its insect vector, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
If the putative therapeutic molecules are gene products, they can be tested by creating transgenic plants expressing these compounds. However, transgenic plant production can be time- and resource-intensive, is highly genotype-dependent, and can be inhibited by gene silencing3. In addition, even if these transgenics show promising results, regulatory and public perception constraints reduce the likelihood of their commercial acceptance4,5. The exogenous application of compounds, however, simplifies the testing of biological and synthetic molecules because it does not require the production of stable or transiently expressing transgenic plants, which reduces the time and resources for testing a molecule&#39;s effects. A method for the effective and efficient systemic plant delivery of exogenous compounds could be used for a wide variety of research and screening purposes.
One of these applications is the analysis of systemic molecule movement within a plant&#39;s vascular system, which can be done using trackable markers, whether they are fluorescent, visible, or unique chemical isotopes6,7,8,9. One commonly used fluorescent marker is 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA), which is a membrane-permeable dye that is degraded by intracellular esterases into 5,6-carboxyfluorescein (CF) and, subsequently, becomes fluorescent and membrane-impermeable10. CFDA has been extensively used to monitor phloem transport, sink and source relationships, and vasculature patterning in plant tissue11,12.
In addition to these markers, certain compounds may directly alter the plant&#39;s physiology to increase the productivity or kill the plant in the case of herbicides. Both insecticides and antimicrobial compounds are a means of increasing plant productivity, especially in the presence of HLB. An example of an antimicrobial molecule that is used to control CLas is streptomycin. Streptomycin is an aminoglycoside antibiotic that was originally isolated from Streptomyces griseus and has been shown to inhibit bacterial growth through the inhibition of protein biosynthesis13. In terms of insecticides, the main target for HLB research is D. citri, which transmits CLas from tree to tree14. For this purpose, neonicotinoids, such as imidacloprid, are commonly utilized, as they are the gold standard for controlling insect pests15. All these varied uses are important aspects of current plant management strategies, and the development of novel products is dependent on efficient screening assays.
One method that is used for the introduction of compounds into woody plants is direct injection into the trunk. A variety of systems have been designed that vary in their needs for predrilled injection sites, and these systems utilize either pressure-based injection or passive flow16. Although pressure-based systems allow for the quick introduction of a given compound, the potential physical damage caused by forcing liquid through blocked or embolized vasculature needs to be considered17. Although the foliar or drench application of compounds is less time-intensive to implement, direct plant injection reduces waste of the compound of interest due to losses to the air or soil and can also lengthen the time that compounds are in an active state by reducing the exposure to the outside environment18. Both these aspects are important for preserving expensive reagents and ensuring consistency among replicates in research settings.
This study describes the design, construction, and use of an innovative direct plant infusion (DPI) device, which can be used to assess how compounds of interest affect a host plant. A standard 3D printer was used to manufacture both the device itself and several components associated with its construction. This in-house construction method allows researchers to modify the device and device components based on their specific experimental needs and reduces the reliance on commercially available plant injection devices. The device setup is simple and efficient, and all the auxiliary components are readily available and inexpensive. Although the system was designed for use with a variety of plant species, the examples presented here pertain to potted citrus plants. Additionally, this study demonstrates that this device is capable of efficiently delivering multiple types of compounds systemically to young citrus plants without causing lethality. The compounds tested included CFDA, which was used to assess the compound distribution in the plant, and streptomycin and imidacloprid, which were used to verify that the antimicrobial and insecticidal effects of these compounds were observed when delivered via DPI.

Autore in primo piano: Dispositivo di infusione diretta per la somministrazione di molecole nelle piante  

Dispositivo di infusione diretta per la consegna di molecole nelle piante

Delivering a therapeutic molecule to where a pathogen resides in a plant can be challenging. Treating Candidatus Liberibacter asiaticus, or CLas, a bacteria that is limited to the phloem, poses one of the biggest challenges in delivering molecules against it, especially when using conventional methods such as spray applications. The ease of printing the direct plant infusion device and its simple implementation makes it accessible to anyone.This enables the widespread screening of molecules for their potential therapeutic effect in trees. An added benefit is that the diffusion of molecules utilizes the natural process of plant transpiration. Our research improved efficiency and precision of molecular delivery in plants, which can be used for a range of research applications.By screening hundreds of molecules on small plants, we can eliminate the need for larger trees, leading to a reduction in cost and space utilization.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants at JoVE.com

Questo manoscritto descrive un nuovo dispositivo di infusione diretta delle piante per lo screening dell'efficacia delle molecole contro i batteri (Candidatus Liberibacter asiaticus) o il suo insetto vettore (Diaphorina citri, Kuwayama) che, in combinazione, sono associati alla malattia degli agrumi di Huanglongbing.

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

Fornire una molecola terapeutica dove risiede un agente patogeno in una pianta può essere difficile. Il trattamento del Candidatus Liberibacter asiaticus, o CLas, un batterio limitato al floema, pone una delle maggiori sfide nel fornire molecole contro di esso, specialmente quando si utilizzano metodi convenzionali come le applicazioni spray. La facilità di stampa del dispositivo di infusione diretta delle piante e la sua semplice implementazione lo rendono accessibile a chiunque.Ciò consente lo screening diffuso delle molecole per il loro potenziale effetto terapeutico negli alberi. Un ulteriore vantaggio è che la diffusione delle molecole utilizza il processo naturale di traspirazione delle piante. La nostra ricerca ha migliorato l'efficienza e la precisione della consegna molecolare nelle piante, che può essere utilizzata per una vasta gamma di applicazioni di ricerca.Analizzando centinaia di molecole su piccole piante, possiamo eliminare la necessità di alberi più grandi, portando a una riduzione dei costi e dell'utilizzo dello spazio.

direct-infusion-device-for-molecule-delivery-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

1.3K Views.  United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory. Fornire una molecola terapeutica dove risiede un agente patogeno in una pianta può essere difficile. Il trattamento del Candidatus Liberibacter asiaticus, o CLas, un batterio limitato al floema, pone una delle maggiori sfide nel fornire molecole contro di esso, specialmente quando si utilizzano metodi convenzionali come le applicazioni spray. La facilità di stampa del dispositivo di infusione diretta delle piante e la sua semplice implementazione lo rendono accessibile a chiunque.Ci?...

Video: Autore in primo piano: Dispositivo di infusione diretta per la somministrazione di molecole nelle piante  

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

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﻿3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings

3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings  

To begin 3D printing the direct plant infusion or DPI device and mold components, apply a thin layer of polyvinyl acetate-based glue on the print bed of the printer. Load nylon filament into the printer and prepare the printer per the manufacturer's instructions. After importing the desired STL files, set up the printer and start printing.Once the piece is removed from the print bed after printing, rinse the polyvinyl acetate-based glue from the base of the printed component with water. Spray the printed DPI device and other components with two coats of clear gloss spray paint. To fabricate the plastisol ring mold, assemble a mold form by building a rectangular enclosure using snap-together plastic blocks on a base.It should be large enough to hold the pattern pieces. Mix the room temperature vulcanizing silicone or RTV silicone monomer and the catalyst together at a 10:1 ratio by stirring for one minute. Color the solution by adding three drops of food coloring and one milliliter of hand soap per 25 milliliters of silicone mixture.Then, pour a thin layer of the silicone solution into the mold form sufficiently to fully cover the bottom of the mold form. Tamp to flatten the surface of the poured silicone, and wait for 24 hours to set the silicone. Once the silicone is set, pour another layer of silicone deep enough to cover the center hole core print of the pattern.Insert the pattern into the liquid silicone with the center hole core print facing down. Ensure that no bubbles are trapped and the patterns are well separated and not touching each other. Secure the patterns with either a heavy object or tape to prevent them from floating out of the silicone while it sets.Once set, pour additional layers of silicone into the mold form until the level is flush with the top of the pattern. Let the silicone cure for 24 hours. Disassemble the snap-together plastic blocks to release the mold.Then, remove the patterns from the mold and inspect the mold for tears or deformities. For casting the plastisol rings, coat the interior of the mold, all the core components, and the O-rings with cooking oil. Place an O-ring around the notch in the middle of the center post core, and place the core in the center hole of the plastisol ring mold.Insert the delivery channel core into the space on the side of the plastisol ring mold. Orient the V-shaped tip at the end of the delivery channel core to align with the O-ring on the center post core. Next, heat plastisol in the microwave for short bursts of 10 seconds till the solution reaches 160 to 170 degrees Celsius.In between, stir the plastisol gently to avoid bubbles. Pour the molten plastisol into the plastisol ring mold near the outside edge of the mold without introducing bubbles. Wait one hour for the plastisol rings to cool.Then, remove the rings from the mold. The DPI device was eight centimeters in height and three centimeters in width. It had a single central reservoir contiguous with the spout.The total volume that can be contained within these components is 2.0 milliliters. The 1.8 centimeter tall and 2.7 centimeter wide plastisol ring also contained two channels. One to accommodate the DPI device spout and another of variable diameter for fitting around the trunk of the tree.When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree.

Stampa 3D di dispositivi di infusione diretta delle piante (DPI) e fabbricazione di anelli Plastisol

Attachment of the Direct Plant Infusion (DPI) Device to Citrus Plants for Compound Injection

Propagate small potted citrus trees from rooted vegetative cuttings or seeds. Grow the potted citrus lines at 28 degrees Celsius, maintaining a proper day length. Select citrus plants of the appropriate size for the experiment.To attach the 3D-printed Direct Plant Infusion or DPI device to the trunk of the plant, find a smooth, healthy site on the trunk without bumps or knots. Using a two-millimeter-diameter drill bit, horizontally drill a hole through the center of the stem at an angle of 90 degrees to the trunk surface. Run the drill bit through the hole several times to create an unobstructed, smooth hole.Then create a vertical slice in the plastisol ring on the opposite side of the compound delivery channel. Fit the ring around the plant, aligning the delivery channel with the previously-drilled hole. Attach the DPI device to the plastisol ring, ensuring they fit snugly together, and align the DPI device spout with the plastisol ring delivery channel and the drilled hole.Wrap it tightly with silicone tape to hold the apparatus in place. Inspect the fully assembled and attached device to ensure proper alignment and orientation. The groove around the vertical channel allowed additional compound uptake through the bark.When assembled properly, the plastisol ring flushed against the DPI device and the spout lined up with a hole drilled in the tree.

Fissaggio del dispositivo di infusione diretta delle piante (DPI) alle piante di agrumi per iniezione di composti

Applying Compounds to Citrus Plants Using a Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion (DPI) Device

To apply compounds to the plants using the Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion, or DPI device, ensure the device is properly fitted to the plants. When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree. Use a syringe or pipette to fill the DPI device with the compound solution of interest.Using a syringe, penetrate the silicone tape and plastisol ring opposite to the DPI device to extract air from the interior channel. Replace any extracted compound back into the DPI device. Add an additional small patch of silicone tape over the hole created by the syringe to reinforce the area and prevent tears.Inspect the apparatus for visible leakages at the attachment point and inspect the device reservoir for a stable liquid level. Cover the open end of the DPI device with a wax sealing film and pull it down to form a seal to reduce the evaporation of the experimental compound. Poke a single a hole in the wax film with a syringe tip to prevent the development of a vacuum, and subsequently refill the device.Check the apparatus daily to ensure proper alignment of the components, and top off the liquid using a syringe to avoid the reservoir running dry til the desired amount is delivered. When two milliliters of two millimolar CFDA dye was introduced to the plant using the DPI device, a fluorescent signal was detected in the vasculature of the treated plant, but was absent in the controlled plant treated with 20%DMSO in water. This signal was observed within 24 hours of treatment, evenly throughout the dissected plant tissue types.Treatment of streptomycin on Candidatus Liberibacter Asiaticus or CLass positive plants showed a reduction in the mean bacterial titer to 28 days after treatment compared to the control. The treated plants showed a lower mean CLas titer over all combined time points. The streptomycin treated plants as compared to the controls showed an occasional increase in new healthy flush growth after 60 days.Imidacloprid treatment on plants significantly reduced nymph emergence at the highest Imidacloprid concentration compared to the corresponding egg count. This was visually apparent in the reduction in nymph honeydew production.