Esta investigação foi financiada por fundos nacionais e europeus através da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) e POCI-01-0145-FEDER-007440. Os autores agradecem o apoio do iLAB - Laboratório de Microscopia e Bioimagem, unidade da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra e membro da infraestrutura nacional PPBI-Plataforma Portuguesa de BioImagem (POCI-01-0145-FEDER-022122), bem como o apoio do FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Todos os procedimentos em animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Instituto Coimbra de Investigação Clínica e Biomédica (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, #9/2018) e cumpriram as diretivas nacionais e europeias de cuidados com animais e as diretrizes ARRIVE.
1. Delineamento experimental
<ol><li>Ratos Wistar machos de 13 semanas de idade em gaiolas ventiladas sob condições ambientais controladas de temperatura (22 °C ± 1 °C), umidade (50%-60%) e luz (ciclo claro-escuro de 12 h) e com acesso ad libitum à água da torneira e ração padrão para roedores.</li>
	<li>Após um período de 2 semanas de aclimatação, arbitrariamente atribuir os ratos em dois grupos.</li>
	<li>Alimentar os grupos controle (CTRL, n = 6) e dieta hiperlipídica (DH, n = 6) com ração padrão e dieta hiperlipídica (45% kcal/gordura), respectivamente, por 24 semanas.</li>
	<li>Monitorar o peso corporal (PC) semanalmente. Registre o consumo diário de alimentos e bebidas por gaiola.</li>
</ol>2. Preparação da amostra de fígado
<ol><li>Dissecção hepática<ol><li>Prepare a bomba peristáltica: Passe etanol 70% através da tubulação, conecte uma agulha de 27 G à extremidade de saída da tubulação e prepare a tubulação com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH ~7,4) gelada (4 °C) (por exemplo, 200 rpm em uma bomba peristáltica com tubulação de silício de 1,6 mm I.D., mini conjunto de gotejamento IV). Ajuste para o peso corporal (por exemplo, para um rato de 100-150 g, use uma taxa de fluxo de aproximadamente 10-12 mL/min).</li>
		<li>Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal utilizando um protocolo de anestesia (concentração final de cetamina = 75 mg/kg e concentração final de medetomidina = 1 mg/kg). NOTA: Certifique-se de que o rato está completamente anestesiado usando o método de resposta de pinça do dedo do pé.</li>
		<li>Coloque o rato na bandeja de dissecção.</li>
		<li>Higienize bem o pelo com etanol 70% e seque-o com um papel toalha.</li>
		<li>Usando tesoura, faça uma incisão em forma de "U" através da pele e abra abaixo do diafragma. Em seguida, corte a caixa torácica rostralmente nas bordas para expor o coração.</li>
		<li>Enquanto o PBS 1x estiver funcionando, passe a agulha através do ventrículo esquerdo para a aorta ascendente e pinça. Em seguida, o átrio direito é cortado para permitir a drenagem após o início da perfusão. NOTA: O fígado deve começar a branquear à medida que o sangue é substituído por PBS.</li>
		<li>Usando tesoura e pinça Dumont, retire o fígado com cuidado e enxágue com 1x PBS.</li>
		<li>Transfira o fígado para uma placa de Petri e pese-o.</li>
		<li>Com bisturi, coletar amostras de tecido hepático de 5 mm de espessura da face lateral (1 cm da borda) do lobo esquerdo do fígado para o processo de incorporação. NOTA O tecido restante pode ser armazenado a -80 °C para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incorporação de tecido hepático<ol><li>Prepare um recipiente de gelo seco e rotule adequadamente os criomoldes com o ID e a orientação da amostra.</li>
		<li>Coloque algumas gotas de matriz de incorporação de crio no centro do criomold para obter a temperatura de corte ideal (OCT).</li>
		<li>Certifique-se de que a amostra de tecido está devidamente orientada para uma secção transversal. NOTA: Certifique-se de que o lado que toca a parte inferior do criomold é o lado que será seccionado primeiro.</li>
		<li>Solte cuidadosamente mais OCT no criomold até que ele esteja completamente coberto. Tente evitar a formação de bolhas de ar. Se necessário, com pinças lisas, remova quaisquer bolhas dentro do OCT.</li>
		<li>Coloque rapidamente o criomold com a amostra coberta pelo OCT em um recipiente de gelo seco. NOTA: Os tecidos podem ser armazenados a -80 °C durante 3 anos.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Secção de tecidos congelados
<ol><li>Ajuste a temperatura do criostato (câmara: -21 °C; amostra: -18 °C) e insira uma nova lâmina estéril.</li>
	<li>Colocar as amostras no criostato durante 30 minutos antes de deixar a temperatura equilibrar-se.</li>
	<li>Faça uma única camada de OCT no disco da amostra para permitir a adesão da amostra. Deixe a OCT congelar e monte a amostra de tecido na orientação desejada. NOTA: A superfície de corte deve ser paralela à lâmina. Para manter uma boa aderência, coloque o extrator de calor na parte superior da amostra. As etapas anteriores também podem ser realizadas em um recipiente de gelo seco com gelo seco.</li>
	<li>Coloque a amostra na cabeça da amostra e corte a superfície do tecido (algumas seções de amostra de tecido de 30 μm).</li>
	<li>Uma vez que a região de interesse esteja acessível para seccionamento, corte cortes de 12 μm de espessura e coloque-os em lâminas de microscópio marcadas mantidas à temperatura ambiente (TR). NOTA: Para coletar a seção, mova lentamente a lâmina em direção à seção de tecido. Cada lâmina pode coletar duas seções de fígado.</li>
	<li>Deixe as lâminas secarem por 10 min no RT. NOTA: As lâminas podem ser armazenadas a -20 °C por 6-12 meses ou a -80 °C por até 3 anos.</li>
</ol>4. Coloração BODIPY
<ol><li>Descongele as lâminas em um sistema de coloração de lâminas em RT por 30 min.</li>
	<li>Lave com 1x PBS (3x por 5 min cada).</li>
	<li>Circule a seção com uma camada hidrofóbica usando uma caneta de barreira.</li>
	<li>Preparar 500 μg/mL de solução-mãe de BODIPY 493/503: Dissolver 1 mg de BODIPY 493/503 em 2 mL de solvente (DMSO 90%; 10% 1x PBS). Proteger da luz. Sonicate em banho ultra-sônico por 1 h (9,5-10 W) a 37 °C. NOTA: A solução pode ser armazenada a -20 °C durante, pelo menos, 30 dias.</li>
	<li>Preparar a solução corante BODIPY (1 μg/mL) adicionando 2 μL de solução-mãe BODIPY 493/503 e 0,1 μL de solução-mãe DAPI (5 mg/mL) a 997,9 μL de 1x PBS.</li>
	<li>Incubar as lâminas (75 μL/lâmina) com BODIPY 493/503 (1 μg/mL) e DAPI (0,1 μg/mL) em TR por 40 min. NOTA: Mantenha os slides no escuro a partir desta etapa.</li>
	<li>Lave as lâminas com 1x PBS (3x por 5 min cada).</li>
	<li>Monte as lâminas com lamínulas usando um meio de montagem por fluorescência, deixe-as secar por 30 min e sela-as com esmalte. NOTA: As lâminas podem ser armazenadas a 4 °C até a obtenção de imagens.</li>
</ol>5. Quantificação de lipídios
<ol><li>Medir os níveis séricos de colesterol total e TG usando um método e equipamento automáticos e validados.</li>
	<li>Medir os níveis hepáticos de TG usando um kit de ensaio colorimétrico de triglicerídeos (Tabela de Materiais) de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
</ol>6. Aquisição de imagens
<ol><li>Coloque a lâmina no suporte da lâmina do microscópio confocal de varredura a laser.</li>
	<li>Para visualização e aquisição das imagens, utilizar microscópio confocal com objetiva de 20x (plano-apocromático: 20x/0,8).</li>
	<li>Para evitar cross-talk entre o BODIPY 493/503 e o DAPI, use o modo de varredura sequencial (melhor sinal) no software confocal.</li>
	<li>Excite o BODIPY 593/503 usando a linha de laser de argônio de 488 nm e o DAPI usando a linha de laser de 405 nm. Defina as faixas de emissão em 493-589 nm para BODIPY 493/503 e em 410-464 nm para DAPI.</li>
	<li>Use as seguintes configurações: pinhole: 1 UA, resolução: 1.024 pixels x 1.024 pixels, profundidade de bits: 12, tamanho do pixel: 0,415 μm, modo bidirecional, velocidade de digitalização: 7 (~1,58 μs/pixel para uma objetiva de 20x), média de linha: 2x e zoom digital: 1. NOTA: Os parâmetros de varredura acima mencionados devem ser otimizados para cada microscópio confocal e objetivo usado.</li>
	<li>Defina o ganho e o ganho digital adequadamente para que nenhum pixel saturado seja detectado no indicador de intervalo. Observação : corrija o sinal de fundo ajustando o deslocamento.</li>
	<li>Uma vez que os LDs estejam corretamente identificados, adquira a imagem com os canais BODIPY e DAPI. NOTA: Todas as fotos devem ser adquiridas nas mesmas condições (exposição e configurações gerais) para cada canal de cor.</li>
	<li>Para criar imagens de área ampla (Figura 2), altere a objetiva para a10x (plan-neofluar: 10x/0,3).</li>
	<li>Selecione o modo Tile Scan e crie mosaicos de 5 por 5 imagens. NOTA: Neste trabalho, cada bloco teve uma sobreposição de 10%, a fim de mesclar adequadamente os blocos para análise.</li>
	<li>Para criar vistas 3D e ortogonais (Figura 3A), coloque uma gota de óleo de imersão na parte superior do vidro da tampa e mude a objetiva para uma objetiva de 40x (plan-neofluar: óleo de 40x/1,30).</li>
	<li>Selecione o modo Z-Stack e, ajustando o plano Z, defina a primeira e a última posições para aquisição com um corte óptico em uma espessura ideal (~0,5 μm) para garantir que todas as gotículas sejam capturadas. NOTA: Para acelerar a aquisição da imagem e evitar o clareamento, o corte óptico pode ser ajustado para um tamanho abaixo do ideal, garantindo pelo menos 30% de sobreamostragem para uma boa reconstrução 3D.</li>
	<li>Selecione o módulo Ortho e crie exibições ortogonais.</li>
	<li>Adquira imagens 3D selecionando o módulo 3D seguindo o Modo de Renderização de Transparência com o software de microscópio confocal.</li>
</ol>7. Análise das imagens
<ol><li>Processar e analisar as imagens de plano único (aumento de 20x) com o CellProfiler (versão 4.2.5). NOTA: O pipeline utilizado neste trabalho foi adaptado de Adomshick et al.45.</li>
	<li>Clique no módulo Imagens no canto superior esquerdo da janela do CellProfiler e carregue as imagens como arquivos .tiff.</li>
	<li>Use o módulo NamesAndTypes para classificar entre imagens coradas BODIPY- (gota) e DAPI- (núcleos) com base nos nomes dos arquivos. Realizar a análise de DL apenas com imagens coradas com BODIPY.</li>
	<li>Para iniciar a construção do pipeline, clique em Ajustar módulos e selecione o módulo ColorToGray para converter as imagens em tons de cinza. Observação : para identificar objetos, imagens em tons de cinza são necessárias.</li>
	<li>Identifique gotículas empregando o módulo IdentifyPrimaryObjects usando a imagem em tons de cinza. NOTA: Os parâmetros neste módulo devem ser ajustados para realizar uma boa identificação LD. Neste trabalho, a definição de LDs com tamanho entre 6 pixels e 300 pixels e fator de correção de limiar de 1,0 levou à identificação mais precisa.</li>
	<li>Para medir a intensidade de pixel das gotículas lipídicas identificadas, adicione um módulo MeasureObjectIntensity .</li>
	<li>Adicione um módulo FilterObjects adicional para garantir que apenas os sinais mais fortes sejam quantificados, enquanto os sinais menos intensos são excluídos da análise final de gotículas lipídicas (intensidade mínima: 0,15; intensidade máxima: 1 unidade arbitrária).</li>
	<li>Para medir os LDs relacionados aos dados de saída, adicione o módulo MeasureObjectSizeShape .</li>
	<li>Adicione um módulo OverlayOutlines neste ponto para sobrepor a gota identificada na imagem original e, assim, garantir que a segmentação pareça precisa na imagem não processada também. NOTA: Esta é uma etapa opcional (controle de qualidade).</li>
	<li>Adicione um módulo ExportToSpreadsheet no final e clique no botão Analisar imagens no canto inferior esquerdo.</li>
</ol>8. Análise estatística
<ol><li>Expresse os resultados como média ± erro padrão da média (S.E.M.) usando qualquer software de análise estatística. OBS: Neste estudo, o software GraphPad foi utilizado para análise estatística.</li>
	<li>Analisar a distribuição dos valores utilizando o teste de Kolmogorov-Smirnov para avaliar desvios significativos da normalidade. Analise os dados paramétricos usando o teste t de Student não pareado. LEGENDA: Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.</li>
</ol>

Avaliação da esteatose hepática com reconstrução de gotículas lipídicas de fluorescência 3D

Os autores não têm nada a revelar.

Este protocolo baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para avaliação de DL teve como objetivo desenvolver uma nova abordagem de imagem para a avaliação da esteatose hepática. Dada a forte correlação entre obesidade e doença hepática gordurosa, a dieta hiperlipídica de estilo ocidental foi utilizada para estabelecer um modelo animal de esteatose hepática26. Um aumento robusto no conteúdo hepático de TG foi confirmado por um kit de ensaio colorimétrico quantitativo de triglicerídeos...

As gotículas lipídicas (DLs), classicamente vistas como depósitos de energia, são organelas celulares especializadas que medeiam o armazenamento lipídico e compreendem um núcleo lipídico neutro hidrofóbico, que contém principalmente ésteres de colesterol e triglicérides (TGs), encapsulados por uma monocamada fosfolipídica 1,2,3.
A biogênese da DL ocorre no retículo endoplasmático (RE), iniciando-se com a síntese de triacilgliceróis (TAG) e ésteres esteróis. Os lipídios neutros são difundidos entre os folíolos da bicamada de RE em baixas concentrações, mas coalescem em lentes de óleo que crescem e brotam em gotículas quase esféricas da membrana de RE quando sua concentração intracelular aumenta4. Posteriormente, proteínas da bicamada de RE e do citosol, particularmente da família de proteínas perilipina (PLIN), translocam-se para as superfícies dos DLs para facilitar o brotamento 5,6,7,8,9.
Através de nova síntese de ácidos graxos e fusão ou coalescência de LD, LDs crescem em diferentes tamanhos. Assim, o tamanho e o número de LDs diferem consideravelmente entre os diferentes tipos de células. Pequenas gotículas (300-800 nm de diâmetro), conhecidas como DLs iniciais (iLDs), podem ser formadas por quase todas as células4. Mais tarde na formação de LD, a maioria das células é capaz de converter algumas iLDs em LDs maiores de expansão (eLDs >1 μm de diâmetro). No entanto, apenas tipos celulares específicos, como adipócitos e hepatócitos, têm a capacidade de formar LDs gigantes ou superdimensionadas (até dezenas de mícrons de diâmetro)4,10.
Os DLs desempenham um papel muito importante na regulação do metabolismo lipídico celular, suprimindo a lipotoxicidade e prevenindo o estresse de RE, a disfunção mitocondrial e, finalmente, a morte celular causada pelos ácidos graxos livres (AGs)11,12,13,14. Além disso, as DLs também têm sido implicadas na regulação da expressão gênica, no sequestro de proteínas de replicação viral, no tráfego e sinalização de membranas15,16,17. Portanto, a desregulação da biogênese da DL é uma característica das doenças crônicas associadas à síndrome metabólica, obesidade, diabetes mellitus tipo 2 (DM2) e/ou arteriosclerose, para citar apenas algumas18,19,20.
O fígado, como polo metabólico, é o principal responsável pelo metabolismo lipídico, armazenando e processando lipídios, sendo, portanto, constantemente ameaçado pela lipotoxicidade21. A esteatose hepática (EH) é uma característica comum a uma série de doenças hepáticas progressivas e é caracterizada pelo acúmulo excessivo de lipídios intracelulares na forma de LDs citosólicos que, em última instância, podem levar à disfunção metabólica hepática, inflamação e formas avançadas de doença hepática gordurosa não alcoólica22,23,24,25. A SH ocorre quando a taxa de oxidação de ácidos graxos e exportação como triglicerídeos dentro de lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDLs) é menor do que a taxa de captação de ácidos graxos hepáticos do plasma e síntese de novos ácidos graxos26. O acúmulo hepático de lipídios frequentemente ocorre em duas formas - esteatose microvesicular e macrovesicular - e estas apresentam características citoarquitetônicasdistintas27. Tipicamente, a esteatose microvesicular é caracterizada pela presença de pequenos DLs dispersos por todo o hepatócito com o núcleo posicionado centralmente, enquanto a esteatose macrovesicular é caracterizada pela presença de um único grande DL que ocupa a maior parte do hepatócito, empurrando o núcleo para a periferia28,29. Notavelmente, esses dois tipos de esteatose são frequentemente encontrados juntos, e ainda não está claro como esses dois padrões de DL influenciam a patogênese da doença, pois as evidências ainda são inconsistentes31,32,33,34. No entanto, esse tipo de análise é frequentemente empregado como "padrão de referência" em estudos pré-clínicos e clínicos para entender o comportamento dinâmico dos DLs e caracterizar a esteatose hepática29,34,35,36.
As biópsias hepáticas, padrão-ouro para o diagnóstico e classificação da EH, são rotineiramente avaliadas pela análise histológica de hematoxilina e eosina (H&E), onde gotículas lipídicas são avaliadas como vacúolos não corados em cortes hepáticos corados por H&E37. Embora aceitável para avaliação da esteatose macrovesicular, esse tipo de coloração geralmente estreita a avaliação da esteatose microvesicular38. Corantes diazo lipossolúveis, como o Oil Red O (ORO), são classicamente combinados com microscopia de campo claro para analisar os estoques lipídicos intracelulares, mas estes ainda apresentam uma série de desvantagens: (i) o uso de etanol ou isopropanol no processo de coloração, o que muitas vezes causa a ruptura dos LDs nativos e fusão ocasional apesar das células estarem fixas39; (ii) a natureza demorada, uma vez que a solução de ORO requer dissolução e filtragem de pó fresco devido ao prazo de validade limitado, contribuindo assim para resultados menos consistentes; (iii) e o fato de que a ORO cora mais do que apenas gotículas lipídicas e muitas vezes superestima a esteatose hepática38.
Consequentemente, fluoróforos lipofílicos permeáveis a células, como o Nile Red, têm sido usados em amostras vivas ou fixas para superar algumas das limitações mencionadas. No entanto, a natureza inespecífica da marcação de organelas lipídicas celulares restringe repetidamente as avaliações de DL40. Além disso, as propriedades espectrais do Vermelho do Nilo variam de acordo com a polaridade do ambiente, o que muitas vezes pode levar a deslocamentos espectrais41.
A sonda fluorescente lipofílica 1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceno (comprimento de onda de excitação: 480 nm; emissão máxima: 515 nm; BODIPY 493/503) apresenta características de hidrofobicidade que permitem sua rápida captação pelos LDs intracelulares, acumula-se no núcleo lipídico das gotículas e, posteriormente, emite fluorescência verde brilhante12. Ao contrário do Nile Red, o BODIPY 493/503 é insensível à polaridade do ambiente e tem se mostrado mais seletivo, pois exibe alto brilho para imagens LD. Para corar LDs neutros, esse corante pode ser usado em células vivas ou fixas e acoplado com sucesso a outros métodos de coloração e/ou marcação42. Outra vantagem do corante é que ele requer pouco esforço para ser colocado em uma solução e é estável, eliminando a necessidade de prepará-lo na hora para cada experimento42. Embora a sonda BODIPY 493/503 tenha sido empregada com sucesso para visualizar a localização e dinâmica de DLs em culturas celulares, alguns relatos também demonstraram o uso confiável desse corante como ferramenta de imagem de DL em tecidos, incluindo o músculo vasto lateral humano43, o músculo sóleo de rato 42 e o intestino de camundongo44.
Neste trabalho, propomos um protocolo otimizado baseado em BODIPY 493/503 como uma abordagem analítica alternativa para a avaliação do número, área e diâmetro de DL em espécimes hepáticos de um modelo animal de esteatose hepática. Esse procedimento abrange o preparo de amostras de fígado, corte tecidual, condições de coloração, aquisição de imagens e análise de dados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.6 mm I.D. silicone tubing, I.V mini drip set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>10191455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Illustrator CC</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td>Used to design the figures</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic analyzer Hitachi 717</td>
			<td>Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Germany</td>
			<td>8177-30-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)</td>
			<td>Daido Sangyo Co., Ltd, Japon</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade</td>
			<td>Leica</td>
			<td>221052145</td>
			<td>Used in the cryostat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Profiler version 4.2.5</td>
			<td>https://cellprofiler.org/releases/</td>
			<td>Used to analyse the acquired images</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomolds</td>
			<td>Tissue-Tek</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat (including specimen disc and heat extractor) CM3050 S</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>_</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>D-8418</td>
			<td>Used to dissolve Bodipy for the 5 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic 
			and flammable. Vapors may cause 
			irritation. Manipulate in a fume 
			hood. Avoid direct contact with skin. 
			Wear rubber gloves, protective eye 
			goggles.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice container (styrofoam cooler)</td>
			<td>Novolab</td>
			<td>A26742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont forceps</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>11295-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Petri dish (H 25 mm, &#248; 
			150 mm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Used to weigh the liver after dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycergel</td>
			<td>DAKO Omnis</td>
			<td>S303023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software, version 9.3.1</td>
			<td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat diet</td>
			<td>Envigo, Barcelona, Spain</td>
			<td>MD.08811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine (Nimatek&#160; 100 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>791/01/14DFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 75 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope&#160; (QUASAR detection unit; )</td>
			<td>Carl Zeiss, germany</td>
			<td>LSM 710 Axio Observer Z1 microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>1838 ESP / 020/01/07RFVPT</td>
			<td>Used at a final concentration of 1 mg/kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD microlance</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No 15 Sterile carbon steel scalpel 
			Blade</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objectives 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) and 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil)</td>
			<td>&#160;Carl Zeiss, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brushes</td>
			<td>Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X</td>
			<td>&#160;Used to handle cryosections</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Minipuls 3)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>1004170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS, pH ~ 7.4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Lyon, France</td>
			<td>P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle, 125 mm (5&#34;), No. 3</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide staining system StainTray</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>M920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard diet</td>
			<td>&#160;Mucedola</td>
			<td>4RF21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus microscope slides</td>
			<td>Menzel-Glaser, Germany</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek OCT mounting media</td>
			<td>VWR CHEMICALS</td>
			<td>361603E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triglycerides colorimetric assay kit</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10010303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath</td>
			<td>Bandelin Sonorex</td>
			<td>&#160;TK 52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas spring scissors - 3 mm 
			cutting edge</td>
			<td>Fine Science Tools, Germany</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Black software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of fluorescent-stained lipid droplets with 3d reconstruction for hepatic steatosis assessment

As gotículas lipídicas (DLs) são organelas especializadas que medeiam o armazenamento lipídico e desempenham um papel muito importante na supressão da lipotoxicidade e na prevenção da disfunção causada pelos ácidos graxos livres (AGs). O fígado, dado seu papel crítico no metabolismo da gordura do corpo, é persistentemente ameaçado pelo acúmulo intracelular de DLs na forma de esteatose hepática microvesicular e macrovesicular. A caracterização histológica dos LDs é tipicamente baseada em corantes diazo lipossolúveis, como a coloração Oil Red O (ORO), mas uma série de desvantagens consistentemente dificulta o uso dessa análise com espécimes hepáticos. Mais recentemente, os fluoróforos lipofílicos 493/503 tornaram-se populares para visualizar e localizar DLs devido à sua rápida captação e acúmulo no núcleo de gotículas lipídicas neutras. Embora a maioria das aplicações seja bem descrita em culturas celulares, há menos evidências demonstrando o uso confiável de sondas de fluoróforo lipofílico como uma ferramenta de imagem de DL em amostras de tecido. Neste trabalho, propomos um protocolo otimizado baseado em dipirrometeno de boro (BODIPY) 493/503 para a avaliação de DLs em espécimes hepáticos de um modelo animal de esteatose hepática induzida por dieta hiperlipídica (DHL). Este protocolo abrange preparo de amostras de fígado, secção tecidual, coloração BODIPY 493/503, aquisição de imagens e análise de dados. Demonstramos um aumento do número, intensidade, razão de área e diâmetro das DLs hepáticas após a alimentação com DH. Usando projeções ortogonais e reconstruções 3D, foi possível observar o conteúdo total de lipídios neutros no núcleo LD, que apareceu como gotículas quase esféricas. Além disso, com o fluoróforo BODIPY 493/503, conseguimos distinguir microvesículas (1 μm < d ≤ 3 μm), vesículas intermediárias (3 μm < d ≤ 9 μm) e macrovesículas (d > 9 μm), permitindo a discriminação bem sucedida da esteatose microvesicular e macrovesicular. Em geral, este protocolo baseado em fluorescência BODIPY 493/503 é uma ferramenta confiável e simples para a caracterização da DL hepática e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos.

Lipid droplets (LDs), classically viewed as energy depots, are specialized cellular organelles that mediate lipid storage, and they comprise a hydrophobic neutral lipid core, which mainly contains cholesterol esters and triglycerides (TGs), encapsulated by a phospholipid monolayer1,2,3.
LD biogenesis occurs in the endoplasmic reticulum (ER), starting with the synthesis of triacylglycerol (TAG) and sterol esters. Neutral lipids are diffused between the leaflets of the ER bilayer at low concentrations but coalesce into oil lenses that grow and bud into nearly spherical droplets from ER membrane when their intracellular concentration increases4. Subsequently, proteins from the ER bilayer and cytosol, particularly the perilipin (PLIN) protein family, translocate to the surfaces of the LDs to facilitate budding5,6,7,8,9.
Through new fatty acid synthesis and LD fusion or coalescence, LDs grow into different sizes. Accordingly, the size and number of LDs differ considerably across different cell types. Small droplets (300-800 nm diameter), which are known as initial LDs (iLDs), can be formed by nearly all cells4. Later in LD formation, most cells are able to convert some iLDs into larger ones-expanding LDs (eLDs &#62;1 &#181;m in diameter). Yet, just specific cell types, such as adipocytes and hepatocytes, have the capacity to form giant or supersized LDs (up to tens of microns in diameter)4,10.
LDs play a very important role in the regulation of cellular lipid metabolism, suppressing lipotoxicity, and preventing ER stress, mitochondrial dysfunction, and, ultimately, cell death caused by free fatty acids (FAs)11,12,13,14. Furthermore, LDs have also been implicated in the regulation of gene expression, viral replication protein sequestration, and membrane trafficking and signaling15,16,17. Therefore, the misregulation of LD biogenesis is a hallmark of chronic diseases associated with metabolic syndrome, obesity, type 2 diabetes mellitus (T2DM), and/or arteriosclerosis, to name just a few18,19,20.
The liver, as a metabolic hub, is mostly responsible for lipid metabolism by storing and processing lipids, and, therefore, it is constantly threatened by lipotoxicity21. Hepatic steatosis (HS) is a common feature of a series of progressive liver diseases and is characterized by excessive intracellular lipid accumulation in the form of cytosolic LDs that, ultimately, may lead to liver metabolic dysfunction, inflammation, and advanced forms of nonalcoholic fatty liver disease22,23,24,25. HS occurs when the rate of fatty acid oxidation and export as triglycerides within very low-density lipoproteins (VLDLs) is lower than the rate of hepatic fatty acid uptake from the plasma and de novo fatty acid synthesis26. The hepatic accumulation of lipids often occurs in two forms-microvesicular and macrovesicular steatosis-and these display distinct cytoarchitectonic characteristics27. Typically, microvesicular steatosis is characterized by the presence of small LDs dispersed throughout the hepatocyte with the nucleus placed centrally, whereas macrovesicular steatosis is characterized by the presence of a single large LD that occupies the greater part of the hepatocyte, pushing the nucleus to the periphery28,29. Notably, these two types of steatosis are often found together, and it remains unclear how these two LD patterns influence disease pathogenesis, as evidence is still inconsistent31,32,33,34. Yet, such type of analysis is often employed as a &#34;reference standard&#34; in preclinical and clinical studies to understand the dynamic behavior of LDs and characterize hepatic steatosis29,34,35,36.
Liver biopsies, the gold standard for diagnosing and grading HS, are routinely assessed by histological hematoxylin and eosin (H&#38;E) analysis, where lipid droplets are evaluated as unstained vacuoles in H&#38;E-stained liver sections37. While acceptable for macrovesicular steatosis evaluation, this type of staining generally narrows the assessment of microvesicular steatosis38. Lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO), are classically combined with brightfield microscopy to analyze intracellular lipid stores, but these still have a number of disadvantages: (i) the usage of ethanol or isopropanol in the staining process, which often causes the disruption of the native LDs and occasional fusion despite the cells being fixed39; (ii) the time-consuming nature, as ORO solution requires fresh powder dissolving and filtering due to the limited shelf life, thus contributing to less consistent results; (iii) and the fact that ORO stains more than just lipid droplets and often overestimates hepatic steatosis38.
Consequently, cell-permeable lipophilic fluorophores, such as Nile Red, have been used in either live or fixed samples to overcome some of the aforementioned limitations. However, the non-specific nature of cellular lipid organelle labeling repeatedly narrows LD assessments40. Moreover, the spectral properties of Nile Red vary according to the polarity of the environment, which can often lead to spectral shifts41.
The lipophilic fluorescent probe 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indacene (excitation wavelength: 480 nm; emission maximum: 515 nm; BODIPY 493/503) exhibits hydrophobicity characteristics that allow its rapid uptake by intracellular LDs, accumulates in the lipid droplet core, and, subsequently, emits bright green fluorescence12. Unlike Nile Red, BODIPY 493/503 is insensitive to the environment polarity and has been shown to be more selective, as it displays high brightness for LD imaging. In order to stain neutral LDs, this dye can be used in live or fixed cells and successfully coupled with other staining and/or labeling methods42. Another advantage of the dye is that it requires little effort to place into a solution and is stable, thus eliminating the need to freshly prepare it for each experiment42. Even though the BODIPY 493/503 probe has been successfully employed to visualize the localization and dynamics of LDs in cell cultures, some reports have also demonstrated the reliable use of this dye as an LD imaging tool in tissues including the human vastus lateralis muscle43, the rat soleus muscle42, and the mouse intestine44.
Herein, we propose an optimized BODIPY 493/503-based protocol as an alternative analytical approach for the evaluation of the LD number, area, and diameter in liver specimens from an animal model of hepatic steatosis. This procedure covers liver sample preparation, tissue sectioning, staining conditions, image acquisition, and data analysis.

Autor em destaque: Análise de gotículas lipídicas coradas com fluorescência com reconstrução 3D para avaliação da esteatose hepática  

Análise de Gotículas Lipídicas Coradas por Fluorescência com Reconstrução 3D para Avaliação da Esteatose Hepática

This imaging approach allows the three-dimensional reconstruction of hepatic lipid droplet deposition and overcomes the main disadvantages of classic histological staining that narrowed the successful discrimination between micro and macrovesicular steatosis. The assessment of microvesicular steatosis is when gold-standard histological stainings are used, both and Oil Red, due to disruption and occasional fusion of native lipid droplets. The pro-BODIPY offers an alternative to the routine protocols for microvesicular hepatic steatosis assessment due to its right hydrophobicity for a fast uptake and effective tagging of lipid droplets, being not only insensitive to the environment polarity, but also extremely selective.This imaging approach encloses broader applications in combination with immunochemistry techniques, allowing the simultaneous detection of other subcellular antigens that may advance the study of lipid droplets'biogenesis and dynamics, underpinning micro and macrovesicular hepatic steatosis.

A execução bem-sucedida desta técnica deve resultar em coloração clara de gotículas lipídicas para a caracterização simultânea da morfologia da DL (forma e densidade do núcleo lipídico com base na reconstrução 3D), juntamente com sua distribuição espacial, número por área total e tamanho médio (avaliado com a tubulação acima descrita, Figura 1).
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Neste artigo, demonstramos um protocolo otimizado baseado em fluorescência BODIPY 493/503 para caracterização de gotículas lipídicas em tecido hepático. Através do uso de projeções ortogonais e reconstruções 3D, o fluoróforo permite o sucesso da discriminação entre esteatose microvesicular e macrovesicular e pode representar uma abordagem complementar aos protocolos histológicos clássicos para avaliação da esteatose hepática.

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Esta abordagem de imagem permite a reconstrução tridimensional da deposição de gotículas lipídicas hepáticas e supera as principais desvantagens da coloração histológica clássica que estreitou a discriminação bem-sucedida entre esteatose micro e macrovesicular. A avaliação da esteatose microvesicular é quando são utilizadas colorações histológicas padrão-ouro, tanto quanto em vermelho oleoso, devido à ruptura e eventual fusão de gotículas lipídicas nativas. O pró-BODIPY oferece uma alternativa aos protocolos de rotina para avaliação da esteatose hepática microvesicular devido à sua hidrofobicidade direita para uma rápida captação e marcação efetiva de gotículas lipídicas, sendo não só insensível à polaridade do ambiente, mas também extremamente seletivo.Esta abordagem de imagem abrange aplicações mais amplas em combinação com técnicas de imunoquímica, permitindo a detecção simultânea de outros antígenos subcelulares que podem avançar o estudo da biogênese e dinâmica de gotículas lipídicas, sustentando a esteatose hepática micro e macrovesicular.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

3.0K visualizações.  University of Coimbra. Esta abordagem de imagem permite a reconstrução tridimensional da deposição de gotículas lipídicas hepáticas e supera as principais desvantagens da coloração histológica clássica que estreitou a discriminação bem-sucedida entre esteatose micro e macrovesicular. A avaliação da esteatose microvesicular é quando são utilizadas colorações histológicas padrão-ouro, tanto quanto em vermelho oleoso, devido à ruptura e eventual fusão de gotículas lipídicas nativas. O pró-BOD...

Vídeo: Autor em destaque: Análise de gotículas lipídicas coradas com fluorescência com reconstrução 3D para avaliação da esteatose hepática  

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Bioquímica

Frozen Liver Tissue Sectioning and BODIPY Staining of Lipid Droplets

Turn on the cryostat and cut 12-micron-thick sections of the frozen liver tissue collected from a rat. Place the sections onto the labeled microscope slides at room temperature. For BODIPY staining, wash the tissue sections thrice with PBS for five minutes each.After the last wash, circle the sections on the slide with a hydrophobic layer using a barrier pen. Prepare a staining solution containing BODIPY 493/503 and DAPI. Then, pipette 75 microliters of the solution onto each slide.Incubate the slides at room temperature for 40 minutes in the dark. Following incubation, wash the slides thrice with PBS for five minutes each. Then, using a fluorescence mounting medium, carefully mount cover slips on each slide.Allow the slides to dry for 30 minutes before sealing the edges with nail polish.

Corte de tecido hepático congelado e coloração BODIPY de gotículas lipídicas

Image Acquisition of Lipid Droplets and Analysis

Turn on the laser scanning confocal microscope and place the slide on the slide holder. For image visualization and acquisition, select the 20X objective lens. From the confocal software, select sequential scan mode to avoid crosstalk between the BODIPY 493/503 and DAPI.Then excite the BODIPY 493/503 die using the 488 nanometer argon laser line and the DAPI stain using the 405 nanometer laser line. Set the emission ranges at 493 to 589 nanometers for BODIPY and 410 to 464 nanometers for DAPI. Next, configure the microscope settings by adjusting frame sizes, scan speed, and averaging which includes number two times bit depth as 12 bits, direction as bidirectional, scan area digital zoom minus one, and pinhole minus one area unit.Adjust the gain and digital gain settings. Ensure there are no saturated pixels as indicated by the range indicator. After accurately identifying the lipid droplets, acquire the image with the BODIPY and DAPI channels.To create wide area images, switch to a 10X subjective lens. Then activate tile scan mode and configure it to generate five by five mosaic images. To generate 3D and orthogonal views, apply a drop of immersion oil on the top of the cover glass and change the objective lens to a 40X lens.Select the Z-stack mode. Adjust the Z-plane to define the first and last positions for image capture, ensuring an optical slice thickness of approximately 0.5 microns to capture all droplets in focus. Select the ortho module and create orthogonal views.Acquire 3D images by selecting the 3D module following transparency rendering mode. After image acquisition, begin processing and analyzing single plane images using CellProfiler. Upload the images in TIF format by clicking on the images mode in the top left corner of the CellProfiler interface.Use the names and types module to sort between BODIPY droplet and DAPI nuclei stained images based on the filenames. For lipid droplet analysis, use only BODIPY stained images. Initiate pipeline construction by clicking on adjust modules and select the color to gray module to convert the images into gray scale.Then using identify primary objects module, define lipid droplets between 6 to 300 pixels and a threshold correction factor of one to detect lipid droplets within the gray scale images. To measure the pixel intensity of the identified lipid droplets, add a measure object intensity module. Incorporate an additional filter objects module to ensure that only the strongest signals are quantified while less intense signals are excluded from the final lipid droplet analysis.Next, to measure the lipid droplets related to the output data, add the measure object size shape module. Then add an overlay outlines module to overlay the identified droplet on the original image and thus ensure that the segmentation looks accurate on the unprocessed image as well. Once done, add an export to spreadsheet module and click on the analyze images button from the bottom left corner.Compared to the control, HFD-fed animals presented a pronounced dyslipidemic profile and subtle increase in circulating triglycerides levels. Wide area images revealed increased lipid droplets across the livers of HFD-fed animals. Analysis with CellProfiler revealed an increased number of hepatic lipid droplets, augmented BODIPY fluorescence intensity, 360%area ratio, and larger diameters.Size distribution in HFD-fed animals revealed an increase in macro vesicular hepatic lipid droplets of more than nine microns and a reduction in microvesicles of less than three microns.