Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence del National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di sovvenzione P20GM103430 e dal Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.

Cattura della conformazione cromosomica (3C) per la ricerca e l'insegnamento universitari

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	<li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+architectural+proteins.">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li><li>Nalabothula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chromatin+architectural+proteins+HMGD1+and+H1+bind+reciprocally+and+have+opposite+effects+on+chromatin+structure+and+gene+regulation.">The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation.</a> BMC Genomics. 15, 92 (2014).</li><li>John, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+pre-determines+glucocorticoid+receptor+binding+patterns.">Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns.</a> Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).</li><li>Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+occurrence+of+a+fibrous+lamina+on+the+inner+aspect+of+the+nuclear+envelope+in+certain+cells+of+vertebrates.">On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates.</a> The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).</li><li>Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+repression+mediated+by+repositioning+of+genes+to+the+nuclear+lamina.">Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina.</a> Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).</li><li>Finlan, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+to+the+nuclear+periphery+can+alter+expression+of+genes+in+human+cells.">Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells.</a> PLoS Genetics. 4 (3), e1000039 (2008).</li><li>Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+re-organisation+of+the+Hoxb+complex+during+mouse+embryonic+development.">Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.</a> Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).</li><li>Chambeyron, S., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+and+nuclear+reorganization+of+the+HoxB+locus+upon+induction+of+transcription.">Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.</a> Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).</li><li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+active+and+inactive+genes+and+noncoding+DNA+within+chromosome+territories.">Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).</li><li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH.">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li><li>Li, B., Carey, M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+chromatin+during+transcription.">The role of chromatin during transcription.</a> Cell. 128 (4), 707-719 (2007).</li><li>Chen, A., Chen, D., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+of+DNase-seq+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+in+animals.">Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals.</a> Gene. 667, 83-94 (2018).</li><li>Hughes, A. L., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+underlying+nucleosome+positioning+in+vivo.">Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).</li><li>Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+nucleosome+mapping+reveals+transcription-dependent+promoter+packaging.">High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging.</a> Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).</li><li>Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+evolutionary+approach+to+identify+determinants+of+nucleosome+positioning:+A+unifying+model+for+establishing+the+genome-wide+pattern.">A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern.</a> Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).</li><li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li><li>van Berkum, N. L., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+spatial+chromatin+organization+of+large+genomic+regions+using+5C+technology.">Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology.</a> Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).</li><li>Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invariant+TAD+boundaries+constrain+cell-type-specific+looping+interactions+between+promoters+and+distal+elements+around+the+CFTR+locus.">Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus.</a> American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).</li><li>Crane, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+inputs+into+C.+elegans+dosage+compensation:+Chromosome+conformation+and+the+miRNA-specific+argonaute+ALG-2.">Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2.</a> University of California, Berkeley. , (2012).</li><li>Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+CTCF+is+required+for+the+enhancer+blocking+activity+of+vertebrate+insulators.">The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators.</a> Cell. 98 (3), 387-396 (1999).</li><li>Cuadrado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+contributions+of+cohesin-SA1+and+cohesin-SA2+to+TADs+and+polycomb+domains+in+embryonic+stem+cells.">Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells.</a> Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).</li><li>Sarro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+the+three-dimensional+regulatory+topology+of+the+Pitx1+locus+results+in+overtly+normal+development.">Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development.</a> Development. 145 (7), (2018).</li><li>Tolhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+among+polycomb+domains+are+guided+by+chromosome+architecture.">Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture.</a> PLoS Genetics. 7 (3), e1001343 (2011).</li><li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology:+From+fixation+to+computation.">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li><li>Fern&#225;ndez-Mi&#241;&#225;n, A., Bessa, J., Tena, J. J., G&#243;mez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture,+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish.">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+&amp;#34;C&amp;#34;+s+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three &amp;#34;C&amp;#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li><li>Hag&#232;ge, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+(3C-qPCR).">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li><li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=My5C:+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies.">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li><li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression.">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500 (2019).</li></ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il 3C è una tecnica potente che affonda le sue radici nelle tecniche molecolari di base. È questa base di strumenti fondamentali che rende 3C una tecnica così intrigante da utilizzare con gli studenti universitari. Con così tanti studi recenti che osservano la dinamica della cromatina su una scala così ampia, l'utilizzo di questi risultati per ideare un esperimento focalizzato su un singolo gene o regione genomica ha il potenziale per creare un esperimento unico e di impatto nella ricerca universitaria. Spesso, esperimenti come questi sono considerati troppo avanzati per gli studenti universitari, ma con un'attenta pianificazione, sono facilmente realizzabili. È importante notare che i saggi progettati per sondare le connessioni della cromatina catturate dalla libreria 3C possono variare dalla PCR semi-quantitativa dell'endpoint al sequenziamento dell'intero genoma. Infatti, i dati del primo documento 3C16 sono stati generati da qPCR. Questa vasta gamma di saggi può essere utilizzata perché tutte le tecnologie 3C producono lo stesso prodotto: una libreria di frammenti di DNA che rappresentano le connessioni 3D nel nucleo.
Presentato qui è un adattamento di un protocollo più flessibile e accomodante che si adatta meglio ai ricercatori universitari. I periodi di pausa sopra elencati implicano ritardi notturni; Tuttavia, queste pause possono estendersi durante i fine settimana e, nel caso delle cellule e dei nuclei, per settimane. La considerazione più cruciale è quando il lavoro sarà fatto. Spesso nei protocolli, ci sono passaggi sensibili al tempo quando la pausa non è un'opzione. Al di fuori di alcuni punti (giorno 1 e giorno 2), ci sono molti posti dove fermarsi e congelare il campione. Questi sono fondamentali quando si lavora con studenti universitari in cui gli orari e i tempi del lavoro di laboratorio devono essere flessibili. Oltre a progettare queste fermate nel protocollo, gli studenti universitari sono incoraggiati a lavorare in coppia o anche in piccoli gruppi di tre o quattro. I gruppi funzionano bene per questo protocollo, poiché gli studenti possono sostenersi a vicenda e creare un sistema di amicizia in modo che tutti lavorino in sicurezza. Il lavoro di laboratorio è anche più divertente con gli altri coinvolti. Con i gruppi, gli studenti possono anche lavorare su una varietà di domande incentrate sull'organizzazione della cromatina pur eseguendo lo stesso protocollo. Pertanto, anche mentre gli studenti stanno lavorando su progetti separati, il protocollo collega i loro sforzi e, per questo motivo, possono sostenersi a vicenda.
Altri adattamenti hanno lo scopo di aggirare il fatto che alcuni strumenti e attrezzature specializzati non si trovano necessariamente in tutte le istituzioni universitarie. Queste apparecchiature includono, ma non sono limitate a, termociclatori qPCR, sistemi di documentazione su gel e spettrometri di volume nano. In effetti, questi pezzi di equipaggiamento sono convenienti ma non sono un requisito. Qui, il metodo classico di 3C è anche descritto nella parte di progettazione del primer; Ciò comporta l'identificazione di un locus genomico di interesse e, da questo, la valutazione di altri loci genomici per i punti di contatto della cromatina più lontani. Questa tecnica funziona bene anche se viene utilizzato un set di dati pubblicato, ad esempio un set di dati che utilizza Hi-C, in cui vengono identificati loci positivi (di connessione) e negativi (non di connessione) noti. La progettazione di esperimenti utilizzando questi set di dati pubblicati è un altro grande adattamento per i laboratori didattici, poiché la possibilità di identificare con successo le connessioni della cromatina è solitamente maggiore. Inoltre, l'articolo di ricerca può essere discusso in classe ed essere utilizzato come riferimento.
Questo protocollo utilizza un approccio qPCR modificato per visualizzare la formazione del prodotto 3C. I controlli sono essenziali per il successo della tecnica 3C. Ogni esperimento utilizza sia controlli di esempio che controlli di base per determinare il completamento della procedura 3C. I controlli del campione includono un controllo non digerito (DNA genomico) e un controllo digerito. Il controllo non digerito determina il segnale di base per i set di primer e viene utilizzato con il controllo della digestione reticolato per determinare l'efficienza della digestione Si prevede che ci sarà un calo del prodotto per qualsiasi primer diretto attraverso un sito di restrizione. Il confronto di questo valore con il controllo non digerito fornisce un'indicazione di quanto bene il campione è stato digerito.
I primer per la PCR includono un primer di controllo e primer di prova. Il primer di controllo è un set di primer che si trova vicino alla regione genomica da analizzare e non contiene un sito di restrizione. Ciò fornisce la linea di base per determinare l'abbondanza dei prodotti PCR primer di prova. I primer di prova sono primer avanti e indietro che fiancheggiano un sito di restrizione per un particolare locus genomico di interesse (Figura 3). Le reazioni che utilizzano questi set di primer vengono confrontate per determinare l'efficienza della digestione, poiché l'abbondanza di prodotto dovrebbe diminuire se il sito di restrizione è stato tagliato. Nel determinare l'organizzazione della cromatina, un primer di prova da un locus è accoppiato con un altro primer di prova da un altro locus genomico per determinare se questi due loci sono vicini nello spazio 3D. In tal caso, l'aspettativa è che un prodotto PCR venga trovato solo utilizzando il campione 3C come modello.
È importante notare che anche i primer convalidati hanno la tendenza a fallire (Figura 4: set di primer r14). Inoltre, i prodotti PCR sono spesso identificati nelle reazioni di controllo e nelle reazioni in cui non è prevista una connessione della cromatina (come il controllo digerito, poiché non è legato). Queste istanze vengono sequenziate e non superano il controllo qualità Sanger o restituiscono senza una sequenza definita (Figura 5). Inoltre, gli esperimenti 3C tradizionali generano un "modello di controllo", un campione di DNA non reticolato, digerito e legato, che rappresenta tutti i possibili frammenti legati che possono essere prodotti con una data quantità di DNA. Il "modello di controllo" svolge un ruolo importante nel confrontare le intensità dei segnali qPCR tra due loci genomici per determinare se il segnale rappresenta una vera interazione o solo un'associazione casuale. La creazione di un "modello di controllo" può essere problematica, poiché gran parte della cromatina da analizzare deve essere catturata sotto forma di cromosoma artificiale ed elaborata insieme ai campioni 3C. Garantire un tale costrutto potrebbe non essere fattibile e crearne uno potrebbe essere al di fuori dell'ambito di un progetto semestrale. A causa di queste difficoltà, si consiglia di utilizzare un primer di controllo. Il primer di controllo non sostituisce tutte le funzionalità del "modello di controllo", ma offre comunque l'opportunità di analizzare i dati per effettuare determinazioni di "presenza" o "assenza".
Quando si esegue la qPCR, è importante utilizzare quantità uguali di campione. Questo dovrebbe essere determinato, anche se si utilizza un nano-spettrofotometro come un nanodrop, generando una curva standard dal DNA genomico di una concentrazione nota e adattando i campioni 3C a quella linea. Queste quantità devono essere registrate e utilizzate nelle PCR successive. Anche la qualità della reazione PCR è importante. Poiché la PCR viene eseguita in qPCR, l'abbondanza del prodotto viene misurata utilizzando la fluorescenza e registrata. Questa registrazione è accessibile nel grafico di amplificazione. Una volta terminato il programma, è importante controllare il grafico di amplificazione e assicurarsi che le reazioni (ad eccezione dei controlli no template) abbiano tre fasi: una baseline, una esponenziale e una fase plateau/saturazione. È importante verificare che le reazioni abbiano una fase esponenziale, in particolare per la definizione della soglia (vedi sotto). Inoltre, per i campioni diluiti in serie, dovrebbe esserci uno spostamento dei valori di Ct coerente con la diluizione del campione (la concentrazione più alta avrà i valori di Ct più bassi, mentre la concentrazione più bassa avrà i valori di Ct più alti). I campioni che non riflettono questo cambiamento nel grafico di amplificazione richiedono una nuova diluizione o indicano un problema più ampio con la formazione del campione 3C. Infine, durante la generazione della curva standard, il software PCR calcolerà l'efficienza della PCR e il valore R2 . L'efficienza della PCR dovrebbe essere superiore al 90% e il valore di R2 dovrebbe essere maggiore di 0,99. Se una di queste condizioni non è soddisfatta, è probabile che qualcosa non vada nel campione o nei primer PCR.
Dopo la qPCR, la percentuale di digestione e la presenza di interazioni 3C possono essere calcolate utilizzando la qPCR Ct per ogni reazione. Per determinarli, in primo luogo, deve essere impostata la soglia per la reazione PCR. Questo viene normalmente fatto utilizzando il software fornito con la macchina qPCR. L'impostazione della soglia definirà la concentrazione del prodotto PCR che verrà utilizzato per confrontare i valori di Ct del campione. La soglia dovrebbe dividere in due le curve di amplificazione delle reazioni PCR nella fase esponenziale di amplificazione. Solo le reazioni PCR con amplificazione esponenziale possono essere confrontate (in questo caso, i primer di controllo e le reazioni di primer del test), poiché questo è l'unico modo per garantire che le reazioni stiano amplificando il DNA alla stessa velocità e possano essere confrontate fedelmente. Quando si analizzano i grafici 3C, le reazioni condizionatamente positive sono identificate come quelle con più prodotto rispetto ai campioni di controllo, al controllo genomico e al controllo della digestione (Figura 4B). Tuttavia, questi campioni devono essere ulteriormente convalidati utilizzando il sequenziamento Sanger dopo la purificazione del gel del prodotto PCR.
Dopo il sequenziamento Sanger, i campioni che superano il controllo qualità possono essere analizzati utilizzando Blat. L'obiettivo di questa analisi è determinare se il campione ha la sequenza di entrambi i loci genomici bersaglio che fiancheggiano il sito di restrizione (DpnII nel caso di questo protocollo). Se vengono identificate entrambe le sequenze, il frammento 3C può essere considerato convalidato. Se i risultati del Blat non restituiscono la sequenza prevista, ciò potrebbe indicare che uno o entrambi i primer non sono ottimali, con conseguente risultato qPCR falso positivo. I file di traccia per i campioni falsi positivi avranno picchi di base indefiniti e i report Seq conterranno principalmente "n" chiamate di base.
La convalida con metodo Sanger è essenziale, poiché sono possibili falsi positivi dalla formazione di prodotti PCR artifattuali. Questi falsi positivi possono essere identificati quando i prodotti di sequenziamento non hanno la sequenza target prevista o una caratteristica del sito DpnII di un frammento 3C appropriato (Figura 5). Il sequenziamento dei frammenti di PCR fornisce anche un altro punto dati per l'esperimento e fa capire agli studenti che la tecnica 3C sta identificando loci genomici distanti che si stanno unendo nello spazio 3D all'interno dei nuclei.
La tecnica 3C fornisce una vasta gamma di tecniche molecolari fondamentali per gli studenti universitari in una procedura flessibile e semplice. Questa tecnica 3C è anche un punto di partenza per le altre tecniche 3C che incorporano il sequenziamento di nuova generazione (NGS). Questi tipi di esperimenti possono esporre gli studenti universitari ad aspetti importanti della bioinformatica e sono radicati nei principi di base qui delineati. L'esperienza universitaria e il coinvolgimento sono fondamentali per il loro successo e sviluppo come giovani scienziati. Fornendo queste opportunità, gli studenti universitari possono rafforzare la loro comprensione dei principi di base mentre costruiscono la loro fiducia per affrontare tecniche e domande all'avanguardia.

Il genoma di un organismo non solo contiene tutti i geni necessari per la funzione, ma anche tutte le istruzioni su come e quando usarli. Ciò rende la regolazione dell'accesso al genoma una delle funzioni più importanti della cellula. Ci sono molti meccanismi per controllare la funzione genica; tuttavia, al suo livello di base, la regolazione genica si riduce alla capacità dei fattori di trascrizione regolatori (trans-fattori) di legarsi alle loro specifiche sequenze di DNA (sequenze cis-regolatorie). Questa non è un'abilità innata; Invece, è governato dall'organizzazione/struttura del genoma nel nucleo, che controlla la disponibilità/esposizione delle sequenze cis-regolatorie ai trans-fattori 1,2,3. Se i trans-fattori non riescono a trovare le loro sequenze cis-regolatorie, allora i trans-fattori non possono svolgere i loro compiti regolatori. Ciò ha reso la comprensione di come i genomi sono organizzati nel nucleo un'importante fonte di indagine.
È ampiamente accettato che durante l'interfase, i cromosomi eucariotici nel nucleo occupano il proprio dominio ancorato alla lamina nucleare e alla matrice nucleare (Figura 1), rendendo così il cromosoma più simile a una fetta di pizza, piuttosto che a una tagliatella su un piatto di spaghetti. I cromosomi sono parzialmente condensati da interazioni proteina-DNA (cromatina) che torcono e ciclizzano porzioni del cromosoma. Attraverso la microscopia elettronica, l'ibridazione tridimensionale in situ con fluorescenza del DNA (FISH) e le tecniche di marcatura del DNA (cioè metilazione del DNA fluorescente e artificiale), i domini inattivi della cromatina sono stati trovati impacchettati strettamente lungo la periferia nucleare 4,5,6, mentre porzioni di cromatina attiva e meno condensata si trovano all'interno del nucleo 7,8,9, 10. Questi esperimenti forniscono una visione grandangolare della dinamica cromosomica, ma fanno poco per catturare i cambiamenti che si verificano localmente intorno ai promotori genici osservati negli studi DNasi11,12 e nucleosoma13,14,15.
La chiave per sbloccare la dinamica della cromatina ad alta risoluzione è stata la formulazione della tecnica di mappatura cromosomica 3D, 3C. La tecnica 3C comprende quattro fasi principali: reticolazione della cromatina, digestione della cromatina mediante enzimi di restrizione, legatura della cromatina e purificazione del DNA (Figura 2). I nuovi frammenti di DNA artificiale generati da questo processo possono quindi essere caratterizzati per rivelare la stretta associazione fisica tra pezzi linearmente distanti di DNA16. La tecnica 3C è diventata la base per la creazione di molteplici tecniche spin-off che utilizzano i passaggi iniziali di 3C per porre domande più ampie sull'intero genoma (ad esempio, Hi-C, 4C, ChIP-C). Questa famiglia di tecniche 3C ha identificato che i cromosomi sono organizzati in più unità discrete chiamate domini topologicamente associati (TAD). I TAD sono codificati nel genoma e sono definiti da anelli di cromatina affiancati da confini non looped16,17,18,19. I confini del TAD sono mantenuti da due fattori evolutivamente conservati e ubiquitari, tra cui il fattore di legame CCCT (CTCF) e la coesione, che impediscono ai circuiti all'interno di TAD separati di interagire16,20. I loop sono mediati dall'interazione dei fattori trans con le loro sequenze regolatorie, nonché dalla CTCF e dalla coesione21.
Sebbene molti studi che utilizzano tecnologie 3C pongano ampie domande sull'intero genoma e impieghino complicate tecniche di raccolta dei campioni, la formulazione della tecnica 3C si basa su tecniche di biologia molecolare di base. Ciò rende 3C intrigante per l'implementazione sia nella ricerca universitaria che nei laboratori didattici. La tecnica 3C può essere impiegata per domande focalizzate più piccole ed è intrinsecamente flessibile al ridimensionamento verso l'alto o verso il basso (singoli geni22, cromosomi16 e / o genomi18) a seconda del focus e della direzione delle domande poste. Questa tecnica è stata applicata anche a una vasta gamma di sistemi modello 7,16,19,23 e si è dimostrata versatile nel suo utilizzo. Ciò rende 3C una tecnica eccellente per gli studenti universitari in quanto gli studenti possono acquisire esperienza nelle comuni tecniche di biologia molecolare e allo stesso tempo acquisire una preziosa esperienza nel rispondere a domande dirette.
Presentato qui è un protocollo adattato per la preparazione della libreria 3C basato sui protocolli precedentemente pubblicati24,25,26,27. Questo protocollo è stato ottimizzato per circa 1 × 107 celle, sebbene abbia generato librerie 3C con un minimo di 1 × 105 celle. Questo protocollo ha dimostrato di essere versatile ed è stato utilizzato per generare librerie 3C da embrioni di zebrafish, linee cellulari di zebrafish e Caenorhabditis elegans (nematodi) giovani adulti (YA). Il protocollo dovrebbe essere appropriato anche per le linee cellulari di mammifero e, con un ulteriore adattamento, per il lievito.
L'obiettivo di questi adattamenti è quello di rendere 3C più accessibile per gli studenti universitari. È stata prestata attenzione a utilizzare tecniche simili a quelle che possono essere realizzate in un laboratorio didattico universitario. La tecnica 3C offre molte opportunità di apprendimento per gli studenti universitari per apprendere tecniche di biologia molecolare di base che andranno a beneficio del loro sviluppo al banco, in classe e nei loro sforzi dopo la laurea.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>37% Formaldehyde&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>215350280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>COEDTAF-RO</td>
			<td>mixed to 50x in water. Diluted to 1x in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td>1 M stock diluted to 500 &#181;M in Sucrose buffer and GB buffer fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnII</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0543M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycine</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycogen</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>10901393001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl green pyronin&#160;&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>HT70116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgAc2</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>1222530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S5136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol-chloroform&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>11459643001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>IBI Scientific</td>
			<td>IB05406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR Ready mix (Phire Taq etc)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>KCQS07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>R6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>108319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>Millapore-Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

getting an a with the 3cs: chromosome conformation capture for undergraduates

La cattura della conformazione cromosomica (3C) è un potente strumento che ha generato una famiglia di tecniche simili (ad esempio, Hi-C, 4C e 5C, indicate qui come tecniche 3C) che forniscono informazioni dettagliate sull'organizzazione tridimensionale della cromatina. Le tecniche 3C sono state utilizzate in una vasta gamma di studi, dal monitoraggio dei cambiamenti nell'organizzazione della cromatina nelle cellule tumorali all'identificazione dei contatti enhancer effettuati con i promotori genici. Mentre molti degli studi che utilizzano queste tecniche pongono grandi domande a livello di genoma con tipi di campioni complessi (cioè analisi a singola cellula), ciò che spesso si perde è che le tecniche 3C sono basate su metodi di biologia molecolare di base applicabili a una vasta gamma di studi. Affrontando questioni strettamente focalizzate sull'organizzazione della cromatina, questa tecnica all'avanguardia può essere utilizzata per migliorare l'esperienza di ricerca universitaria e di laboratorio di insegnamento. Questo documento presenta un protocollo 3C e fornisce adattamenti e punti di enfasi per l'implementazione presso istituzioni principalmente universitarie in esperienze di ricerca e insegnamento universitarie.

An organism&#39;s genome not only holds all the genes required for function but also all the instructions on how and when to use them. This makes regulating access to the genome one of the most important functions of the cell. There are many mechanisms to control gene function; however, at its base level, gene regulation comes down to the ability of regulatory transcription factors (trans-factors) to bind to their specific DNA sequences (cis-regulatory sequences). This is not an innate ability; instead, it is governed by the organization/structure of the genome in the nucleus, which controls the availability/exposure of the cis-regulatory sequences to the trans-factors1,2,3. If the trans-factors cannot find their cis-regulatory sequences, then the trans-factors cannot perform their regulatory tasks. This has made understanding how genomes are organized in the nucleus an important source of inquiry.
It is widely accepted that during interphase, eukaryotic chromosomes in the nucleus occupy their own domain anchored to the nuclear lamina and nuclear matrix (Figure 1), thus making the chromosome more like a slice of pizza, rather than a noodle on a plate of spaghetti. Chromosomes are partially condensed by protein-DNA interactions (chromatin) that twist and loop portions of the chromosome. Through electron microscopy, three-dimensional DNA fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA tagging techniques (i.e., fluorescent and artificial DNA methylation), inactive domains of chromatin have been found to be packed tightly along the nuclear periphery4,5,6, while portions of active, less condensed chromatin are found in the interior of the nucleus7,8,9,10. These experiments provide a wide-angle view of chromosome dynamics but do little to capture the changes that occur locally around the gene promotors observed in DNase11,12 and nucleosome13,14,15 studies.
The key to unlocking higher-resolution chromatin dynamics was the formulation of the 3D chromosome mapping technique, 3C. The 3C technique itself comprises four main steps: crosslinking of chromatin, chromatin digestion by restriction enzymes, chromatin ligation, and DNA purification (Figure 2). The new artificial DNA fragments generated by this process can then be characterized to reveal the close physical association between linearly distant pieces of DNA16. The 3C technique became the basis for the creation of multiple spin-off techniques that utilize the initial steps of 3C to ask broader genome-wide questions (e.g., Hi-C, 4C, ChIP-C). This family of 3C techniques has identified that chromosomes are organized into multiple discrete units termed topologically associated domains (TADs). TADs are encoded in the genome and are defined by chromatin loops flanked by unlooped boundaries16,17,18,19. The TAD boundaries are maintained by two evolutionarily conserved and ubiquitous factors, including CCCT binding factor (CTCF) and cohesion, which prevent loops within separate TADs from interacting16,20. The loops are mediated by the interaction of trans-factors with their regulatory sequences, as well as CTCF and cohesion21.
Though many studies using 3C technologies ask broad genome-wide questions and employ complicated sample collection techniques, the formulation of the 3C technique is based on basic molecular biology techniques. This makes 3C intriguing for deployment in both undergraduate research and teaching labs. The 3C technique can be employed for smaller focused questions and is inherently flexible to scaling up or down (single genes22, chromosomes16, and/or genomes18) depending on the focus and direction of the questions asked. This technique has also been applied to a wide range of model systems7,16,19,23 and has been proven to be versatile in its use. This makes 3C an excellent technique for undergraduates in that students can gain experience in common molecular biology techniques while also gaining valuable experience in answering directed questions.
Presented here is an adapted protocol for 3C library preparation based on previously published protocols24,25,26,27. This protocol has been optimized for approximately 1 &#215; 107 cells, though it has generated 3C libraries with as little as 1 &#215; 105 cells. This protocol has proven to be versatile and has been used to generate 3C libraries from zebrafish embryos, zebrafish cell lines, and young-adult (YA) Caenorhabditis elegans (roundworm). The protocol should also be appropriate for mammalian cell lines and, with further adaptation, yeast.
The goal of these adaptations is to make 3C more accessible for undergraduates. Care has been taken to use techniques that are similar to those that can be accomplished in an undergraduate teaching laboratory. The 3C technique provides many learning opportunities for undergraduates to learn basic molecular biology techniques that will benefit their development at the bench, in the classroom, and in their endeavors after graduation.

Autore in primo piano: Ottenere una A con le 3C: Acquisizione della conformazione cromosomica per gli studenti universitari  

Ottenere una A con le 3C: cattura della conformazione cromosomica per gli studenti universitari

Our research aims to uncover how chromatin organization controls gene expression. The focus is on determining what factors regulate chromatin at the gene level to control gene activity. Currently, technologies similar to chromosome confirmation capture, or 3C, are used to make progress in this field.Investments in sample collection and sequencing technologies have pushed us what the 3C techniques can show us. The greatest experimental challenge currently is collecting samples having uniform chromatin architecture. Heterogeneity in samples leads to confounding results.In the future, we'll be focusing on how changes in chromatin organization play a role in cancer.

Questa procedura produrrà un campione sperimentale 3C e due campioni di controllo (non digeriti e digeriti). Utilizzando questi tre campioni, è stata eseguita la qPCR. Da questi risultati, l'efficienza della digestione è stata calcolata (equazione 1) e registrata (Tabella 1). Da questi calcoli, è stato determinato che il campione 3C aveva un'efficienza di digestione di circa l'88% (media della Tabella 1) nei sette loci genomici testati.
Successivamente, i campioni sono stati testati per la presenza di contatti cromatinici a lungo raggio tra i diversi loci genomici utilizzando combinazioni di primer loci-specifici (Tabella 2) e qPCR. Utilizzando questi risultati, sono state calcolate le abbondanze del prodotto relative a un set di primer di controllo (equazione 2) e rappresentate graficamente per il confronto (Figura 4). Questi dati hanno indicato che 8 delle 10 reazioni erano positive condizionali per interazioni a lungo raggio.
Le reazioni PCR sono state quindi eseguite su un gel di agarosio. Il prodotto PCR atteso per gli otto positivi condizionali e una reazione negativa è stato purificato con gel e inviato per il sequenziamento Sanger. Vengono mostrati i risultati per le reazioni rappresentative positive (freccia blu, riquadro blu) e negative (freccia rossa, riquadro rosso) (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg"> Figura 1: Struttura cromosomica nel nucleo. Ipotetica organizzazione cromosomica all'interno del nucleo. (A) Involucro nucleare, linee nere; B) lamina nucleare, arancione; C) eterocromatina, linee compattate; D) eucromatina, anelli sciolti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg"> Figura 2: Schema del protocollo 3C. Porzioni distanti di cromosomi lineari (blu, giallo e rosa) sono avvicinate all'interno del nucleo attraverso cicli regolatori. (A) Le strutture ad anello sono mediate da fattori di trascrizione (cerchio grigio e stella nera); Queste interazioni sono preservate attraverso la reticolazione chimica. (B) I loop sono interrotti attraverso la digestione enzimatica (linee nere). (C) I pezzi di cromatina distanti sono legati insieme attraverso le estremità attaccanti create dalla digestione. (D) Il DNA è purificato dalle proteine. (E) La sequenza all'interno dei frammenti viene identificata e mappata fino al genoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg"> Figura 3: Lo schema di primer 3C. I primer 3C sono progettati attorno a siti di restrizione a distanze variabili dalla posizione genomica di interesse. Le frecce rosa rappresentano i set di primer sperimentali che circondano un sito DpnII. I primer sperimentali possono essere miscelati e abbinati per valutare il ciclo della cromatina nella regione. I primer arancioni rappresentano un controllo negativo senza un sito DpnII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg"> Figura 4: Dati qPCR rappresentativi per un esperimento 3C. Abbondanza relativa dei set di primer per test 3C. (A) Grafico di controllo che mostra l'abbondanza relativa del prodotto nel campione di controllo non digerito (blu), di controllo digerito (grigio) e 3C (arancione). (B) L'esperimento 3C; l'abbondanza relativa del prodotto da combinazioni di primer di prova nel controllo non digerito (blu), controllo digerito (grigio) e campione 3C (arancione). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg"> Figura 5: Visualizzazione dei prodotti 3C qPCR. In alto, gel con i prodotti endpoint qPCR con i campioni indicati. In basso, file di traccia della sequenza Sanger rappresentativi per le reazioni indicate. Il campione arancione è un esempio di falso positivo (vedi Figura 4, r38/34), e il campione blu è un esempio di un vero positivo con il sito DpnII indicato sopra la traccia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Sito</td>
			<td>% digestione</td>
		</tr><tr><td>R8 ·</td>
			<td>86.98</td>
		</tr><tr><td>R3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr><tr><td>R38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr><tr><td>R34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr><tr><td>R33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr><tr><td>R14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr><tr><td>R47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Efficienza di digestione calcolata.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome</td>
			<td colspan="3">Sequenza</td>
			<td>Loci genomici</td>
		</tr><tr><td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr><tr><td>R3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr><tr><td>r38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr><tr><td>R38 RVS</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr><tr><td>r34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr><tr><td>R34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr><tr><td>r33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr><tr><td>R33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr><tr><td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr><tr><td>r14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr><tr><td>r47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr><tr><td>r47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr><tr><td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr><tr><td>R8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr><tr><td>Primer di controllo FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr><tr><td>Primer di controllo RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCAACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Primer per l'esperimento rappresentativo 3C.

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Qui, presentiamo un adattamento della tecnica di cattura della conformazione cromosomica (3C) in dettaglio con particolare attenzione al coinvolgimento e all'apprendimento universitario.

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

La nostra ricerca mira a scoprire come l'organizzazione della cromatina controlla l'espressione genica. L'attenzione si concentra sulla determinazione di quali fattori regolano la cromatina a livello genico per controllare l'attività genica. Attualmente, tecnologie simili alla cattura di conferma cromosomica, o 3C, vengono utilizzate per fare progressi in questo campo.Gli investimenti nelle tecnologie di raccolta e sequenziamento dei campioni ci hanno spinto a ciò che le tecniche 3C possono mostrarci. La più grande sfida sperimentale attualmente è la raccolta di campioni con un'architettura cromatinica uniforme. L'eterogeneità nei campioni porta a risultati confusi.In futuro, ci concentreremo su come i cambiamenti nell'organizzazione della cromatina svolgono un ruolo nel cancro.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

2.1K Views.  Bryant University. La nostra ricerca mira a scoprire come l'organizzazione della cromatina controlla l'espressione genica. L'attenzione si concentra sulla determinazione di quali fattori regolano la cromatina a livello genico per controllare l'attività genica. Attualmente, tecnologie simili alla cattura di conferma cromosomica, o 3C, vengono utilizzate per fare progressi in questo campo.Gli investimenti nelle tecnologie di raccolta e sequenziamento dei campioni ci hanno spinto a ciò che le tecniche 3C ...

Video: Autore in primo piano: Ottenere una A con le 3C: Acquisizione della conformazione cromosomica per gli studenti universitari  

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C techniques) that provide detailed information of the three-dimensional organization of chromatin. The 3C techniques have been used in a wide range of studies, from monitoring the changes in chromatin organization in cancer cells to identifying enhancer contacts made with gene promoters. While many of the studies using these techniques are asking big genome-wide questions with intricate sample types (i.e., single-cell analysis), what is often lost is that the 3C techniques are grounded in basic molecular biology methods that are applicable to a broad range of studies. By addressing tightly focused questions of chromatin organization, this cutting-edge technique can be used to enhance the undergraduate research and teaching lab experience. This paper presents a 3C protocol and provides adaptations and points of emphasis for implementation at primarily undergraduate institutions in undergraduate research and teaching experiences.

Here, we present an adaption of the chromosome conformation capture (3C) technique in detail with an emphasis on undergraduate involvement and learning.

Ricerca

Genetica

Generation and Purification of Chromosome Conformation Capture (3C) Library

On day one after chromatin cross-linking and nuclei collection from 5, 000 young adult Caenorhabditis Elegans worms, transfer the nuclei pellet re-suspended in 450 microliters of clean water to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube. Then add 60 microliters of 10X DPN2 restriction enzyme buffer to it and mix well. Incubate the samples with 15 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate at 37 degrees Celsius for one hour with agitation.Quench the reaction by adding 75 microliters of 20%triton X 100 and incubating as demonstrated previously. Aliquot 10 microliters from the sample, as the undigested control, and store it at four degrees Celsius. After adding 400 units of DPN 2 to the rest of the sample, incubate it overnight at 37 degrees Celsius with agitation for chromatin digestion.On day two, add an additional 200 units of DPN 2 to the sample. To complete the digestion of the cross-linked sample, incubate it at 37 degrees Celsius with agitation for four hours. Heat inactivate the restriction enzyme by incubating the sample for 20 minutes at 65 degrees Celsius.If the enzyme cannot be inactivated by heat, add 80 microliters of 10%sodium dodecyl sulfate and incubate. Then, add 375 microliters of 20%Triton X 100 to the sample and mix by swirling. Keep aside a 10 microliter aliquot from the sample as the digestion control.For chromatin ligation, transfer the sample to a clean 50 milliliter conical tube. Adjust the sample volume to 5.7 milliliters with molecular grade water and mix by swirling. Then, add 700 microliters of 10 X T4 ligase buffer, followed by 60 units of T4 DNA ligase, and incubate the sample overnight at 16 degrees Celsius.On day three, proceed with protein digestion and reverse cross-linking. Add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter Proteinase K to the 3C sample and incubate at 65 degrees Celsius overnight with agitation. To begin purification of the 3C library on day four, add 30 microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A to the sample and mix by swirling.After incubation, add seven milliliters of phenyl chloroform to the samples and mix by shaking. Centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G and room temperature. Collect and transfer the aqueous phase to a clean 50 milliliter conical tube.Add equal volumes of chloroform and mix the sample by shaking. After centrifuging the sample again as demonstrated, transfer the aqueous phase to another clean 50 milliliter conical tube. Add 7.5 milliliters of molecular grade water, 35 milliliters of 100%ethanol and seven microliters of one milligram per milliliter Glycogen.Freeze the properly mixed sample at minus 80 degrees Celsius. While the sample freezes, begin purifying the control samples by adjusting the volume of the controls to 500 microliters using molecular grade water. Add two microliters of 10 milligrams per milliliter RNase A and mix by flicking the tube.Next, add one milliliter of phenyl chloroform to the tubes containing the controls and mix by shaking. Centrifuge the tubes. After transferring the aqueous phase to a clean 1.5 milliliter micro centrifuge tube, add equal volumes of chloroform.Centrifuge as previously demonstrated before collecting the aqueous phase. To the collected aqueous phase, add one milliliter of ethanol and two microliters of one milligram per milliliter glycogen. After mixing the sample by shaking, incubate it at minus 80 degrees Celsius for 30 minutes.Next, centrifuge the sample for 15 minutes at 3, 270 G at four degrees Celsius. After removing the supernatant, add 750 microliters of chilled 70%ethanol and centrifuge. Re-suspend the air dried pellet in 50 microliters of molecular grade water.The suspension can be frozen here if not proceeding further immediately. To continue with the 3C sample purification, remove the sample from the freezer and centrifuge at 3, 270 G for 30 minutes. Add 10 milliliters of chilled 70%ethanol and break up the DNA pellet.After centrifuging and removing the supernatant, partially air dry the sample at room temperature. Re suspend the pellet in 150 microliters of 10 millimolar tris HCL at pH 7.5 by pipetting up and down to obtain the purified 3C library. QPCR performed on the one experimental and two control 3C samples helped generate the digestion efficiency data.The 3C sample had an approximately 88%digestion efficiency across the seven genomic loci tested.

Libreria di Generazione e Purificazione della Cattura della Conformazione Cromosomica (3C)

Identification of the Chromosome Conformation Capture (3C) Products

Take the chromosome confirmation capture or 3C sample and controls, and perform QPCR. Excise the product bands corresponding to the expected fragment size. To perform gel extraction of the PCR products, use a commercial kit or follow the homemade protocol.For the latter, construct a homemade purification cartridge by poking a hole in the bottom of a 0.5 milliliter tube with a needle. Pack a small amount of cotton into the bottom of the tube with the hole, filling no more than half of the tube. Place the tube into a 1.5 milliliter tube, ensuring that the smaller tube rests on the lip of the bigger tube, and not in the tube.Carefully cut the gel fragment into smaller pieces, and place it in the small tube of the cartridge. Place the assembly in a minus 20 degrees Celsius freezer for five minutes. Then, spin the assembly for three minutes at 13, 000 G and room temperature.Discard the small tube containing the agoros debris, and keep the 1.5 milliliter tube with the extracted DNA in the buffer. The samples were tested for the presence of long range chromatin contacts between the different genomic loci, using combinations of loci-specific primers and QPCR. The product abundance is relative to a control primer set were calculated and graft for comparison.The data indicated that 8 of the 10 reactions were conditional positives. Gel purification and sequencing of the expected PCR product for the eight conditional positives and one negative reaction were gel purified and sequenced. The results for representative positive and negative reactions are shown.