Bu çalışma kısmen, P20GM103430 hibe numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden Rhode Island Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) Biyomedikal Araştırma Mükemmellik Ağı ve Bryant Sağlık ve Davranış Bilimleri Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Lisans Araştırma ve Öğretimi için Kromozom Konformasyon Yakalama (3C)

<ol>
	<li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+architectural+proteins.">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li><li>Nalabothula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+architectural+proteins+HMGD1+and+H1+bind+reciprocally+and+have+opposite+effects+on+chromatin+structure+and+gene+regulation.">The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation.</a> BMC Genomics. 15, 92 (2014).</li><li>John, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+pre-determines+glucocorticoid+receptor+binding+patterns.">Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns.</a> Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).</li><li>Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+occurrence+of+a+fibrous+lamina+on+the+inner+aspect+of+the+nuclear+envelope+in+certain+cells+of+vertebrates.">On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates.</a> The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).</li><li>Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+repression+mediated+by+repositioning+of+genes+to+the+nuclear+lamina.">Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina.</a> Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).</li><li>Finlan, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+to+the+nuclear+periphery+can+alter+expression+of+genes+in+human+cells.">Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells.</a> PLoS Genetics. 4 (3), e1000039 (2008).</li><li>Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+re-organisation+of+the+Hoxb+complex+during+mouse+embryonic+development.">Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.</a> Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).</li><li>Chambeyron, S., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+and+nuclear+reorganization+of+the+HoxB+locus+upon+induction+of+transcription.">Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.</a> Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).</li><li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+active+and+inactive+genes+and+noncoding+DNA+within+chromosome+territories.">Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).</li><li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH.">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li><li>Li, B., Carey, M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+chromatin+during+transcription.">The role of chromatin during transcription.</a> Cell. 128 (4), 707-719 (2007).</li><li>Chen, A., Chen, D., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+DNase-seq+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+in+animals.">Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals.</a> Gene. 667, 83-94 (2018).</li><li>Hughes, A. L., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+nucleosome+positioning+in+vivo.">Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).</li><li>Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+nucleosome+mapping+reveals+transcription-dependent+promoter+packaging.">High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging.</a> Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).</li><li>Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+evolutionary+approach+to+identify+determinants+of+nucleosome+positioning:+A+unifying+model+for+establishing+the+genome-wide+pattern.">A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern.</a> Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).</li><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>van Berkum, N. L., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+spatial+chromatin+organization+of+large+genomic+regions+using+5C+technology.">Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology.</a> Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).</li><li>Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+TAD+boundaries+constrain+cell-type-specific+looping+interactions+between+promoters+and+distal+elements+around+the+CFTR+locus.">Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus.</a> American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).</li><li>Crane, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+inputs+into+C.+elegans+dosage+compensation:+Chromosome+conformation+and+the+miRNA-specific+argonaute+ALG-2.">Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2.</a> University of California, Berkeley. , (2012).</li><li>Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+CTCF+is+required+for+the+enhancer+blocking+activity+of+vertebrate+insulators.">The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators.</a> Cell. 98 (3), 387-396 (1999).</li><li>Cuadrado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+contributions+of+cohesin-SA1+and+cohesin-SA2+to+TADs+and+polycomb+domains+in+embryonic+stem+cells.">Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells.</a> Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).</li><li>Sarro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+the+three-dimensional+regulatory+topology+of+the+Pitx1+locus+results+in+overtly+normal+development.">Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development.</a> Development. 145 (7), (2018).</li><li>Tolhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+polycomb+domains+are+guided+by+chromosome+architecture.">Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture.</a> PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).</li><li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+From+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Fern&#225;ndez-Mi&#241;&#225;n, A., Bessa, J., Tena, J. J., G&#243;mez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture,+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish.">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+&amp;#34;C&amp;#34;+s+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three &amp;#34;C&amp;#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li><li>Hag&#232;ge, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+(3C-qPCR).">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li><li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=My5C:+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies.">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li><li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression.">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

3C, temel moleküler tekniklere dayanan güçlü bir tekniktir. 3C'yi lisans öğrencileriyle kullanmak için bu kadar ilgi çekici bir teknik haline getiren temel araçların bu temelidir. Kromatin dinamiklerini bu kadar geniş bir ölçekte gözlemleyen pek çok yeni çalışma ile, bu sonuçları tek bir gen veya genomik bölge üzerinde dar odaklı bir deney tasarlamak için kullanmak, lisans araştırmalarında benzersiz ve etkili bir deney yaratma potansiyeline sahiptir. Çoğu zaman, bu gibi deneyler lisans öğrencileri için çok gelişmiş olarak kabul edilir, ancak dikkatli bir planlama ile kolayca elde edilebilirler. 3C kütüphanesi tarafından yakalanan kromatin bağlantılarını araştırmak için tasarlanan testlerin, yarı kantitatif son nokta PCR'den tüm genom dizilemesine kadar değişebileceğini belirtmek önemlidir. Aslında, ilk 3C makalesi16'dan elde edilen veriler qPCR'den üretildi. Bu geniş tahlil yelpazesinin hepsi kullanılabilir, çünkü tüm 3C teknolojileri aynı ürünü üretir - çekirdekteki 3D bağlantıları temsil eden DNA fragmanlarının bir kütüphanesi.
Burada sunulan, lisans araştırmacıları için daha uygun olan daha esnek ve uzlaşmacı bir protokolün uyarlanmasıdır. Yukarıda listelenen duraklama süreleri, gece boyunca gecikmeler anlamına gelir; Bununla birlikte, bu duraklamalar hafta sonları ve hücreler ve çekirdekler söz konusu olduğunda haftalarca uzayabilir. En önemli husus, işin ne zaman yapılacağıdır. Genellikle protokollerde, duraklatmanın bir seçenek olmadığı zaman zamana duyarlı adımlar vardır. Birkaç noktanın dışında (1. gün ve 2. gün), numuneyi durdurmak ve dondurmak için birçok yer vardır. Bunlar, laboratuvar çalışmalarının programlarının ve zamanlamalarının esnek olması gereken lisans öğrencileriyle çalışırken kritik öneme sahiptir. Bu durakların protokole dahil edilmesine ek olarak, lisans öğrencileri çiftler halinde veya hatta üç veya dört kişilik küçük gruplar halinde çalışmaya teşvik edilir. Gruplar bu protokol için iyi çalışır, çünkü öğrenciler birbirlerini destekleyebilir ve herkesin güvenli bir şekilde çalışması için bir arkadaş sistemi oluşturabilirler. Laboratuar çalışmaları da dahil olan diğer kişilerle daha eğlencelidir. Gruplarla, öğrenciler aynı protokolü uygularken kromatin organizasyonuna odaklanan çeşitli sorular üzerinde de çalışabilirler. Böylece, öğrenciler ayrı projeler üzerinde çalışırken bile, protokol çabalarını birbirine bağlar ve bu nedenle birbirlerini destekleyebilirler.
Diğer uyarlamalar, belirli özel araç ve gereçlerin tüm lisans kurumlarında mutlaka bulunmadığı gerçeğinin etrafında çalışmak içindir. Bu ekipman parçaları arasında qPCR termosikler, jel dokümantasyon sistemleri ve nano hacim spektrometreleri bulunur ancak bunlarla sınırlı değildir. Gerçekten de, bu ekipman parçaları uygundur, ancak bir gereklilik değildir. Burada, klasik 3C yöntemi astar tasarım bölümünde de açıklanmaktadır; Bu, ilgilenilen bir genomik lokusun tanımlanmasını ve bundan sonra, daha uzaktaki kromatin temas noktaları için diğer genomik lokusların değerlendirilmesini içerir. Bu teknik, bilinen pozitif (bağlanan) ve negatif (bağlanmayan) lokusların tanımlandığı Hi-C kullanan bir veri kümesi gibi yayımlanmış bir veri kümesi kullanıldığında da iyi çalışır. Bu yayınlanmış veri setlerini kullanarak deneyler tasarlamak, öğretim laboratuvarları için bir başka harika uyarlamadır, çünkü kromatin bağlantılarının başarılı bir şekilde tanımlanması için şans genellikle daha yüksektir. Ayrıca araştırma makalesi sınıfta tartışılabilir ve referans olarak kullanılabilir.
Bu protokol, 3C ürün oluşumunu görselleştirmek için değiştirilmiş bir qPCR yaklaşımı kullanır. Kontroller, 3C tekniğinin başarısı için çok önemlidir. Her deney, 3C prosedürünün tamamlandığını belirlemek için hem numune kontrollerini hem de astar kontrollerini kullanır. Numune kontrolleri sindirilmemiş bir kontrol (genomik DNA) ve sindirilmiş kontrolü içerir. Sindirilmemiş kontrol, astar setleri için taban çizgisi sinyalini belirler ve sindirim verimliliğini belirlemek için çapraz bağlı çürütme kontrolü ile birlikte kullanılır Bir kısıtlama bölgesine yönlendirilen herhangi bir astar için üründe bir düşüş olması beklenir. Bu değerin sindirilmemiş kontrolle karşılaştırılması, numunenin ne kadar iyi sindirildiğinin bir göstergesidir.
PCR için primerler bir kontrol astarı ve test primerleri içerir. Kontrol primeri, test edilen genomik bölgeye yakın olan ve bir kısıtlama bölgesi içermeyen bir primer setidir. Bu, test primer PCR ürünlerinin bolluğunu belirlemek için temel sağlar. Test primerleri, ilgilenilen belirli bir genomik lokus için bir kısıtlama bölgesini çevreleyen ileri ve geri primerlerdir (Şekil 3). Bu astar setlerini kullanan reaksiyonlar, sindirim verimliliğini belirlemek için karşılaştırılır, çünkü kısıtlama bölgesi kesilirse ürün bolluğu düşmelidir. Kromatin organizasyonunu belirlerken, bir lokustan bir test primeri, bu iki lokusun 3D uzayda birbirine yakın olup olmadığını belirlemek için farklı bir genomik lokustan başka bir test primeri ile eşleştirilir. Bu durumda, beklenti, bir PCR ürününün yalnızca şablon olarak 3C örneği kullanılarak bulunmasıdır.
Doğrulanmış astarların bile başarısız olma eğiliminde olduğuna dikkat etmek önemlidir (Şekil 4: r14 astar seti). Ek olarak, PCR ürünleri sıklıkla kontrol reaksiyonlarında ve kromatin bağlantısının tahmin edilmediği reaksiyonlarda (bağlanmadığı için sindirilmiş kontrol gibi) tanımlanır. Bu örnekler sıralanır ve Sanger QC'de başarısız olur veya tanımlanmış bir dizi olmadan geri döner (Şekil 5). Ek olarak, geleneksel 3C deneyleri, belirli miktarda DNA ile üretilebilecek tüm olası bağlı parçaları temsil eden, çapraz bağlanmamış, sindirilmiş ve bağlanmış bir DNA örneği olan bir "kontrol şablonu" oluşturur. "Kontrol şablonu", sinyalin gerçek bir etkileşimi mi yoksa sadece rastgele bir ilişkiyi mi temsil ettiğini belirlemek için iki genomik lokus arasındaki qPCR sinyallerinin yoğunluklarını karşılaştırmada önemli bir rol oynar. Bir "kontrol şablonu" oluşturmak sorunlu olabilir, çünkü test edilen kromatinin büyük bir kısmı yapay bir kromozom şeklinde yakalanmalı ve 3C örnekleri ile birlikte işlenmelidir. Böyle bir yapının güvence altına alınması mümkün olmayabilir ve bir tane oluşturmak bir dönem projesinin kapsamı dışında olabilir. Bu zorluklar nedeniyle, bir kontrol astarı kullanmanızı öneririz. Kontrol astarı, "kontrol şablonunun" tüm işlevlerinin yerini almaz, ancak yine de "mevcudiyet" veya "yokluk" belirlemeleri yapmak için verileri analiz etme fırsatı sunar.
qPCR yaparken, numunenin eşit miktarda kullanılması önemlidir. Bu, nanodamla gibi bir nano-spektrofotometre kullanılsa bile, bilinen bir konsantrasyonun genomik DNA'sından standart bir eğri oluşturarak ve 3C örneklerini bu çizgiye uydurarak belirlenmelidir. Bu miktarlar kaydedilmeli ve sonraki PCR'lerde kullanılmalıdır. PCR reaksiyonunun kalitesi de önemlidir. PCR qPCR'de çalıştığından, ürün bolluğu floresan kullanılarak ölçülür ve kaydedilir. Bu kayda amplifikasyon grafiğinden erişilebilir. Program bittiğinde, amplifikasyon grafiğini kontrol etmek ve reaksiyonların (şablon kontrolleri hariç) üç aşamaya sahip olduğundan emin olmak önemlidir: bir taban çizgisi, bir üstel ve bir plato / doygunluk aşaması. Reaksiyonların, özellikle eşiği ayarlamak için üstel bir faza sahip olup olmadığını kontrol etmek önemlidir (aşağıya bakınız). Ek olarak, seri olarak seyreltilmiş numuneler için, numunenin seyreltilmesi ile tutarlı Ct değerlerinde bir kayma olmalıdır (en yüksek konsantrasyon en düşük Ct değerlerine sahipken, en düşük konsantrasyon en yüksek Ct değerlerine sahip olacaktır). Amplifikasyon grafiğindeki bu değişikliği yansıtmayan numuneler yeni bir seyreltme gerektirir veya 3C numune oluşumu ile ilgili daha büyük bir soruna işaret eder. Son olarak, standart eğriyi oluştururken, PCR yazılımı PCR verimliliğini ve R2 değerini hesaplayacaktır. PCR etkinliği% 90'dan büyük olmalı ve R2 değeri 0.99'dan büyük olmalıdır. Bu koşullardan herhangi biri karşılanmazsa, numunede veya PCR primerlerinde bir sorun olması muhtemeldir.
qPCR sonrası, sindirim yüzdesi ve 3C etkileşimlerinin varlığı, her reaksiyon için qPCR Ct kullanılarak hesaplanabilir. Bunları belirlemek için öncelikle PCR reaksiyonunun eşiği belirlenmelidir. Bu normalde qPCR makinesiyle birlikte gelen yazılım kullanılarak yapılır. Eşiğin ayarlanması, numune Ct değerlerini karşılaştırmak için kullanılacak PCR ürününün konsantrasyonunu tanımlayacaktır. Eşik, amplifikasyonun üstel fazındaki PCR reaksiyonlarının amplifikasyon eğrilerini ikiye bölmelidir. Sadece üstel amplifikasyonlu PCR reaksiyonları karşılaştırılabilir (bu durumda, kontrol primerleri ve test primer reaksiyonları), çünkü reaksiyonların DNA'yı aynı oranda yükseltmesini sağlamanın tek yolu budur ve sadık bir şekilde karşılaştırılabilir. 3C grafiklerini analiz ederken, şartlı olarak pozitif reaksiyonlar, kontrol numuneleri, genomik kontrol ve sindirim kontrolü üzerinde daha fazla ürüne sahip olanlar olarak tanımlanır (Şekil 4B). Bununla birlikte, bu numuneler, PCR ürününün jel saflaştırılmasını takiben Sanger dizilimi kullanılarak daha da doğrulanmalıdır.
Sanger dizilemesinden sonra, QC'yi geçen örnekler Blat kullanılarak analiz edilebilir. Bu analizin amacı, numunenin kısıtlama bölgesini çevreleyen her iki hedef genomik lokusun dizisine sahip olup olmadığını belirlemektir (bu protokol durumunda DpnII). Her iki dizi de tanımlanırsa, 3C parçası doğrulanmış olarak kabul edilebilir. Blat'ın sonuçları beklenen sırayı döndürmezse, bu, primerlerden birinin veya her ikisinin de optimal olmadığını ve yanlış pozitif qPCR sonucuna neden olduğunu gösterebilir. Yanlış pozitif örnekler için izleme dosyaları tanımlanmamış temel tepe noktalarına sahip olacak ve Seq raporları çoğunlukla "n" temel çağrıları içerecektir.
Yapay PCR ürün oluşumundan kaynaklanan yanlış pozitifler mümkün olduğu için sanger doğrulaması esastır. Bu yanlış pozitifler, sıralama ürünleri beklenen hedef diziye veya uygun bir 3C parçasının DpnII bölgesi karakteristiğine sahip olmadığında tanımlanabilir (Şekil 5). PCR fragmanlarının dizilimi ayrıca deney için başka bir veri noktası sağlar ve öğrencilere 3C tekniğinin çekirdekler içindeki 3D uzayda bir araya gelen uzak genomik lokusları tanımladığını gösterir.
3C tekniği, lisans öğrencileri için esnek ve basit bir prosedürde zengin bir temel moleküler teknik sağlar. Bu 3C tekniği aynı zamanda yeni nesil dizilemeyi (NGS) içeren diğer 3C teknikleri için de bir başlangıç noktasıdır. Bu tür deneyler, lisans öğrencilerini biyoinformatiğin önemli yönlerine maruz bırakabilir ve burada özetlenen temel ilkelere dayanır. Lisans deneyimi ve katılımı, genç bilim adamları olarak başarılarının ve gelişimlerinin anahtarıdır. Bu fırsatları sağlayarak, lisans öğrencileri temel ilkeler hakkındaki anlayışlarını güçlendirirken, en yeni teknikler ve sorularla başa çıkmak için güvenlerini artırabilirler.

Bir organizmanın genomu sadece işlev için gerekli tüm genleri değil, aynı zamanda bunların nasıl ve ne zaman kullanılacağına dair tüm talimatları da içerir. Bu, genoma erişimi düzenlemeyi hücrenin en önemli işlevlerinden biri haline getirir. Gen fonksiyonunu kontrol etmek için birçok mekanizma vardır; Bununla birlikte, baz düzeyinde, gen regülasyonu, düzenleyici transkripsiyon faktörlerinin (trans-faktörler) spesifik DNA dizilerine (cis-düzenleyici diziler) bağlanma kabiliyetine bağlıdır. Bu doğuştan gelen bir yetenek değildir; bunun yerine, çekirdekteki genomun organizasyonu / yapısı tarafından yönetilir, bu da cis-düzenleyici dizilerin trans-faktörlere kullanılabilirliğini / maruziyetini kontrol eder 1,2,3. Trans-faktörler cis-düzenleyici dizilerini bulamazlarsa, trans-faktörler düzenleyici görevlerini yerine getiremezler. Bu, genomların çekirdekte nasıl organize edildiğini anlamayı önemli bir araştırma kaynağı haline getirmiştir.
İnterfaz sırasında, çekirdekteki ökaryotik kromozomların nükleer lamina ve nükleer matrise demirlenmiş kendi alanlarını işgal ettikleri yaygın olarak kabul edilmektedir (Şekil 1), böylece kromozomu bir spagetti tabağı üzerinde bir erişte yerine bir dilim pizza gibi yapar. Kromozomlar, kromozomun bölümlerini büken ve döngüleyen protein-DNA etkileşimleri (kromatin) ile kısmen yoğunlaştırılır. Elektron mikroskobu, üç boyutlu DNA floresansı in situ hibridizasyon (FISH) ve DNA etiketleme teknikleri (yani, floresan ve yapay DNA metilasyonu) yoluyla, kromatinin aktif olmayan alanlarının nükleer çevre 4,5,6 boyunca sıkıca paketlendiği bulunurken, aktif, daha az yoğunlaştırılmış kromatin kısımlarının çekirdeğin iç kısmında bulunduğubulunmuştur 7,8,9, 10. Bu deneyler, kromozom dinamiklerinin geniş açılı bir görünümünü sağlar, ancak DNaz 11,12 ve nükleozom 13,14,15 çalışmalarında gözlenen gen promotorları etrafında lokal olarak meydana gelen değişiklikleri yakalamak için çok az şey yapar.
Daha yüksek çözünürlüklü kromatin dinamiklerinin kilidini açmanın anahtarı, 3D kromozom haritalama tekniği olan 3C'nin formülasyonuydu. 3C tekniğinin kendisi dört ana adımdan oluşur: kromatinin çapraz bağlanması, kısıtlama enzimleri ile kromatin sindirimi, kromatin ligasyonu ve DNA saflaştırması (Şekil 2). Bu süreç tarafından üretilen yeni yapay DNA fragmanları daha sonra DNA16'nın doğrusal olarak uzak parçaları arasındaki yakın fiziksel ilişkiyi ortaya çıkarmak için karakterize edilebilir. 3C tekniği, daha geniş genom çapında sorular sormak için 3C'nin ilk adımlarını kullanan çoklu spin-off tekniklerinin oluşturulmasının temeli haline geldi (örneğin, Hi-C, 4C, ChIP-C). Bu 3C teknikleri ailesi, kromozomların topolojik olarak ilişkili alanlar (TAD'lar) olarak adlandırılan çoklu ayrı birimler halinde düzenlendiğini tespit etmiştir. TAD'lar genomda kodlanır ve ilmeksiz sınırlarla çevrili kromatin döngüleri ile tanımlanır16,17,18,19. TAD sınırları, CCCT bağlanma faktörü (CTCF) ve kohezyon dahil olmak üzere evrimsel olarak korunmuş ve her yerde bulunan iki faktör tarafından korunur ve bu da ayrı TAD'lar içindeki döngülerin16,20 ile etkileşime girmesini önler. Döngülere, trans-faktörlerin düzenleyici dizileri ile etkileşimi, CTCF ve kohezyon21 aracılık eder.
3C teknolojilerini kullanan birçok çalışma genom çapında geniş sorular sormasına ve karmaşık örnek toplama teknikleri kullanmasına rağmen, 3C tekniğinin formülasyonu temel moleküler biyoloji tekniklerine dayanmaktadır. Bu, 3C'yi hem lisans araştırma hem de öğretim laboratuvarlarında dağıtım için ilgi çekici hale getirir. 3C tekniği daha küçük odaklı sorular için kullanılabilir ve sorulan soruların odağına ve yönüne bağlı olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirmeye (tek genler22, kromozomlar16 ve / veya genomlar18) doğal olarak esnektir. Bu teknik aynı zamanda çok çeşitli model sistemlere 7,16,19,23 uygulanmış ve kullanımında çok yönlü olduğu kanıtlanmıştır. Bu, 3C'yi lisans öğrencileri için mükemmel bir teknik haline getirir, çünkü öğrenciler ortak moleküler biyoloji tekniklerinde deneyim kazanabilir ve aynı zamanda yönlendirilmiş soruları cevaplamada değerli deneyimler kazanabilirler.
Burada daha önce yayınlanmış 24,25,26,27 protokollerine dayanan 3C kütüphane hazırlığı için uyarlanmış bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol yaklaşık 1 × 107 hücre için optimize edilmiştir, ancak 1 × 105 hücreli 3C kütüphaneleri oluşturmuştur. Bu protokolün çok yönlü olduğu kanıtlanmıştır ve zebra balığı embriyolarından, zebra balığı hücre hatlarından ve genç-yetişkin (YA) Caenorhabditis elegans'tan (yuvarlak kurt) 3C kütüphaneleri oluşturmak için kullanılmıştır. Protokol ayrıca memeli hücre hatları ve daha fazla adaptasyon ile maya için uygun olmalıdır.
Bu uyarlamaların amacı, 3C'yi lisans öğrencileri için daha erişilebilir hale getirmektir. Bir lisans öğretim laboratuvarında gerçekleştirilebilecek tekniklere benzer tekniklerin kullanılmasına özen gösterilmiştir. 3C tekniği, lisans öğrencilerine tezgâhta, sınıfta ve mezuniyet sonrası çabalarında gelişimlerine fayda sağlayacak temel moleküler biyoloji tekniklerini öğrenmeleri için birçok öğrenme fırsatı sunmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>215350280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>COEDTAF-RO</td>
			<td>mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td>1 M stock diluted to 500 &#181;M in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl green pyronin&#160;&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>HT70116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>1222530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol-chloroform&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>11459643001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Ready mix (Phire Taq etc)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>KCQS07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>R6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>108319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

getting an a with the 3cs: chromosome conformation capture for undergraduates

Kromozom konformasyon yakalama (3C), kromatinin üç boyutlu organizasyonu hakkında ayrıntılı bilgi sağlayan benzer tekniklerin (örneğin, Hi-C, 4C ve 5C, burada 3C teknikleri olarak anılacaktır) bir ailesini ortaya çıkaran güçlü bir araçtır. 3C teknikleri, kanser hücrelerinde kromatin organizasyonundaki değişikliklerin izlenmesinden, gen promotörleri ile yapılan arttırıcı temasların belirlenmesine kadar çok çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bu teknikleri kullanan çalışmaların çoğu, karmaşık örnek tipleriyle (yani, tek hücreli analiz) genom çapında büyük sorular sorarken, genellikle kaybolan şey, 3C tekniklerinin geniş bir çalışma yelpazesine uygulanabilir temel moleküler biyoloji yöntemlerine dayanmasıdır. Kromatin organizasyonunun sıkı bir şekilde odaklanmış sorularını ele alarak, bu son teknoloji teknik, lisans araştırma ve öğretim laboratuvarı deneyimini geliştirmek için kullanılabilir. Bu makale bir 3C protokolü sunmakta ve lisans araştırma ve öğretim deneyimlerinde öncelikle lisans kurumlarında uygulama için uyarlamalar ve vurgu noktaları sunmaktadır.

An organism&#39;s genome not only holds all the genes required for function but also all the instructions on how and when to use them. This makes regulating access to the genome one of the most important functions of the cell. There are many mechanisms to control gene function; however, at its base level, gene regulation comes down to the ability of regulatory transcription factors (trans-factors) to bind to their specific DNA sequences (cis-regulatory sequences). This is not an innate ability; instead, it is governed by the organization/structure of the genome in the nucleus, which controls the availability/exposure of the cis-regulatory sequences to the trans-factors1,2,3. If the trans-factors cannot find their cis-regulatory sequences, then the trans-factors cannot perform their regulatory tasks. This has made understanding how genomes are organized in the nucleus an important source of inquiry.
It is widely accepted that during interphase, eukaryotic chromosomes in the nucleus occupy their own domain anchored to the nuclear lamina and nuclear matrix (Figure 1), thus making the chromosome more like a slice of pizza, rather than a noodle on a plate of spaghetti. Chromosomes are partially condensed by protein-DNA interactions (chromatin) that twist and loop portions of the chromosome. Through electron microscopy, three-dimensional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA tagging techniques (i.e., fluorescent and artificial DNA methylation), inactive domains of chromatin have been found to be packed tightly along the nuclear periphery4,5,6, while portions of active, less condensed chromatin are found in the interior of the nucleus7,8,9,10. These experiments provide a wide-angle view of chromosome dynamics but do little to capture the changes that occur locally around the gene promotors observed in DNase11,12 and nucleosome13,14,15 studies.
The key to unlocking higher-resolution chromatin dynamics was the formulation of the 3D chromosome mapping technique, 3C. The 3C technique itself comprises four main steps: crosslinking of chromatin, chromatin digestion by restriction enzymes, chromatin ligation, and DNA purification (Figure 2). The new artificial DNA fragments generated by this process can then be characterized to reveal the close physical association between linearly distant pieces of DNA16. The 3C technique became the basis for the creation of multiple spin-off techniques that utilize the initial steps of 3C to ask broader genome-wide questions (e.g., Hi-C, 4C, ChIP-C). This family of 3C techniques has identified that chromosomes are organized into multiple discrete units termed topologically associated domains (TADs). TADs are encoded in the genome and are defined by chromatin loops flanked by unlooped boundaries16,17,18,19. The TAD boundaries are maintained by two evolutionarily conserved and ubiquitous factors, including CCCT binding factor (CTCF) and cohesion, which prevent loops within separate TADs from interacting16,20. The loops are mediated by the interaction of trans-factors with their regulatory sequences, as well as CTCF and cohesion21.
Though many studies using 3C technologies ask broad genome-wide questions and employ complicated sample collection techniques, the formulation of the 3C technique is based on basic molecular biology techniques. This makes 3C intriguing for deployment in both undergraduate research and teaching labs. The 3C technique can be employed for smaller focused questions and is inherently flexible to scaling up or down (single genes22, chromosomes16, and/or genomes18) depending on the focus and direction of the questions asked. This technique has also been applied to a wide range of model systems7,16,19,23 and has been proven to be versatile in its use. This makes 3C an excellent technique for undergraduates in that students can gain experience in common molecular biology techniques while also gaining valuable experience in answering directed questions.
Presented here is an adapted protocol for 3C library preparation based on previously published protocols24,25,26,27. This protocol has been optimized for approximately 1 &#215; 107 cells, though it has generated 3C libraries with as little as 1 &#215; 105 cells. This protocol has proven to be versatile and has been used to generate 3C libraries from zebrafish embryos, zebrafish cell lines, and young-adult (YA) Caenorhabditis elegans (roundworm). The protocol should also be appropriate for mammalian cell lines and, with further adaptation, yeast.
The goal of these adaptations is to make 3C more accessible for undergraduates. Care has been taken to use techniques that are similar to those that can be accomplished in an undergraduate teaching laboratory. The 3C technique provides many learning opportunities for undergraduates to learn basic molecular biology techniques that will benefit their development at the bench, in the classroom, and in their endeavors after graduation.

Yazar Spotlight: 3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyonu Yakalama  

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

Our research aims to uncover how chromatin organization controls gene expression. The focus is on determining what factors regulate chromatin at the gene level to control gene activity. Currently, technologies similar to chromosome confirmation capture, or 3C, are used to make progress in this field.Investments in sample collection and sequencing technologies have pushed us what the 3C techniques can show us. The greatest experimental challenge currently is collecting samples having uniform chromatin architecture. Heterogeneity in samples leads to confounding results.In the future, we'll be focusing on how changes in chromatin organization play a role in cancer.

Bu prosedür bir deneysel 3C numunesi ve iki kontrol numunesi (sindirilmemiş ve sindirilmiş) üretecektir. Bu üç örnek kullanılarak qPCR yapıldı. Bu sonuçlardan sindirim verimliliği hesaplanmış (denklem 1) ve kaydedilmiştir (Tablo 1). Bu hesaplamalardan, 3C örneğinin test edilen yedi genomik lokus boyunca yaklaşık% 88'lik bir sindirim verimliliğine (Tablo 1'in ortalaması) sahip olduğu belirlenmiştir.
Daha sonra, numuneler, lokuslara özgü primerlerin (Tablo 2) ve qPCR kombinasyonları kullanılarak farklı genomik lokuslar arasında uzun menzilli kromatin temaslarının varlığı açısından test edildi. Bu sonuçlar kullanılarak, bir kontrol primer setine göre ürün bollukları hesaplandı (denklem 2) ve karşılaştırma için grafiklendirildi (Şekil 4). Bu veriler, 10 reaksiyondan 8'inin uzun menzilli etkileşimler için koşullu pozitif olduğunu göstermiştir.
PCR reaksiyonları daha sonra bir agaroz jeli üzerinde çalıştırıldı. Sekiz koşullu pozitif ve bir negatif reaksiyon için beklenen PCR ürünü jel saflaştırıldı ve Sanger dizilemesi için gönderildi. Temsili pozitif (mavi ok, mavi kutu) ve negatif (kırmızı ok, kırmızı kutu) reaksiyonların sonuçları gösterilmiştir (Şekil 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg"> Şekil 1: Çekirdekteki kromozom yapısı. Çekirdeğin içindeki varsayımsal kromozom organizasyonu. (A) Nükleer zarf, siyah çizgiler; (B) nükleer lamina, turuncu; (C) heterokromatin, sıkıştırılmış hatlar; (D) ökromatin, gevşek halkalar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg"> Şekil 2: 3C protokolünün şeması. Doğrusal kromozomların uzak kısımları (mavi, sarı ve pembe), düzenleyici döngüler yoluyla çekirdek içinde birbirine yaklaştırılır. (A) Döngü yapılarına transkripsiyon faktörleri (gri daire ve siyah yıldız) aracılık eder; Bu etkileşimler kimyasal çapraz bağlama yoluyla korunur. (B) Döngüler enzimatik sindirim yoluyla kırılır (siyah çizgiler). (C) Uzak kromatin parçaları, sindirim tarafından oluşturulan yapışkan uçlardan birbirine bağlanır. (D) DNA proteinden saflaştırılır. (E) Fragmanlar içindeki sekans tanımlanır ve genoma geri eşlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg"> Resim 3: 3C astar şeması. 3C primerler, ilgilenilen genomik konumdan farklı mesafelerde kısıtlama bölgeleri etrafında tasarlanmıştır. Pembe oklar, bir DpnII bölgesini çevreleyen deneysel astar setlerini temsil eder. Deneysel primerler, bölgedeki kromatin döngüsünü değerlendirmek için karıştırılabilir ve eşleştirilebilir. Turuncu astarlar, DpnII bölgesi olmayan negatif bir kontrolü temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg"> Şekil 4: Bir 3C deneyi için temsili qPCR verileri. 3C test astarı setlerinin göreceli bolluğu. (A) Sindirilmemiş kontroldeki (mavi), sindirilmiş kontroldeki (gri) ve 3C numunesindeki (turuncu) ürünün nispi bolluğunu gösteren kontrol grafiği. (B) 3C deneyi; Sindirilmemiş kontrol (mavi), sindirilmiş kontrol (gri) ve 3C numunesindeki (turuncu) test primerlerinin kombinasyonlarından ürünün nispi bolluğu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg"> Şekil 5: 3C qPCR ürünlerinin görselleştirilmesi. Üstte, jel ile qPCR uç nokta ürünleri ile örnekler belirtilir. Altta, belirtilen reaksiyonlar için temsili Sanger dizisi izleme dosyaları. Turuncu numune yanlış pozitifin bir örneğidir (bkz. Şekil 4, r38/34) ve mavi numune, izlemenin üzerinde belirtilen DpnII bölgesi ile gerçek bir pozitif örneğidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Site</td>
			<td>% sindirim</td>
		</tr><tr><td>r8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>r3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>r38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>R34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>r33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>R14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>R47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Hesaplanan sindirim verimliliği.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Ad</td>
			<td colspan="3">Sıra</td>
			<td>Genomik lokuslar</td>
		</tr><tr><td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>r3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>r38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr><tr><td>r38 RVS</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>r34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>r34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>r33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>r33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>r14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>r47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>r47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>r8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>Kontrol astarı FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>Kontrol astarı RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCAACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Temsili 3C deneyi için astarlar.

Watch this Scientific Journal Video about Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates at JoVE.com

Burada, kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniğinin lisans katılımı ve öğrenimine vurgu yaparak ayrıntılı olarak bir adaptasyonunu sunuyoruz.

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Araştırmamız, kromatin organizasyonunun gen ekspresyonunu nasıl kontrol ettiğini ortaya çıkarmayı amaçlamaktadır. Odak noktası, gen aktivitesini kontrol etmek için hangi faktörlerin gen düzeyinde kromatini düzenlediğini belirlemektir. Şu anda, kromozom doğrulama yakalama veya 3C'ye benzer teknolojiler bu alanda ilerleme kaydetmek için kullanılmaktadır.Numune toplama ve sıralama teknolojilerine yapılan yatırımlar, 3C tekniklerinin bize gösterebileceklerini bize itti. Şu anda en büyük deneysel zorluk, tek tip kromatin mimarisine sahip örnekler toplamaktır. Örneklerdeki heterojenlik kafa karıştırıcı sonuçlara yol açar.Gelecekte, kromatin organizasyonundaki değişikliklerin kanserde nasıl bir rol oynadığına odaklanacağız.

getting-an-with-3cs-chromosome-conformation-capture-for

Research

JoVE Journal

Genetics

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

2.1K Görüntüleme.  Bryant University. Araştırmamız, kromatin organizasyonunun gen ekspresyonunu nasıl kontrol ettiğini ortaya çıkarmayı amaçlamaktadır. Odak noktası, gen aktivitesini kontrol etmek için hangi faktörlerin gen düzeyinde kromatini düzenlediğini belirlemektir. Şu anda, kromozom doğrulama yakalama veya 3C'ye benzer teknolojiler bu alanda ilerleme kaydetmek için kullanılmaktadır.Numune toplama ve sıralama teknolojilerine yapılan yatırımlar, 3C tekniklerinin bize gösterebileceklerini bize...

Video: Yazar Spotlight: 3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyonu Yakalama  

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Genetik

Generation and Purification of Chromosome Conformation Capture (3C) Library

On day one after chromatin cross-linking and nuclei collection from 5, 000 young adult Caenorhabditis Elegans worms, transfer the nuclei pellet re-suspended in 450 microliters of clean water to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube. Then add 60 microliters of 10X DPN2 restriction enzyme buffer to it and mix well. Incubate the samples with 15 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate at 37 degrees Celsius for one hour with agitation.Quench the reaction by adding 75 microliters of 20%triton X 100 and incubating as demonstrated previously. Aliquot 10 microliters from the sample, as the undigested control, and store it at four degrees Celsius. After adding 400 units of DPN 2 to the rest of the sample, incubate it overnight at 37 degrees Celsius with agitation for chromatin digestion.On day two, add an additional 200 units of DPN 2 to the sample. To complete the digestion of the cross-linked sample, incubate it at 37 degrees Celsius with agitation for four hours. Heat inactivate the restriction enzyme by incubating the sample for 20 minutes at 65 degrees Celsius.If the enzyme cannot be inactivated by heat, add 80 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate and incubate. Then, add 375 microliters of 20%Triton X 100 to the sample and mix by swirling. Keep aside a 10 microliter aliquot from the sample as the digestion control.For chromatin ligation, transfer the sample to a clean 50 milliliter conical tube. Adjust the sample volume to 5.7 milliliters with molecular grade water and mix by swirling. Then, add 700 microliters of 10 X T4 ligase buffer, followed by 60 units of T4 DNA ligase, and incubate the sample overnight at 16 degrees Celsius.On day three, proceed with protein digestion and reverse cross-linking. Add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter Proteinase K to the 3C sample and incubate at 65 degrees Celsius overnight with agitation. To begin purification of the 3C library on day four, add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A to the sample and mix by swirling.After incubation, add seven milliliters of phenyl chloroform to the samples and mix by shaking. Centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G and room temperature. Collect and transfer the aqueous phase to a clean 50 milliliter conical tube.Add equal volumes of chloroform and mix the sample by shaking. After centrifuging the sample again as demonstrated, transfer the aqueous phase to another clean 50 milliliter conical tube. Add 7.5 milliliters of molecular grade water, 35 milliliters of 100%ethanol and seven microliters of one milligram per milliliter Glycogen.Freeze the properly mixed sample at minus 80 degrees Celsius. While the sample freezes, begin purifying the control samples by adjusting the volume of the controls to 500 microliters using molecular grade water. Add two microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A and mix by flicking the tube.Next, add one milliliter of phenyl chloroform to the tubes containing the controls and mix by shaking. Centrifuge the tubes. After transferring the aqueous phase to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube, add equal volumes of chloroform.Centrifuge as previously demonstrated before collecting the aqueous phase. To the collected aqueous phase, add one milliliter of ethanol and two microliters of one milligram per milliliter glycogen. After mixing the sample by shaking, incubate it at minus 80 degrees Celsius for 30 minutes.Next, centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G at four degrees Celsius. After removing the supernatant, add 750 microliters of chilled 70%ethanol and centrifuge. Re-suspend the air dried pellet in 50 microliters of molecular grade water.The suspension can be frozen here if not proceeding further immediately. To continue with the 3C sample purification, remove the sample from the freezer and centrifuge at 3, 270 G for 30 minutes. Add 10 milliliters of chilled 70%ethanol and break up the DNA pellet.After centrifuging and removing the supernatant, partially air dry the sample at room temperature. Re suspend the pellet in 150 microliters of 10 millimolar tris HCL at pH 7.5 by pipetting up and down to obtain the purified 3C library. QPCR performed on the one experimental and two control 3C samples helped generate the digestion efficiency data.The 3C sample had an approximately 88%digestion efficiency across the seven genomic loci tested.

Kromozom Konformasyonu Yakalama (3C) Kütüphanesinin Oluşturulması ve Saflaştırılması

Identification of the Chromosome Conformation Capture (3C) Products

Take the chromosome confirmation capture or 3C sample and controls, and perform QPCR. Excise the product bands corresponding to the expected fragment size. To perform gel extraction of the PCR products, use a commercial kit or follow the homemade protocol.For the latter, construct a homemade purification cartridge by poking a hole in the bottom of a 0.5 milliliter tube with a needle. Pack a small amount of cotton into the bottom of the tube with the hole, filling no more than half of the tube. Place the tube into a 1.5 milliliter tube, ensuring that the smaller tube rests on the lip of the bigger tube, and not in the tube.Carefully cut the gel fragment into smaller pieces, and place it in the small tube of the cartridge. Place the assembly in a minus 20 degrees Celsius freezer for five minutes. Then, spin the assembly for three minutes at 13, 000 G and room temperature.Discard the small tube containing the agoros debris, and keep the 1.5 milliliter tube with the extracted DNA in the buffer. The samples were tested for the presence of long range chromatin contacts between the different genomic loci, using combinations of loci-specific primers and QPCR. The product abundance is relative to a control primer set were calculated and graft for comparison.The data indicated that 8 of the 10 reactions were conditional positives. Gel purification and sequencing of the expected PCR product for the eight conditional positives and one negative reaction were gel purified and sequenced. The results for representative positive and negative reactions are shown.