يود المؤلفون أن يشكروا Mant Acon على النباتات المستخدمة في هذه الدراسة. تم توفير التمويل من قبل مشروع CRIS التابع لوزارة الزراعة الأمريكية (USDA) 8062-22410-007-000-D ومنحة وزارة الزراعة الأمريكية NIFA 2020-70029-33176.

1. إنتاج نباتات الحمضيات للحقن المركب التجريبي
<ol><li>انشر أشجار الحمضيات الصغيرة المحفوظة بوعاء إما من قصاصات نباتية أو بذور متجذرة. قم بزراعة خطوط الحمضيات المحفوظة بوعاء تحت 16 ساعة / 8 ساعات بطول يوم فاتح / مظلم وعند 28 درجة مئوية.</li>
	<li>حدد نباتات الحمضيات ذات الحجم المناسب للتجربة. تطلبت التطبيقات الموصوفة أن يتراوح ارتفاع النباتات بين 12 سم و 100 سم مع أقطار جذع 4-14 مم. إذا كانت هناك حاجة إلى نمو تدفق جديد ، فقم بقص النباتات قبل التجربة.</li>
</ol>2. طباعة ثلاثية الأبعاد لجهاز DPI ومكونات القالب
<ol><li>ضع طبقة رقيقة من الغراء القائم على أسيتات البولي فينيل على سرير الطباعة.</li>
	<li>قم بتحميل خيوط النايلون في طابعة 3D ، وقم بإعداد الطابعة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استيراد المطلوب. STL (الملف التكميلي 1، الملف التكميلي 2، الملف التكميلي 3، الملف التكميلي 4، الملف التكميلي 5، الملف التكميلي 6، الملف التكميلي 7، الملف التكميلي 8، الملف التكميلي 9، الملف التكميلي 10، الملف التكميلي 11، الملف التكميلي 12، الملف التكميلي 13، الملف التكميلي 14)، قم بإعداد وبدء الطباعة.</li>
	<li>أخرج القطعة من فراش الطباعة. اشطف الغراء القائم على أسيتات البولي فينيل من قاعدة المكون المطبوع بالماء ، وقم بإزالة أي هياكل دعم.</li>
	<li>رش مكون DPI بطبقتين من طلاء الرش اللامع الشفاف.</li>
</ol>3. تصنيع قالب حلقة البلاستيسول
<ol><li>قم بتجميع شكل قالب كبير بما يكفي لحمل قطع النقش عن طريق بناء حاوية مستطيلة باستخدام كتل بلاستيكية مدمجة على قاعدة (الشكل التكميلي S1A).</li>
	<li>امزج مونومر السيليكون RTV والمحفز معا بنسبة 10: 1 ، وحركه دون إدخال فقاعات لمدة دقيقة واحدة. التلوين بإضافة تلوين الطعام (3 قطرات / 25 مل من خليط السيليكون) وصابون اليد (1 مل من الصابون / 25 مل من خليط السيليكون) (الشكل التكميلي S1B).</li>
	<li>صب طبقة رقيقة من السيليكون في شكل قالب يكفي لتغطية الجزء السفلي بالكامل. قم بسدادة السطح لتسطيح السطح ، وانتظر 24 ساعة حتى يتم ضبط السيليكون (الشكل التكميلي S1C).</li>
	<li>صب طبقة ثانية من السيليكون ، كما هو موضح أعلاه ، تكون عميقة بما يكفي لتغطية الطباعة الأساسية للفتحة المركزية على النموذج (مرئية في الجزء العلوي من النموذج في الشكل التكميلي S1D). أدخل النمط في السيليكون السائل بحيث تكون الطباعة الأساسية للفتحة المركزية متجهة لأسفل. تأكد من عدم وجود فقاعات محاصرة وأن الأنماط منفصلة جيدا ولا تلامس (الشكل التكميلي S1E).</li>
	<li>قم بتأمين الأنماط إما بجسم ثقيل و / أو شريط لمنعها من الخروج من السيليكون أثناء تثبيته. انتظر 24 ساعة حتى يتم ضبط الطبقة المصبوبة حديثا (الشكل التكميلي S1F).</li>
	<li>صب طبقات إضافية من السيليكون حتى يتدفق المستوى مع الجزء العلوي من النمط. انتظر 24 ساعة للعلاج (الشكل التكميلي S1G).</li>
	<li>قم بتفكيك الكتل البلاستيكية المجمعة معا لتحرير القالب. إزالة الأنماط (الشكل التكميلي S1H). افحص العفن بحثا عن التمزقات أو التشوهات (الشكل التكميلي S1I).</li>
</ol>4. صب حلقات البلاستيسول
<ol><li>قم بتغطية الجزء الداخلي من القالب وجميع المكونات الأساسية والحلقات O بزيت الطهي (الشكل التكميلي S2A ، B). ضع حلقة O حول الشق في منتصف قلب العمود المركزي ، وضع القلب في الفتحة المركزية لقالب حلقة البلاستيسول (الشكل التكميلي S2C).</li>
	<li>أدخل قلب قناة التوصيل في الفتحة الموجودة على جانب قالب حلقة البلاستيسول. قم بتوجيه الطرف على شكل حرف V في نهاية قلب قناة التسليم ليتماشى مع الحلقة O الموجودة في قلب العمود المركزي (الشكل التكميلي S2D ، E).</li>
	<li>قم بتسخين البلاستيسول في الميكروويف لمدة 10 ثوان قصيرة (الشكل التكميلي S2F ، G). حرك البلاستيسول برفق لتجنب الفقاعات (الشكل التكميلي S2H). كرر التسخين والتحريك حتى يصل المحلول إلى درجة حرارة تتراوح بين 160 درجة مئوية و 170 درجة مئوية (الشكل التكميلي S2I). تنبيه: ارتفاع درجة حرارة البلاستيسول يمكن أن يؤدي إلى إطلاق أبخرة سامة. نفذ الإجراء في منطقة جيدة التهوية أو غطاء دخان. لا تسخن البلاستيسول فوق 170 درجة مئوية.</li>
	<li>صب البلاستيسول المنصهر في قالب حلقة البلاستيسول بالقرب من الحافة الخارجية للقالب دون إدخال فقاعات (الشكل التكميلي S2J). انتظر 1 ساعة حتى تبرد حلقات البلاستيسول (الشكل التكميلي S2K). إزالة الحلقات من القالب. تأكد من الملاءمة المناسبة لجهاز DPI قبل الاستخدام في المقايسات التجريبية (الشكل التكميلي S2L).</li>
</ol>5. إرفاق جهاز DPI بالمصنع
<ol><li>ابحث عن موقع سلس وصحي على صندوق السيارة لمرفق الجهاز. تجنب أي نتوءات أو عقدة ، لأنها يمكن أن تسهم في تسرب الجهاز.</li>
	<li>استخدم مثقاب بقطر 2 مم لحفر ثقب أفقيا عبر مركز الجذع بزاوية 90 درجة مع سطح الجذع (الشكل التكميلي S3A). قم بتشغيل مثقاب الحفر من خلال الفتحة عدة مرات لتنظيفه وتنعيمه لإنشاء ثقب دون عائق (الشكل التكميلي S3B).</li>
	<li>قم بإنشاء شريحة عمودية في حلقة البلاستيسول على الجانب الآخر من قناة توصيل المركب (الشكل التكميلي S3C). قم بتركيب الحلقة حول المصنع ، وقم بتبطين قناة التسليم مع الفتحة المحفورة مسبقا (الشكل التكميلي S3D). ملاحظة: يجب أن تتلاءم الحلقة بشكل مريح حول الجذع لتجنب التسرب ؛ يمكن استخدام التجميعات الأساسية بأقطار مختلفة لصنع حلقات البلاستيسول لسيقان النباتات ذات الأحجام المختلفة.</li>
	<li>أضف جهاز DPI إلى حلقة البلاستيسول ، وتأكد من ملاءمتها معا بشكل مريح. قم بمحاذاة صنبور جهاز DPI مع قناة توصيل حلقة البلاستيسول والفتحة المحفورة (الشكل التكميلي S3E). ملاحظة: يمكن أن يكون استخدام مثقاب لمحاذاة الفتحة وفوهة جهاز DPI مفيدا.</li>
	<li>لف بإحكام بشريط سيليكون لتثبيت الجهاز في مكانه (الشكل التكميلي S3F). افحص الجهاز المجمع والمرفق بالكامل لضمان المحاذاة والتوجيه المناسبين للمصنع.</li>
</ol>6. تطبيق مركب الفائدة باستخدام جهاز DPI
<ol><li>استخدم حقنة أو ماصة لملء جهاز DPI بمحلول الاهتمام (الشكل التكميلي S3G). استخدم حقنة لاختراق شريط السيليكون وحلقة البلاستيسول على الجانب الآخر من جهاز DPI لسحب الهواء من القناة الداخلية وتجنب إدخال فقاعات الهواء في الأوعية الدموية للنبات (الشكل التكميلي S3H). استبدل أي مركب مستخرج مرة أخرى في جهاز DPI.</li>
	<li>أضف رقعة صغيرة إضافية من شريط السيليكون فوق الفتحة التي أنشأتها المحقنة لتقوية المنطقة ومنع التمزق. افحص الجهاز بحثا عن تسربات مرئية عند نقطة التعلق ، وافحص خزان الجهاز بحثا عن مستوى سائل ثابت. ملاحظة: يمكن استخدام الماء في البداية لاختبار التسريبات لتجنب إهدار محلول الاختبار.</li>
	<li>قم بتغطية الطرف المفتوح لجهاز DPI بغشاء مانع للتسرب بالشمع ، واسحبه لأسفل لتشكيل ختم وتقليل تبخر المركب التجريبي. قم بعمل ثقب واحد في فيلم الشمع بطرف حقنة لمنع تطور الفراغ ، ثم أعد ملء الجهاز (الشكل التكميلي S3I).</li>
	<li>افحص الجهاز يوميا للتأكد من المحاذاة الصحيحة للمكونات (الشكل التكميلي S3J) ، وقم بتعبئة السائل باستخدام حقنة لتجنب جفاف الخزان. كرر هذه العملية حتى يتم تقديم الكمية المطلوبة من الحل التجريبي. ملاحظة: يمكن إدخال المركبات بنجاح من جهاز معين لمدة تصل إلى 1 شهر. يجب اختبار فترات امتصاص الحل التي تتجاوز هذا الإطار الزمني تجريبيا قبل الإعداد التجريبي.</li>
</ol>7. استخدام CFDA لمراقبة حركة الأوعية الدموية مع نباتات الحمضيات
<ol><li>قم بتوصيل جهاز DPI بنباتات السترون (Citrus medica L.) التي يبلغ طولها 25 سم ، وقم بتطبيق علاج واحد سعة 2.0 مل إما بنسبة 20٪ DMSO في عنصر التحكم H2O أو CFDA بجهاز DPI ، واتركه يمتص لمدة 24 ساعة. لاتباع هذا البروتوكول ، قم بإعداد حل CFDA العامل عن طريق إضافة 1.6 مل من H 2 O إلى 400 ميكرولتر من محلول مخزون CFDA (يحتوي محلول المخزون على 10 mM CFDA مذاب في 100٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد [DMSO]) لتوليد تركيز CFDA نهائي يبلغ2mM و 20٪ DMSO.</li>
	<li>اصنع مقاطع عرضية لأنسجة مختلفة من النبات ، واستخدم مجهرا مجسما أو مجهرا مركبا مع مرشح فلورسنت يتضمن الطول الموجي 498 نانومتر لتصور CFDA في الأنسجة النباتية. قارن الصور ب 20٪ DMSO في عناصر التحكم H2O لحساب التألق الذاتي في الأنسجة.</li>
</ol>8. قياس التغيرات في عيار CLas في عينات الأوراق بعد العلاج بالستربتومايسين
<ol><li>باستخدام نباتات فالنسيا (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia") التي يبلغ ارتفاعها 0.75 مترا ، اجمع سويقات ووسط ورقتين من أعراض HLB من كل نبات ، وقم بتقطيعهما إلى أقسام صغيرة ، وتجميع كل نوع من الأنسجة ، وتخزينها بشكل منفصل في أنابيب عينة مقاومة للصدمات سعة 2 مل تحتوي على كرة فولاذية بقطر 6.35 مم.</li>
	<li>اطحن العينة باستخدام خالط مبرمج لدورتين مدة كل منهما 15 ثانية بسرعة 3.4 m/s. استخراج إجمالي الحمض النووي كما هو موضح سابقا19.</li>
	<li>إجراء qPCR على عينات الأوراق المصابة ب CLas باستخدام مزيج qPCR المحدد في الجدول 1 وظروف التفاعل المحددة في الجدول 2. استخدم النباتات التي تظهر عدوى CLas قوية (يتم تعريف العدوى القوية عموما على أنها قيم Ct المستندة إلى qPCR < 30 لمجموعة CLas 16S LasLong (LL) التمهيدية) لمزيد من التحليل. ملاحظة: يتم تقدير العيار البكتيري باستخدام CLas 16S Las Long (LL) وبادئات الحمض النووي لديهيدرين الحمضيات لتقدير مكافئات الجينوم النسبية ، كما هو موضح سابقا20.</li>
	<li>قم بتجهيز نباتات الحمضيات التي تلبي الحد الأدنى من عيار العدوى الموضح أعلاه بأجهزة DPI ، وأخضعها لعلاج لمرة واحدة بمقدار 2.0 مل من محلول H2O أو محلول الستربتومايسين بالتركيز المطلوب. لمتابعة هذه الدراسة ، استخدم علاجا واحدا سعة 2.0 مل من 9.5 مجم / مل (19 مجم في المجموع) من الستربتومايسين المذاب في H2O.</li>
	<li>اجمع عينات الأوراق في 7 أيام و 14 يوما و 28 يوما بعد المعالجة. فحص أوراق العينة لعيار CLas باستخدام نفس البروتوكول كما هو موضح أعلاه.</li>
	<li>في 60 يوما بعد العلاج ، احصل على صور للنباتات المعالجة ب H2O أو الستربتومايسين. استخدم الملاحظات المرئية لعدوى CLas لتسجيل شدة العدوى. ابحث عن <50٪ من الأوراق التي تظهر داء الاخضرار بين الأوردة والفلين الوريدي جنبا إلى جنب مع نمو تدفق الأوراق كعلامات على عدوى خفيفة وأكثر من 50٪ من الأوراق المصابة بالكلور بين الأوردة والفلين الوريدي بالإضافة إلى انقطاعات الأوراق وتقزم نمو النبات كعلامات على عدوى أكثر حدة.</li>
</ol>9. قياس معدل وفيات D. citri بعد العلاج بالإيميداكلوبريد
<ol><li>تقليم نباتات السترون بطول 0.5 متر (Citrus medica L.) على ارتفاع 12 سم لتشجيع نمو تدفق جديد. ملاحظة: يمكن أن تعتمد سرعة نمو التدفق على صحة النبات والوقت من السنة ؛ لذلك ، ضع ذلك في الاعتبار أثناء التصميم التجريبي.</li>
	<li>بعد >6 تدفق ، طوله 1-2 سم ، وضعت ، أدخل النباتات في أقفاص تحتوي على D. citri البالغ.اترك النباتات في الأقفاص لمدة 24 ساعة للسماح بترسب البيض.</li>
	<li>قم بإجراء عدد البيض التمثيلي على ثلاث براعم دافقة بعد 1-2 أيام من وضعها ، ثم قم بتطبيق أجهزة DPI. املأ هذه الأجهزة ب 2.0 مل من التحكم في الماء أو التركيز المطلوب من إيميداكلوبريد (21.8٪ مكون نشط). لاتباع هذا البروتوكول ، استخدم 528 ميكرولتر / لتر و 52.8 ميكرولتر / لتر و 5.28 ميكرولتر / لتر من إيميداكلوبريد. ملاحظة: يعد تعداد البيض مقياسا مدمرا ، لذلك يتم استخدام العد في هذه المرحلة لتقدير عدد البيض على التدفق غير المحسوب لنفس النبات والمساعدة في توفير خط أساس لأعداد ظهور الحوريات اللاحقة التي يتم إجراؤها في نهاية التجربة.</li>
	<li>اجمع معدل ظهور D. citri على ثلاثة على الأقل من براعم التدفق المتبقية. الحصول على صور تمثيلية للنبات بعد 7 أيام من إدخال المركب.</li>
</ol>

توصيل الجزيئات في النباتات باستخدام جهاز التسريب المباشر

<ol>
	<li>Hu, J., Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+spatiotemporal+dynamics+of+oxytetracycline+and+its+control+effect+against+citrus+huanglongbing+via+trunk+injection.">Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection.</a> Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).</li><li>Bendix, C., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enemy+within:+Phloem-limited+pathogens.">The enemy within: Phloem-limited pathogens.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).</li><li>Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+plant+transformation-+A+review.">Methods of plant transformation- A review.</a> International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).</li><li>Qaim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+new+plant+breeding+technologies+for+food+security+and+sustainable+agricultural+development.">Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development.</a> Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).</li><li>Siegrist, M., Hartmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consumer+acceptance+of+novel+food+technologies.">Consumer acceptance of novel food technologies.</a> Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).</li><li>Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radially+sectored+hydraulic+pathways+in+the+xylem+of+Thuja+occidentalis+as+revealed+by+the+use+of+dyes.">Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes.</a> International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).</li><li>Mehdi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symplasmic+phloem+unloading+and+radial+post-phloem+transport+via+vascular+rays+in+tuberous+roots+of+Manihot+esculenta.">Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).</li><li>Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+fluorescent+antibiotic+conjugate+in+planta+utilizing+fluorescence+lifetime+imaging.">Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging.</a> Planta. 253 (2), (2021).</li><li>Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+and+axial+water+movement+in+adult+trees+recorded+by+stable+isotope+tracing.">Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing.</a> Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).</li><li>Nie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liping+Hu,+Haiyan+Zhang,+Jixiang+Zhang,+Zhenxian+Zhang,+Lingyun+Zhang,+The+predominance+of+the+apoplasmic+phloem-unloading+pathway+is+interrupted+by+a+symplasmic+pathway+during+Chinese+jujube+fruit+development.">Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development.</a> Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).</li><li>Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shootward+movement+of+CFDA+tracer+loaded+in+the+bottom+sink+tissues+of+Arabidopsis.">Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).</li><li>Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zhe+Sun,+Yanxi+Shi,+from+apoplasmic+to+symplasmic+phloem+unloading+during+storage+roots+formation+and+bulking+of+sweet+potato.">Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato.</a> Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).</li><li>Erdos, T., Ullmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+streptomycin+on+the+incorporation+of+amino-acids+labeled+with+carbon-14+into+ribonucleic+acid+and+protein+in+a+cell-free+system+of+a+Mycobacterium.">Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium.</a> Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).</li><li>Bov&#233;, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huanglongbing:+A+destructive,+newly-emerging,+century-old+disease+of+citrus.">Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus.</a> Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).</li><li>Motaung, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloronicotinyl+insecticide+imidacloprid:+Agricultural+relevance,+pitfalls+and+emerging+opportunities.">Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities.</a> Crop Protection. 131, 105097 (2020).</li><li>Berger, C., Laurent, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trunk+injection+of+plant+protection+products+to+protect+trees+from+pests+and+diseases.">Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases.</a> Crop Protection. 124, 104831 (2019).</li><li>Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trunk+injection+as+a+tool+to+deliver+plant+protection+materials-An+overview+of+basic+principles+and+practical+considerations.">Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations.</a> Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).</li><li>Wise, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trunk+injection:+A+discriminating+delivering+system+for+horticulture+crop+IPM.">Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM.</a> Entomology, Ornithology &amp; Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).</li><li>Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asian+citrus+psyllid+adults+inoculate+Huanglongbing+bacterium+more+efficiently+than+nymphs+when+this+bacterium+is+acquired+by+early+instar+nymphs.">Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).</li><li>Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth,+health+and+Liberibacter+asiaticus+titer+in+diverse+citrus+scions+on+mandarin+versus+trifoliate+hybrid+rootstocks+in+a+field+planting+with+severe+Huanglongbing.">Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing.</a> Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).</li><li>Akaike, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+the+statistical+model+identification.">A new look at the statistical model identification.</a> IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).</li><li>Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+hairpin+RNAs+and+small+RNAs+into+woods+and+herbaceous+plants+by+trunk+injection+and+petiole+absorption.">Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).</li><li>Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+excised-leaf+assay+method+to+test+inoculativity+of+Asian+citrus+psyllid+(Hemiptera:+Psyllidae)+with+Candidatus+Liberibacter+asiaticus+associated+with+citrus+Huanglongbing+disease.">New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease.</a> Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح. استخدام الأسماء التجارية أو الشركات أو الشركات في هذا المنشور هو لإعلام القارئ وراحته. لا يشكل هذا الاستخدام تأييدا أو موافقة رسمية من قبل وزارة الزراعة الأمريكية أو خدمة البحوث الزراعية على أي منتج أو خدمة باستثناء المنتجات أو الخدمات الأخرى التي قد تكون مناسبة. تحظر وزارة الزراعة الأمريكية (USDA) التمييز في جميع برامجها وأنشطتها على أساس العرق أو اللون أو الأصل القومي أو العمر أو الإعاقة ، وعند الاقتضاء ، الجنس أو الحالة الاجتماعية أو الحالة العائلية أو الحالة الأبوية أو الدين أو التوجه الجنسي أو المعلومات الجينية أو المعتقدات السياسية أو الانتقام أو لأن كل أو جزء من دخل الفرد مستمد من أي برنامج مساعدة عامة. لا تنطبق جميع القواعد المحظورة على جميع البرامج. يجب على الأشخاص ذوي الإعاقة الذين يحتاجون إلى وسائل بديلة لتوصيل معلومات البرنامج (طريقة برايل ، والطباعة الكبيرة ، والشريط الصوتي ، وما إلى ذلك) الاتصال بمركز TARGET التابع لوزارة الزراعة الأمريكية على (202) 720-2600 (الصوت و TDD). لتقديم شكوى من التمييز ، اكتب إلى وزارة الزراعة الأمريكية ، مدير مكتب الحقوق المدنية ، 1400 شارع الاستقلال ، جنوب غرب ، واشنطن العاصمة 20250-9410 ، أو اتصل بالرقم (800) 795-3272 (صوت) أو (202) 720-6382 (TDD). وزارة الزراعة الأمريكية هي مزود تكافؤ الفرص وصاحب العمل.

لكي يعتبر جهاز DPI طريقة قابلة للتطبيق لتوصيل المركبات الخارجية إلى النباتات ، يجب أن يساهم في امتصاص مركب قوي ومتسق في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة. أظهرت التجربة التي استخدمت CFDA بوضوح حركة كل من المركب acropetal و basipetal ، وكذلك في كل من نظام الأوعية الدموية وخلايا mesophyll من الورقة. بالإضافة إلى ذلك ، ومن المفترض أن يكون الثقب بالملل المستخدم في جهاز DPI هذا يوفر مساحة كبيرة من السطح لامتصاص المركب ، كان CFDA موجودا بكميات متساوية نسبيا في جميع أقسام الساق ، وليس فقط في مجموعة فرعية صغيرة من الأوعية الدموية المجاورة للجهاز ، كما شوهد في دراسات امتصاص الصبغة السابقة في النباتات باستخدام حقن الجذع6. بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار توصيل البروتين الفلوري الأخضر وصبغة الأزهار باستخدام جهاز DPI ، ولوحظ توزيع لهذه المركبات مشابه ل CFDA (البيانات غير معروضة). تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن استخدام الجهاز لتقديم مجموعة متنوعة من المركبات التي تختلف في الحجم والتركيب الجزيئي بشكل منهجي. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى وجود اختلافات في امتصاص المركب بناء على مرحلة نمو الأوراق ، حيث تأخذ الأوراق النامية الأصغر سنا مركبا أكثر من الأوراق القديمة. قد يكون هذا بسبب التغيرات في خصائص الأوعية الدموية الموجودة في أنسجة الحوض مقابل المصدر ويجب تحسينها لتجربة معينة. 
أظهر جهاز DPI امتصاصا كافيا للمركب لتصور CFDA و GFP وصبغة الأزهار ، كما أنه استغرق ما يكفي لإظهار التأثيرات المضادة للبكتيريا والمبيدات الحشرية للستربتومايسين والإيميداكلوبريد ، على التوالي. أدى كل من هذه المركبات إلى تغييرات في صلاحية الكائن المستهدف بعد أسبوع واحد من علاج واحد 2.0 مل. تشير هذه البيانات إلى أنه يمكن استخدام جهاز DPI في فحوصات النبات بالكامل لاختبار صلاحية مجموعة واسعة من المركبات لمكافحة الآفات الميكروبية والحشرية. علاوة على ذلك ، نظرا لاتصاله المباشر بنظام الأوعية الدموية ، قد يوفر هذا الجهاز فرصة لاختبار المركبات التي لا تمتصها الجذور أو خلايا البشرة بكفاءة. سيكون تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) ذا أهمية خاصة ، حيث يمكن استخدامه لتعديل التعبير الجيني داخل النبات المضيف أو مسبب المرض أو ناقل مسببات الأمراض. أظهرت الأبحاث السابقة التي أدخلت الحمض النووي الريبي دبوس الشعر من خلال ثقب محفور في جذع نباتات التفاح والعنب أن جزيئات الحمض النووي الريبي كانت مقتصرة على نسيج الخشب ، مما يشير إلى أن هذه الجزيئات قد تكون فعالة فقط ضد الكائنات الحية التي تتغذى على عصارة نسيجالخشب 22. وبالنظر إلى أن جهاز DPI يستخدم نظاما مماثلا لتوصيل الثقوب المحفورة، فمن المنطقي أن الحمض النووي الريبوزي (RNA) ذو الدبوس الشعري الذي يتم توصيله باستخدام هذا الجهاز قد يقتصر أيضا على نسيج الخشب. ومع ذلك ، فإن الانخفاض الملحوظ في عيار CLas المحدود باللحاء بعد علاج الستربتومايسين من جهاز DPI يشير بقوة إلى أن هذا المضاد الحيوي كان موجودا في اللحاء. لذلك ، من المحتمل أن يعتمد التوزيع الوعائي للمركبات التي يتم تسليمها باستخدام جهاز DPI على حجمها وكيمياءها ، ويجب تقييم كل جزيء على أساس فردي.
على الرغم من وجود عدد من أجهزة DPI المتاحة تجاريا في السوق ، إلا أن الجهاز الموصوف هنا يمكن تصنيعه داخليا وقابل للتعديل. وبهذه الطريقة ، يمكن إجراء تحسينات وتغييرات في الحجم بناء على الأنواع النباتية والتصميم التجريبي المستخدم ، ولا تعتمد على المنتجات التجارية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توصيل الجهاز بشكل شبه دائم بالنبات ، مما يعني أنه يمكن إجراء معالجات متعددة لمركب معين في وقت واحد دون الحاجة إلى إعادة إصابة النبات بحقن مركبة متعددة. في ملاحظة تحذيرية ، يمكن أن يتسرب الجهاز إذا لم يتم تثبيته بشكل صحيح. نتيجة لذلك ، يتم فقدان المركب في البيئة بدلا من تسليمه إلى المصنع. لذلك ، يجب توخي الحذر لفحص الجهاز بحثا عن أي علامات تسرب أثناء الإعداد والأيام القليلة الأولى بعد ذلك. على الرغم من أن حفر حفرة في الشجرة قد يكون ضارا ، فقد تم اختيار هذه الطريقة لضمان امتصاص مركب قوي ومتسق. بالإضافة إلى ذلك ، لم يلاحظ أي آثار ضارة على صحة النبات من ربط جهاز DPI في هذه التجارب. ومع ذلك ، يجب تضمين نباتات إضافية في التصميم التجريبي لتحل محل تلك التي قد تفقد قوتها طوال فترة تجربة معينة. أخيرا ، نظرا لأن هذا الجهاز يستخدم التدفق السلبي لإدخال المركبات ، فقد يكون من الصعب التنبؤ بمعدل الامتصاص عبر أنواع نباتية مختلفة أو مراحل نمو نفس النوع. قد يؤدي هذا إلى تعقيد التجارب إذا كانت سرعة امتصاص المركب عاملا مقيدا. للحصول على أفضل النتائج ، يجب التخطيط للتجارب بحيث يتم توفير وقت كاف للمصنع لامتصاص 2.5 مل من المركب بالكامل ، الأمر الذي قد يستغرق ما يصل إلى أسبوع واحد. في الختام ، يعد جهاز DPI هذا أداة فعالة للتقييم السريع لنشاط المركبات المضادة للميكروبات أو المبيدات الحشرية في النبات ضد CLas وناقله ، D. citri ، وبالتالي توفير مزيد من المعلومات حول الفعالية النظامية والتأثير على أداء النبات من مقايسة الأوراق المنفصلة المقدمة سابقا23. مما لا شك فيه أن تنوع التطبيقات لهذا النظام يتجاوز الاستخدامات المحددة الموضحة في هذه الدراسة.

غالبا ما تتطلب إدارة النباتات في البيئات التجارية والمناظر الطبيعية استخدام المركبات الكيميائية لتحسين نمو النبات وصحته. تعتمد كيفية توصيل هذه الجزيئات على نوع الجزيء ووظيفة الجزيء ونوع النبات ونظام الإدارة المعمول به. التطبيقات الورقية والتربة هي أسهل استراتيجيات التسليم ، لكن القيود في امتصاص بعض الجزيئات تتطلب التسليم المباشر. مثال على هذه الجزيئات هو الجزيئات العلاجية التي تعمل بشكل أفضل عندما تتحرك بشكل منتظم داخل النبات ولكن لا يمكن توصيلها بشكل فعال عن طريق التطبيقات الموضعية البسيطة1. هذا هو الحال مع Huanglongbing (HLB) ، وتسمى أيضا مرض تخضير الحمضيات. HLB هو مرض مرتبط ببكتيريا محدودة اللحاء ، Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) ، والتي لا يمكن زراعتها خارج النبات ، أو ناقل الحشرات ، Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) 2.
إذا كانت الجزيئات العلاجية المفترضة عبارة عن منتجات جينية ، فيمكن اختبارها عن طريق إنشاء نباتات محورة وراثيا تعبر عن هذه المركبات. ومع ذلك ، يمكن أن يكون إنتاج النباتات المعدلة وراثيا كثيف الوقت والموارد ، ويعتمد بشكل كبير على النمط الجيني ، ويمكن تثبيطه عن طريق إسكات الجينات3. بالإضافة إلى ذلك ، حتى لو أظهرت هذه الجينات المحورة نتائج واعدة ، فإن قيود الإدراك التنظيمي والعام تقلل من احتمال قبولها التجاري 4,5. ومع ذلك ، فإن التطبيق الخارجي للمركبات يبسط اختبار الجزيئات البيولوجية والاصطناعية لأنه لا يتطلب إنتاج نباتات محورة وراثيا مستقرة أو عابرة ، مما يقلل من الوقت والموارد لاختبار تأثيرات الجزيء. يمكن استخدام طريقة لتوصيل النباتات النظامية الفعالة والكفؤة للمركبات الخارجية لمجموعة واسعة من أغراض البحث والفرز.
أحد هذه التطبيقات هو تحليل حركة الجزيئات الجهازية داخل نظام الأوعية الدموية للنبات ، والذي يمكن إجراؤه باستخدام علامات قابلة للتتبع ، سواء كانت نظائر كيميائية فلورية أو مرئية أو فريدة من نوعها6،7،8،9. إحدى علامات الفلورسنت شائعة الاستخدام هي 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA) ، وهي صبغة منفذة للغشاء تتحلل بواسطة الإسترات داخل الخلايا إلى 5,6-carboxyfluorescein (CF) ، وبالتالي تصبح فلورية وغير منفذةللغشاء 10. تم استخدام CFDA على نطاق واسع لمراقبة انتقال اللحاء ، وعلاقات الحوض والمصدر ، وأنماط الأوعية الدموية في الأنسجة النباتية11،12.
بالإضافة إلى هذه العلامات ، قد تغير بعض المركبات بشكل مباشر فسيولوجيا النبات لزيادة الإنتاجية أو قتل النبات في حالة مبيدات الأعشاب. كل من المبيدات الحشرية والمركبات المضادة للميكروبات هي وسيلة لزيادة إنتاجية النبات ، وخاصة في وجود HLB. مثال على جزيء مضاد للميكروبات يستخدم للتحكم في CLas هو الستربتومايسين. الستربتومايسين هو مضاد حيوي أمينوغليكوزيد تم عزله في الأصل من Streptomyces griseus وقد ثبت أنه يمنع نمو البكتيريا من خلال تثبيط التخليق الحيوي للبروتين13. من حيث المبيدات الحشرية ، فإن الهدف الرئيسي لأبحاث HLB هو D. citri ، الذي ينقل CLas من شجرة إلىشجرة 14. لهذا الغرض ، يشيع استخدام مبيدات النيونيكوتينويد ، مثل إيميداكلوبريد ، لأنها المعيار الذهبي لمكافحة الآفات الحشرية15. كل هذه الاستخدامات المتنوعة هي جوانب مهمة لاستراتيجيات إدارة المصنع الحالية ، ويعتمد تطوير منتجات جديدة على فحوصات الفحص الفعالة.
إحدى الطرق المستخدمة لإدخال المركبات في النباتات الخشبية هي الحقن المباشر في الجذع. تم تصميم مجموعة متنوعة من الأنظمة التي تختلف في احتياجاتها لمواقع الحقن مسبقة الحفر ، وتستخدم هذه الأنظمة إما الحقن القائم على الضغط أو التدفق السلبي16. على الرغم من أن الأنظمة القائمة على الضغط تسمح بالإدخال السريع لمركب معين ، إلا أنه يجب النظر في الضرر المادي المحتمل الناجم عن إجبار السائل من خلال الأوعية الدموية المسدودة أو الانصمام17. على الرغم من أن التطبيق الورقي أو الغمر للمركبات أقل استهلاكا للوقت في التنفيذ ، إلا أن الحقن المباشر للنبات يقلل من هدر المركب محل الاهتمام بسبب الخسائر في الهواء أو التربة ويمكن أيضا إطالة الوقت الذي تكون فيه المركبات في حالة نشطة عن طريق تقليل التعرض للبيئة الخارجية18. كلا هذين الجانبين مهمان للحفاظ على الكواشف باهظة الثمن وضمان الاتساق بين النسخ المتماثلة في إعدادات البحث.
تصف هذه الدراسة تصميم وبناء واستخدام جهاز مبتكر للتسريب المباشر للنبات (DPI) ، والذي يمكن استخدامه لتقييم كيفية تأثير المركبات ذات الأهمية على النبات المضيف. تم استخدام طابعة 3D قياسية لتصنيع كل من الجهاز نفسه والعديد من المكونات المرتبطة ببنائه. تسمح طريقة البناء الداخلية هذه للباحثين بتعديل الجهاز ومكونات الجهاز بناء على احتياجاتهم التجريبية المحددة وتقلل من الاعتماد على أجهزة حقن النباتات المتاحة تجاريا. إعداد الجهاز بسيط وفعال ، وجميع المكونات الإضافية متاحة بسهولة وغير مكلفة. على الرغم من أن النظام مصمم للاستخدام مع مجموعة متنوعة من الأنواع النباتية ، إلا أن الأمثلة المقدمة هنا تتعلق بنباتات الحمضيات المحفوظة بوعاء. بالإضافة إلى ذلك ، توضح هذه الدراسة أن هذا الجهاز قادر على توصيل أنواع متعددة من المركبات بكفاءة بشكل منهجي إلى نباتات الحمضيات الصغيرة دون التسبب في الفتك. وشملت المركبات التي تم اختبارها CFDA ، الذي تم استخدامه لتقييم توزيع المركبات في النبات ، والستربتومايسين والإيميداكلوبريد ، والتي تم استخدامها للتحقق من أن التأثيرات المضادة للميكروبات والمبيدات الحشرية لهذه المركبات قد لوحظت عند تسليمها عبر DPI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 cm Diameter Steel Balls</td>
			<td>Ballistic Products Inc.</td>
			<td>#SHT #T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>382903029952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 G 1 Syringe Needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Screw Cap Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-9710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printer</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-PR-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-SW-FDVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Printing Software</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>S-FW-OEVX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5/64th Inch Black Oxide Drill Bit</td>
			<td>Sears</td>
			<td>964502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well qPCR Machine</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5815916001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22621408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SP-BX43-BI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Microscope Filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>69401-ET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloss Clear Spray Paint</td>
			<td>Rustoleum</td>
			<td>249117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grey Lego Baseplate</td>
			<td>Lego</td>
			<td>11024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld Cordless Drill</td>
			<td>Makita</td>
			<td>6349D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidacloprid 2F</td>
			<td>Quali-Pro</td>
			<td>83080133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Plastisol Medium Hardness</td>
			<td>Fusion X Fishing Lures</td>
			<td>XSOL-505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Silicone 70 Shore A O-Ring</td>
			<td>Grainger</td>
			<td>Varies by Size</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Stick Cooking Spray</td>
			<td>PAM</td>
			<td>64144030217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plant II</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740770.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly Viyl Acetate Based Glue</td>
			<td>Elmers</td>
			<td>E301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Master Mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Varies by DNA sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse Transcriptase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A5003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>Garvey</td>
			<td>40475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Translucent Silicone RTV Rubber</td>
			<td>Aero Marine Products</td>
			<td>AM 115T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent Silicone Tape</td>
			<td>Maxwell</td>
			<td>KE30S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truncated Oncocin 112</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>Varies by peptide sequence</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White 1 x 6 Lego Piece</td>
			<td>Lego</td>
			<td>300901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Nylon</td>
			<td>Markforged</td>
			<td>F-MF-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct infusion device for molecule delivery in plants

يعد اختبار وظيفة المركبات العلاجية في النباتات مكونا مهما في البحوث الزراعية. تعتبر طرق النقع الورقي والتربة روتينية ولكن لها عيوب ، بما في ذلك الامتصاص المتغير والانهيار البيئي للجزيئات المختبرة. إن حقن جذع الأشجار راسخ ، لكن معظم الطرق لذلك تتطلب معدات باهظة الثمن وخاصة. لفحص العلاجات المختلفة ل Huanglongbing ، هناك حاجة إلى طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة لتوصيل هذه المركبات إلى الأنسجة الوعائية لأشجار الحمضيات الصغيرة المزروعة في البيوت الزجاجية المصابة ببكتيريا Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) المحدودة اللحاء أو المصابة بناقل الحشرات CLas الذي يتغذى على اللحاء Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
لتلبية متطلبات الفحص هذه ، تم تصميم جهاز التسريب المباشر للنبات (DPI) الذي يتصل بجذع المصنع. الجهاز مصنوع باستخدام نظام طباعة 3D قائم على النايلون ومكونات مساعدة يمكن الحصول عليها بسهولة. تم اختبار فعالية امتصاص المركب لهذا الجهاز في نباتات الحمضيات باستخدام علامة الفلورسنت 5،6-كربوكسي فلوريسئين-دياسيتات. لوحظ بشكل روتيني توزيع مركب موحد للعلامة في جميع أنحاء النباتات.
علاوة على ذلك ، تم استخدام هذا الجهاز لتوصيل جزيئات مضادة للميكروبات ومبيدات الحشرات لتحديد آثارها على CLas و D. citri على التوالي. تم تسليم الستربتومايسين المضاد الحيوي أمينوغليكوزيد إلى نباتات الحمضيات المصابة ب CLas باستخدام الجهاز ، مما أدى إلى انخفاض عيار CLas من 2 أسابيع إلى 4 أسابيع بعد العلاج. أدى توصيل مبيد الحشرات النيونيكوتينويد إيميداكلوبريد إلى نباتات الحمضيات الموبوءة ب D. citri إلى زيادة كبيرة في وفيات سيلليد بعد 7 أيام. تشير هذه النتائج إلى أن جهاز DPI هذا يمثل نظاما مفيدا لتوصيل الجزيئات إلى النباتات لاختبارها وتسهيل أغراض البحث والفحص.

The management of plants in commercial and landscape settings often requires the use of chemical compounds to optimize the plant growth and health. How these molecules are delivered depends on the type of molecule, the function of the molecule, the type of plant, and the management system in place. Foliar and soil applications are the easiest delivery strategies, but limitations in the uptake of some molecules necessitate direct delivery. An example of these molecules is therapeutic molecules that function best when they move systemically within the plant but cannot be effectively delivered by simple topical applications1. This is the case with Huanglongbing (HLB), also called citrus greening disease. HLB is a disease associated with a phloem-limited bacterium, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), which cannot be cultured outside of the plant, or its insect vector, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
If the putative therapeutic molecules are gene products, they can be tested by creating transgenic plants expressing these compounds. However, transgenic plant production can be time- and resource-intensive, is highly genotype-dependent, and can be inhibited by gene silencing3. In addition, even if these transgenics show promising results, regulatory and public perception constraints reduce the likelihood of their commercial acceptance4,5. The exogenous application of compounds, however, simplifies the testing of biological and synthetic molecules because it does not require the production of stable or transiently expressing transgenic plants, which reduces the time and resources for testing a molecule&#39;s effects. A method for the effective and efficient systemic plant delivery of exogenous compounds could be used for a wide variety of research and screening purposes.
One of these applications is the analysis of systemic molecule movement within a plant&#39;s vascular system, which can be done using trackable markers, whether they are fluorescent, visible, or unique chemical isotopes6,7,8,9. One commonly used fluorescent marker is 5,6-carboxyfluorescein-diacetate (CFDA), which is a membrane-permeable dye that is degraded by intracellular esterases into 5,6-carboxyfluorescein (CF) and, subsequently, becomes fluorescent and membrane-impermeable10. CFDA has been extensively used to monitor phloem transport, sink and source relationships, and vasculature patterning in plant tissue11,12.
In addition to these markers, certain compounds may directly alter the plant&#39;s physiology to increase the productivity or kill the plant in the case of herbicides. Both insecticides and antimicrobial compounds are a means of increasing plant productivity, especially in the presence of HLB. An example of an antimicrobial molecule that is used to control CLas is streptomycin. Streptomycin is an aminoglycoside antibiotic that was originally isolated from Streptomyces griseus and has been shown to inhibit bacterial growth through the inhibition of protein biosynthesis13. In terms of insecticides, the main target for HLB research is D. citri, which transmits CLas from tree to tree14. For this purpose, neonicotinoids, such as imidacloprid, are commonly utilized, as they are the gold standard for controlling insect pests15. All these varied uses are important aspects of current plant management strategies, and the development of novel products is dependent on efficient screening assays.
One method that is used for the introduction of compounds into woody plants is direct injection into the trunk. A variety of systems have been designed that vary in their needs for predrilled injection sites, and these systems utilize either pressure-based injection or passive flow16. Although pressure-based systems allow for the quick introduction of a given compound, the potential physical damage caused by forcing liquid through blocked or embolized vasculature needs to be considered17. Although the foliar or drench application of compounds is less time-intensive to implement, direct plant injection reduces waste of the compound of interest due to losses to the air or soil and can also lengthen the time that compounds are in an active state by reducing the exposure to the outside environment18. Both these aspects are important for preserving expensive reagents and ensuring consistency among replicates in research settings.
This study describes the design, construction, and use of an innovative direct plant infusion (DPI) device, which can be used to assess how compounds of interest affect a host plant. A standard 3D printer was used to manufacture both the device itself and several components associated with its construction. This in-house construction method allows researchers to modify the device and device components based on their specific experimental needs and reduces the reliance on commercially available plant injection devices. The device setup is simple and efficient, and all the auxiliary components are readily available and inexpensive. Although the system was designed for use with a variety of plant species, the examples presented here pertain to potted citrus plants. Additionally, this study demonstrates that this device is capable of efficiently delivering multiple types of compounds systemically to young citrus plants without causing lethality. The compounds tested included CFDA, which was used to assess the compound distribution in the plant, and streptomycin and imidacloprid, which were used to verify that the antimicrobial and insecticidal effects of these compounds were observed when delivered via DPI.

تسليط الضوء على المؤلف: جهاز التسريب المباشر لتوصيل الجزيئات في النباتات  

جهاز التسريب المباشر لتوصيل الجزيئات في النباتات

Delivering a therapeutic molecule to where a pathogen resides in a plant can be challenging. Treating Candidatus Liberibacter asiaticus, or CLas, a bacteria that is limited to the phloem, poses one of the biggest challenges in delivering molecules against it, especially when using conventional methods such as spray applications. The ease of printing the direct plant infusion device and its simple implementation makes it accessible to anyone.This enables the widespread screening of molecules for their potential therapeutic effect in trees. An added benefit is that the diffusion of molecules utilizes the natural process of plant transpiration. Our research improved efficiency and precision of molecular delivery in plants, which can be used for a range of research applications.By screening hundreds of molecules on small plants, we can eliminate the need for larger trees, leading to a reduction in cost and space utilization.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants at JoVE.com

تصف هذه المخطوطة جهازا جديدا للتسريب المباشر للنبات لفحص فعالية الجزيئات ضد البكتيريا (Candidatus Liberibacter asiaticus) أو ناقلها للحشرات (Diaphorina citri، Kuwayama) المرتبطة مجتمعة بمرض هوانغ لونغبينغ الحمضيات.

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but ...

قد يكون توصيل جزيء علاجي إلى حيث يوجد مسبب المرض في النبات أمرا صعبا. يشكل علاج Candidatus Liberibacter asiaticus ، أو CLas ، وهي بكتيريا تقتصر على اللحاء ، أحد أكبر التحديات في توصيل الجزيئات ضدها ، خاصة عند استخدام الطرق التقليدية مثل تطبيقات الرش. سهولة طباعة جهاز التسريب المباشر للمصنع وتنفيذه البسيط يجعله في متناول أي شخص.وهذا يتيح الفحص الواسع النطاق للجزيئات لتأثيرها العلاجي المحتمل في الأشجار. ومن المزايا الإضافية أن انتشار الجزيئات يستخدم العملية الطبيعية لنتح النبات. أدى بحثنا إلى تحسين كفاءة ودقة التسليم الجزيئي في النباتات ، والتي يمكن استخدامها لمجموعة من التطبيقات البحثية.من خلال فحص مئات الجزيئات على النباتات الصغيرة ، يمكننا القضاء على الحاجة إلى أشجار أكبر ، مما يؤدي إلى تقليل التكلفة واستخدام المساحة.

direct-infusion-device-for-molecule-delivery-in-plants

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Infusion Device for Molecule Delivery in Plants

1.3K Views.  United States Department of Agriculture Agricultural Research Service U.S. Horticultural Research Laboratory. قد يكون توصيل جزيء علاجي إلى حيث يوجد مسبب المرض في النبات أمرا صعبا. يشكل علاج Candidatus Liberibacter asiaticus ، أو CLas ، وهي بكتيريا تقتصر على اللحاء ، أحد أكبر التحديات في توصيل الجزيئات ضدها ، خاصة عند استخدام الطرق التقليدية مثل تطبيقات الرش. سهولة طباعة جهاز التسريب المباشر للمصنع و?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: جهاز التسريب المباشر لتوصيل الجزيئات في النباتات  

Testing the function of therapeutic compounds in plants is an important component of agricultural research. Foliar and soil-drench methods are routine but have drawbacks, including variable uptake and the environmental breakdown of tested molecules. Trunk injection of trees is well-established, but most methods for this require expensive, proprietary equipment. To screen various treatments for Huanglongbing, a simple, low-cost method to deliver these compounds to the vascular tissue of small greenhouse-grown citrus trees infected with the phloem-limited bacterium Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) or infested with the phloem-feeding CLas insect vector Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) is needed.
To meet these screening requirements, a direct plant infusion (DPI) device was designed that connects to the plant&#39;s trunk. The device is made using a nylon-based 3D-printing system and easily obtainable auxiliary components. The compound uptake efficacy of this device was tested in citrus plants using the fluorescent marker 5,6-carboxyfluorescein-diacetate. Uniform compound distribution of the marker throughout the plants was routinely observed.
Furthermore, this device was used to deliver antimicrobial and insecticidal molecules to determine their effects on CLas and D. citri respectively. The aminoglycoside antibiotic streptomycin was delivered into CLas-infected citrus plants using the device, which resulted in a reduction in the CLas titer from 2 weeks to 4 weeks post treatment. Delivering the neonicotinoid insecticide imidacloprid into D. citri-infested citrus plants resulted in a significant increase in psyllid mortality after 7 days. These results suggest that this DPI device represents a useful system for delivering molecules into plants for&#160;testing and facilitate research and screening purposes.

This manuscript describes a novel direct plant infusion device for screening the effectiveness of molecules against the bacteria (Candidatus Liberibacter asiaticus) or its insect vector (Diaphorina citri, Kuwayama) that, in combination, are associated with Huanglongbing citrus disease.

﻿3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings

3D-Printing of Direct Plant Infusion (DPI) Device and Fabrication of Plastisol Rings  

To begin 3D printing the direct plant infusion or DPI device and mold components, apply a thin layer of polyvinyl acetate-based glue on the print bed of the printer. Load nylon filament into the printer and prepare the printer per the manufacturer's instructions. After importing the desired STL files, set up the printer and start printing.Once the piece is removed from the print bed after printing, rinse the polyvinyl acetate-based glue from the base of the printed component with water. Spray the printed DPI device and other components with two coats of clear gloss spray paint. To fabricate the plastisol ring mold, assemble a mold form by building a rectangular enclosure using snap-together plastic blocks on a base.It should be large enough to hold the pattern pieces. Mix the room temperature vulcanizing silicone or RTV silicone monomer and the catalyst together at a 10:1 ratio by stirring for one minute. Color the solution by adding three drops of food coloring and one milliliter of hand soap per 25 milliliters of silicone mixture.Then, pour a thin layer of the silicone solution into the mold form sufficiently to fully cover the bottom of the mold form. Tamp to flatten the surface of the poured silicone, and wait for 24 hours to set the silicone. Once the silicone is set, pour another layer of silicone deep enough to cover the center hole core print of the pattern.Insert the pattern into the liquid silicone with the center hole core print facing down. Ensure that no bubbles are trapped and the patterns are well separated and not touching each other. Secure the patterns with either a heavy object or tape to prevent them from floating out of the silicone while it sets.Once set, pour additional layers of silicone into the mold form until the level is flush with the top of the pattern. Let the silicone cure for 24 hours. Disassemble the snap-together plastic blocks to release the mold.Then, remove the patterns from the mold and inspect the mold for tears or deformities. For casting the plastisol rings, coat the interior of the mold, all the core components, and the O-rings with cooking oil. Place an O-ring around the notch in the middle of the center post core, and place the core in the center hole of the plastisol ring mold.Insert the delivery channel core into the space on the side of the plastisol ring mold. Orient the V-shaped tip at the end of the delivery channel core to align with the O-ring on the center post core. Next, heat plastisol in the microwave for short bursts of 10 seconds till the solution reaches 160 to 170 degrees Celsius.In between, stir the plastisol gently to avoid bubbles. Pour the molten plastisol into the plastisol ring mold near the outside edge of the mold without introducing bubbles. Wait one hour for the plastisol rings to cool.Then, remove the rings from the mold. The DPI device was eight centimeters in height and three centimeters in width. It had a single central reservoir contiguous with the spout.The total volume that can be contained within these components is 2.0 milliliters. The 1.8 centimeter tall and 2.7 centimeter wide plastisol ring also contained two channels. One to accommodate the DPI device spout and another of variable diameter for fitting around the trunk of the tree.When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree.

3D- الطباعة من جهاز التسريب المباشر للنبات (DPI) وتصنيع حلقات البلاستيسول

Attachment of the Direct Plant Infusion (DPI) Device to Citrus Plants for Compound Injection

Propagate small potted citrus trees from rooted vegetative cuttings or seeds. Grow the potted citrus lines at 28 degrees Celsius, maintaining a proper day length. Select citrus plants of the appropriate size for the experiment.To attach the 3D-printed Direct Plant Infusion or DPI device to the trunk of the plant, find a smooth, healthy site on the trunk without bumps or knots. Using a two-millimeter-diameter drill bit, horizontally drill a hole through the center of the stem at an angle of 90 degrees to the trunk surface. Run the drill bit through the hole several times to create an unobstructed, smooth hole.Then create a vertical slice in the plastisol ring on the opposite side of the compound delivery channel. Fit the ring around the plant, aligning the delivery channel with the previously-drilled hole. Attach the DPI device to the plastisol ring, ensuring they fit snugly together, and align the DPI device spout with the plastisol ring delivery channel and the drilled hole.Wrap it tightly with silicone tape to hold the apparatus in place. Inspect the fully assembled and attached device to ensure proper alignment and orientation. The groove around the vertical channel allowed additional compound uptake through the bark.When assembled properly, the plastisol ring flushed against the DPI device and the spout lined up with a hole drilled in the tree.

ربط جهاز التسريب المباشر للنبات (DPI) بنباتات الحمضيات للحقن المركب

Applying Compounds to Citrus Plants Using a Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion (DPI) Device

To apply compounds to the plants using the Novel 3D-Printed Direct Plant Infusion, or DPI device, ensure the device is properly fitted to the plants. When assembled properly, the plastisol ring should be flush against the DPI device and the spout should line up with the hole drilled in the tree. Use a syringe or pipette to fill the DPI device with the compound solution of interest.Using a syringe, penetrate the silicone tape and plastisol ring opposite to the DPI device to extract air from the interior channel. Replace any extracted compound back into the DPI device. Add an additional small patch of silicone tape over the hole created by the syringe to reinforce the area and prevent tears.Inspect the apparatus for visible leakages at the attachment point and inspect the device reservoir for a stable liquid level. Cover the open end of the DPI device with a wax sealing film and pull it down to form a seal to reduce the evaporation of the experimental compound. Poke a single a hole in the wax film with a syringe tip to prevent the development of a vacuum, and subsequently refill the device.Check the apparatus daily to ensure proper alignment of the components, and top off the liquid using a syringe to avoid the reservoir running dry til the desired amount is delivered. When two milliliters of two millimolar CFDA dye was introduced to the plant using the DPI device, a fluorescent signal was detected in the vasculature of the treated plant, but was absent in the controlled plant treated with 20%DMSO in water. This signal was observed within 24 hours of treatment, evenly throughout the dissected plant tissue types.Treatment of streptomycin on Candidatus Liberibacter Asiaticus or CLass positive plants showed a reduction in the mean bacterial titer to 28 days after treatment compared to the control. The treated plants showed a lower mean CLas titer over all combined time points. The streptomycin treated plants as compared to the controls showed an occasional increase in new healthy flush growth after 60 days.Imidacloprid treatment on plants significantly reduced nymph emergence at the highest Imidacloprid concentration compared to the corresponding egg count. This was visually apparent in the reduction in nymph honeydew production.