Bu çalışma, Friedrich-Alexander Üniversitesi Erlangen-Nürnberg Disiplinlerarası Klinik Araştırma Merkezi (IZKF) tarafından Janina Müller-Deile'ye verilen M4-IZKF-F009 hibe numarası ve Janina Müller-Deile'ye verilen 01GM2202D hibe numarası ile STOP-FSGS-Speed Translation-Oriented Progress to Treat FSGS proje adı altında Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) tarafından finanse edilmiştir. Annalena Kraus'a SEM görüntülerinin çekilmesindeki desteği için teşekkür ederiz.

Hastadan Elde Edilen Podositleri Oluşturmak için Deri Biyopsilerinin Kullanılması

<ol>
	<li>Mundel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rearrangements+of+the+cytoskeleton+and+cell+contacts+induce+process+formation+during+differentiation+of+conditionally+immortalized+mouse+podocyte+cell+lines.">Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines.</a> Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).</li><li>Grgic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+of+podocyte+foot+processes+by+fluorescence+microscopy.">Imaging of podocyte foot processes by fluorescence microscopy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 785-791 (2012).</li><li>Grahammer, F., Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+podocyte+slit+diaphragm-from+a+thin+grey+line+to+a+complex+signalling+hub.">The podocyte slit diaphragm-from a thin grey line to a complex signalling hub.</a> Nature Reviews Nephrology. 9 (10), 587-598 (2013).</li><li>Deen, W. M., Lazzara, M. J., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+glomerular+permeability.">Structural determinants of glomerular permeability.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 281 (4), F579-F596 (2001).</li><li>Schell, C., Huber, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolving+complexity+of+the+podocyte+cytoskeleton.">The evolving complexity of the podocyte cytoskeleton.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (11), 3166-3174 (2017).</li><li>Muller-Deile, J., Schiffer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+directed+therapy+of+nephrotic+syndrome-can+we+bring+the+inside+out.">Podocyte directed therapy of nephrotic syndrome-can we bring the inside out.</a> Pediatric Nephrology. 31 (3), 393-405 (2016).</li><li>Boehlke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hantavirus+infection+with+severe+proteinuria+and+podocyte+foot-process+effacement.">Hantavirus infection with severe proteinuria and podocyte foot-process effacement.</a> American Journal of Kidney Diseases. 64 (3), 452-456 (2014).</li><li>Schiffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+targeting+of+actin-dependent+dynamin+oligomerization+ameliorates+chronic+kidney+disease+in+diverse+animal+models.">Pharmacological targeting of actin-dependent dynamin oligomerization ameliorates chronic kidney disease in diverse animal models.</a> Nature Medicine. 21 (6), 601-609 (2015).</li><li>Kopp, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytopathies.">Podocytopathies.</a> Nature Reviews. Disease Primers. 6 (1), 68 (2020).</li><li>Wiggins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+podocytopathies:+a+unifying+view+of+glomerular+diseases.">The spectrum of podocytopathies: a unifying view of glomerular diseases.</a> Kidney International. 71 (12), 1205-1214 (2007).</li><li>Mundel, P., Reiser, J., Kriz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+differentiation+in+cultured+rat+and+human+podocytes.">Induction of differentiation in cultured rat and human podocytes.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 8 (5), 697-705 (1997).</li><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+derivation+of+conditionally+immortal+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse.">Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (12), 5096-5100 (1991).</li><li>Saleem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+line+demonstrating+nephrin+and+podocin+expression.">A conditionally immortalized human podocyte cell line demonstrating nephrin and podocin expression.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (3), 630-638 (2002).</li><li>Eto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+protection+by+darbepoetin:+preservation+of+the+cytoskeleton+and+nephrin+expression.">Podocyte protection by darbepoetin: preservation of the cytoskeleton and nephrin expression.</a> Kidney International. 72 (4), 455-463 (2007).</li><li>Krtil, J., Platenik, J., Kazderova, M., Tesar, V., Zima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+methods+of+glomerular+podocytes.">Culture methods of glomerular podocytes.</a> Kidney &amp; Blood Pressure Research. 30 (3), 162-174 (2007).</li><li>Chittiprol, S., Chen, P., Petrovic-Djergovic, D., Eichler, T., Ransom, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker+expression,+behaviors,+and+responses+vary+in+different+lines+of+conditionally+immortalized+cultured+podocytes.">Marker expression, behaviors, and responses vary in different lines of conditionally immortalized cultured podocytes.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 301 (3), F660-F671 (2011).</li><li>Shih, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD2AP+localizes+to+the+slit+diaphragm+and+binds+to+nephrin+via+a+novel+C-terminal+domain.">CD2AP localizes to the slit diaphragm and binds to nephrin via a novel C-terminal domain.</a> The American Journal of Pathology. 159 (6), 2303-2308 (2001).</li><li>Yan, K., Khoshnoodi, J., Ruotsalainen, V., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-linked+glycosylation+is+critical+for+the+plasma+membrane+localization+of+nephrin.">N-linked glycosylation is critical for the plasma membrane localization of nephrin.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 13 (5), 1385-1389 (2002).</li><li>Sir Elkhatim, R., Li, J. Y., Yong, T. Y., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipping+your+feet+in+the+water:+podocytes+in+urine.">Dipping your feet in the water: podocytes in urine.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (4), 423-437 (2014).</li><li>Camici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+detection+of+podocyte+injury.">Urinary detection of podocyte injury.</a> Biomedicine &amp; Pharmacotherapy. 61 (5), 245-249 (2007).</li><li>Muller-Deile, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+preeclampsia+induced+microRNA-26a-5p+leads+to+proteinuria+in+zebrafish.">Overexpression of preeclampsia induced microRNA-26a-5p leads to proteinuria in zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 3621 (2018).</li><li>Schenk, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+focal+segmental+glomerulosclerosis+(FSGS)+factor+suPAR+using+CytoSorb.">Removal of focal segmental glomerulosclerosis (FSGS) factor suPAR using CytoSorb.</a> Journal of Clinical Apheresis. 32 (6), 444-452 (2017).</li><li>Petermann, A., Floege, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocyte+damage+resulting+in+podocyturia:+a+potential+diagnostic+marker+to+assess+glomerular+disease+activity.">Podocyte damage resulting in podocyturia: a potential diagnostic marker to assess glomerular disease activity.</a> Nephron. Clinical Practice. 106 (2), c61-c66 (2007).</li><li>Vogelmann, S. U., Nelson, W. J., Myers, B. D., Lemley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urinary+excretion+of+viable+podocytes+in+health+and+renal+disease.">Urinary excretion of viable podocytes in health and renal disease.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 285 (1), F40-F48 (2003).</li><li>Petermann, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytes+that+detach+in+experimental+membranous+nephropathy+are+viable.">Podocytes that detach in experimental membranous nephropathy are viable.</a> Kidney International. 64 (4), 1222-1231 (2003).</li><li>Sakairi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditionally+immortalized+human+podocyte+cell+lines+established+from+urine.">Conditionally immortalized human podocyte cell lines established from urine.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 298 (3), F557-F567 (2010).</li><li>Rauch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+iPSCs+into+functional+podocytes.">Differentiation of human iPSCs into functional podocytes.</a> PLoS One. 13 (9), e0203869 (2018).</li><li>Musah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+induced-pluripotent-stem-cell-derived+human+podocytes+reconstitute+kidney+glomerular-capillary-wall+function+on+a+chip.">Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).</li><li>Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+fibroblast+cultures.">Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).</li><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Teshigawara, R., Cho, J., Kameda, M., Tada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+human+somatic+reprogramming+to+iPS+cell.">Mechanism of human somatic reprogramming to iPS cell.</a> Laboratory Investigation. 97 (10), 1152-1157 (2017).</li><li>Bang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+episomal+reprogramming+for+generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+fibroblasts.">Optimization of episomal reprogramming for generation of human induced pluripotent stem cells from fibroblasts.</a> Animal Cells and Systems. 22 (2), 132-139 (2018).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip.">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li><li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions.">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299 (2020).</li><li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts.">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e3779 (2013).</li><li>Hoffding, M. K., Hyttel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+visualization+of+the+Mesenchymal-to-Epithelial+Transition+during+reprogramming+of+human+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells.">Ultrastructural visualization of the Mesenchymal-to-Epithelial Transition during reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research. 14 (1), 39-53 (2015).</li><li>Bharathan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+markers+used+for+the+identification+of+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Systematic evaluation of markers used for the identification of human induced pluripotent stem cells.</a> Biology Open. 6 (1), 100-108 (2017).</li><li>Scholzen, T., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ki-67+protein:+from+the+known+and+the+unknown.">The Ki-67 protein: from the known and the unknown.</a> Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).</li><li>Sun, X., Kaufman, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ki-67:+more+than+a+proliferation+marker.">Ki-67: more than a proliferation marker.</a> Chromosoma. 127 (2), 175-186 (2018).</li><li>Vaz, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+after+induced+pluripotent+stem+cells+reprogramming.">Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming.</a> Genetics and Molecular Biology. 44 (3), 20200147 (2021).</li><li>Reiser, J., Altintas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Podocytes.">Podocytes.</a> F1000Research. 5, 114 (2016).</li><li>Ohmori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+NEPHRIN+localization+in+kidney+organoids+derived+from+nephrotic+patient+iPS+cells.">Impaired NEPHRIN localization in kidney organoids derived from nephrotic patient iPS cells.</a> Scientific Reports. 11 (1), 3982 (2021).</li><li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Bu hücre kültürü tabanlı protokol, insan dermal fibroblastlarının hastaya özgü hiPSC'lere epizomal yeniden programlanmasını ve daha sonra hiPSC türevli podositlere farklılaşmasını birleştirir. Bu, podosit hasarı ile ilgili genetik glomerüler hastalığı olan hastalardan podositlerin mutasyona bağlı değişikliklerini incelememizi sağlar. Dermal fibroblastları elektroporasyon yoluyla entegrasyonsuz bir yöntemle yeniden programlama protokolü, Bang ve ark.32 ve Okita ve ark.33'ün yayınlanmış çalışmalarından uyarlanmıştır. Podositleri hiPSC'lerden ayırma protokolü, Musah ve ark.28,34,35'in yayınlanan protokolünden uyarlanmıştır. HiPSC'lerdenpodosit üretimini açıklayan yayınlar zaten mevcuttur 27,34,35. Bununla birlikte, burada sağlanan protokol, hiPSC'lerin podositlere farklılaşması konusunda optimize edilmiş ve daha ucuzdur. Musah ve ark.'nın yayınladığı protokolle karşılaştırıldığında, bu protokolü vitronektin, laminin ipek-511 ve çözünür bazal membran matrisi gibi farklı kaplama reaktifleri üzerinde test ettik. Vitronektin ve laminin silk-511 konsantrasyonları 5 μg / mL 28,34,35 yerine 2,5 μg / mL'ye düşürülebilir. Ayrıca, BMP7 ve aktivin A-iki çok pahalı büyüme faktörü konsantrasyonlarını-% 50 oranında, 100 ng / mL'den 50 ng / mL'ye düşürmek mümkün olmuştur.
Bu, daha ucuz farklılaşma sağlar. 7. günden itibaren nefron progenitör hücreleri hala çoğalıyordu ve donma olasılığı daha önce gösterilmişti. Bu hücreleri çözüldükten sonra ve Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) ve B27'yi içeren bazik ortamda son farklılaşmadan önce birkaç gün boyunca genişlettik ve maliyetleri daha da düşürdük. Farklılaşma adımlarına ek olarak, bu protokol fibroblastların deri biyopsilerinden sonraki nesil hastaya özgü hiPSC'lerle epizomal yeniden programlama yoluyla büyümesini tanımlar. Bu iki yöntemin kombinasyonu hastaya özgü podositlerin üretilmesini sağlar. Bu nedenle, hastaya özgü hiPSC türevli podositler üretmek için daha önce bu kadar ayrıntılı olarak tanımlanmamış eksiksiz bir adım adım protokol burada sağlanmıştır.
Genel protokol birkaç farklı hücre tipi içerdiğinden, üretilen hücre tiplerini farklı adımlarda karakterize etmek çok önemlidir. Hücreler uzun süre kültürdedir, bu nedenle kalite kontrol farklı pasajlarda yapılmalıdır. HiPSC'lerle çalışırken, günlük beslenmenin yanı sıra hücre davranışı ve morfoloji izlemesi de gereklidir. Farklılaştırma ortamının sterilitesi, 0,2 μm'lik bir filtre aracılığıyla filtre sterilizasyonu ile sağlanmalıdır. Cilt biyopsisinden hiPSC türevi podositlere kadar tüm protokol birkaç ay sürer, ancak hücreleri işlemin farklı aşamalarında dondurmak mümkündür. Nefron progenitör farklılaşma ortamında 7 gün sonra fibroblastlar, seçilmiş hiPSC klonları ve proliferatif nefron progenitör hücreleri dondurulabilir ve çalışan bir hücre bankası oluşturulabilir.
HiPSC türevli sağlıklı podositler ayrı bir birincil ve sekonder ayak süreçleri ağı geliştirse de (Şekil 5A,B) ve tipik podosit spesifik belirteci eksprese etse de (Şekil 6A-C), in vivo olarak görüldüğü gibi karakteristik yarık diyaframların klasik iki boyutlu hücre kültürü modellerinde taklit edilmesi zordur. Dahası, diğer glomerüler hücre tipleriyle hücreler arası iletişim bu mono-kültür ortamında mümkün değildir.
Terminal farklılaşmış durumları ve proliferasyon kapasitesinin olmaması nedeniyle, podositleri ex vivo olarak incelemek zordur. Koşullu olarak ölümsüzleştirilen birincil podositlerin yardımıyla, ısıya duyarlı bir anahtarın yerleştirilmesiyle bu sınırlamanın üstesinden gelmek mümkündür, bu da hücrelerin 33 ° C'de çoğaldığı ve 37 ° C'de farklılaştığı bir hücre kültürü modeli ile sonuçlanır13,14. Bu siPodositler podosit araştırması için yüksek potansiyele sahip olsalar da, belirteç ekspresyonunun eksikliği, farklılaşmamış morfoloji ve ayak süreçlerinin oluşturulamaması gibi sınırlamalar vardır15,16.
Podositlerin hasta kaynaklı somatik hücrelerden farklılaşması, hastalıklı podositlerin ex vivo sağlıklı kontrol hücreleri ile üretilmesini ve karşılaştırılmasını sağlar. Bu, podosit spesifik genlerdeki mutasyonlara bağlı podosit hasarını incelememizi sağlar. Ayrıca, hiPSC'lerle çalışmak, üç boyutlu hücre kültürü hastalık modelleri, daha doğrusu organoidler43,44 oluşturma potansiyeline sahiptir. HiPSC türevli podositlerin glomerüler endotel hücreleri veya mezangial hücreler gibi diğer glomerüler hücrelerle birlikte kültürlenmesi, sağlık ve glomerüler hastalıkta hücreler arası iletişim konusunda yeni anlayışlara yol açabilir.
Ayrıca, hastaya özgü podositlerin karakterizasyonu ve tedavisi yüksek verim analizinde ex vivo olarak gerçekleştirilebilir. Bireyselleştirilmiş yaklaşım, spesifik mutasyonlar için yeni terapötik hedefleri araştırma ve gelecekte bireyselleştirilmiş tıp yapma fırsatı sunmaktadır.

Podositler, glomerüler bazal membran (GBM), glomerüler endotel hücreleri ve glikokaliks ile birlikte böbreğin glomerüler filtrasyon bariyerini oluşturan özelleşmiş, post-mitotik renal epitel hücreleridir. Fenotipik olarak, podositler bir hücre gövdesi ve birincil, mikrotübül tahrikli membran uzantılarının yanı sıra ayak işlemleri 1,2 adı verilen ikincil uzantılardan oluşur. İdrarı kandan filtreleyen glomerüler filtrasyon bariyeri, fenestrated endotel, GBM ve podoktyes3'ün yarık diyaframı olarak adlandırılan komşu podosit ayak süreçlerini birbirine bağlayan özel bir hücreler arası kavşak türünden yapılmıştır. Sağlıklı koşullar altında, albüminden daha büyük proteinler, büyüklükleri ve yükleri4 nedeniyle filtrasyon bariyerinden tutulur.
Sitoiskelet veya podosit spesifik genlerdeki mutasyonların yanı sıra podosit sinyal yollarını etkileyen dolaşım faktörlerinin, podosit effacement, dekolmanı veya apoptozu indüklediği ve proteinüri ve glomerüler skleroz ile sonuçlandığı bilinmektedir. Özellikle, sitoiskeletin yeniden düzenlenmesi, podosit polaritesindeki değişiklikler veya yarık kavşakların kaybı ile ilişkili ayak süreçlerinin hasarı çok önemlidir5. Ölümcül olarak farklılaşmış durumları nedeniyle, podositler GBM'nin ayrılmasından sonra zorlukla değiştirilebilir. Bununla birlikte, podositler GBM'ye bağlanırsa, yine de efffacement'tan kurtulabilir veayak süreçlerini 6,7,8 ile değiştirebilirler. Çeşitli glomerüler bozukluklarda podosit hasarına yol açan olayların daha iyi anlaşılması, bu hastalıklar için tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olacak yeni terapötik hedefler sağlayabilir. Podosit hasarı, fokal segmental glomerüloskleroz (FSGS), diyabetik nefropati, minimal değişiklik hastalığı ve membranöz glomerülonefropati gibi farklı glomerüler hastalıkların ayırt edici özelliğidir ve bu hastalıkların patolojik mekanizmalarını ve potansiyel tedavi yaklaşımlarını incelemek için güvenilir podosit ex vivo modelleri gerektirir 9,10. Podositler, diferansiyel eleme ile glomerüllerin izolasyonuna dayanan klasik primer hücre kültürü ile ex vivo olarak incelenebilir11. Bununla birlikte, sınırlı proliferasyon kapasitesine sahip terminal olarak farklılaşmış durum nedeniyle, çoğu araştırmacı SV40 büyük T antijeninin sıcaklığa duyarlı varyantlarını eksprese eden fare veya insan siPodosit hücre hatlarını kullanır. Alternatif olarak, siPodositler, SV40 Tag ölümsüzleştirici gen 1,12'yi barındıran transgenik farelerden izole edilir.
SiPodositler 33 ° C'de çoğalır, ancak büyüme durmasına girer ve 37 ° C'de farklılaşmaya başlar13,14. Bu hücrelerle elde edilen deneysel verilerin, hücreler doğal olmayan bir gen yerleştirme15 kullanılarak üretildiğinden, belirli bir dikkatle yorumlanması gerektiği unutulmamalıdır. Bu hücreler ölümsüzleştirici bir gen barındırdığından, devam eden proliferasyon nedeniyle hücresel fizyoloji değişir12. Bu yaklaşımla üretilen podosit hücre hatları son zamanlarda sorgulanmıştır, çünkü fare, insan ve sıçan siPodositleri, protein düzeyinde sinaptopodin ve nefrinin% 5'inden azını, ayrıca glomerüler ekspresyon16'ya kıyasla mRNA seviyesinde NPHS1 ve NPHS2'yi ifade etmektedir. Dahası, çoğu podosit hücre çizgisi nefrin17,18 eksprese etmez. Chittiprol ve ark. ayrıca siPodositlerde hücre motilitesinde ve puromisin ve doksorubisin yanıtlarında anlamlı bir fark tanımlamışlardır16. Podositler, farklı glomerüler hastalıklarda GBM'den ayrıldıktan sonra idrarda bulunabilir 19,20,21,22. Canlı üriner podositler 2-3 haftaya kadar ex vivo olarak yetiştirilebilir, ancak çoğu hücre apoptoz23,24'e maruz kalır. İlginçtir ki, podositler sadece glomerüler hastalığı olan hastaların idrarında değil, aynı zamanda sağlıklı deneklerin idrarında, büyük olasılıkla yaşlandıklarında da bulunur - yine kültür24'te sınırlı bir replikasyon potansiyeline sahiptir. Ayrıca, idrar kaynaklı podosit sayısı sınırlıdır ve hücreler kültürde farklılaşır, daha az ayak süreci gösterir, morfolojiyi değiştirir ve en önemlisi sınırlı proliferasyon kapasitesine sahiptir. Podosit spesifik genlerin ekspresyonu yoktur, birkaç hafta içinde kaybolur veya bu hücre klonları arasında değişir. Podosit spesifik belirteç için pozitif olan bazı hücreler, tübüler epitel hücrelerinin veya miyofibroblastların ve mezangial hücrelerin belirtecini birlikte eksprese ettiler, bu da kültürlü üriner podositlerin dediferansiyasyonunu ve / veya transdiferansiyasyonunu düşündürmektedir24,25.
Son zamanlarda, hastaların ve sağlıklı gönüllülerin idrarından elde edilen siPodosit hücre hatlarının ısıya duyarlı SV40 büyük T antijeni ve hTERT ile transdüksiyon yoluyla üretilmesi tanımlanmıştır26. Sinaptopodin, nestin ve CD2 ile ilişkili protein için mRNA ekspresyonu tespit edildi, ancak podosin mRNA tüm klonlarda yoktu. İdrar podositleri ile ilgili sorunlara ek olarak, bu hücreler aynı zamanda yerleştirilen ölümsüzleştirici geni de içerir ve bu da yukarıda tartışılan dezavantajlara neden olur.
Buna karşılık, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC'ler), uygun koşullar altında kendini yenilemek ve çoklu hücre tiplerine farklılaşmak için büyük bir kapasiteye sahiptir. HiPSC'lerin neredeyse sınırsız bir podosit kaynağı olarak hizmet edebileceği daha önce gösterilmiştir27,28.
Burada, deri punch biyopsilerinin dermal fibroblastlarından hastaya özgü podositler üretmek için iki aşamalı bir protokol, daha sonra hiPSC'lere epizomal yeniden programlama ve hiPSC türevi podositlere son bir farklılaşma açıklanmaktadır (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg"> Şekil 1: Hastaya özgü hiPSC türevi podositler üretmek için protokol. Bir deri biyopsisinin dermal fibroblastlarından hastaya özgü podositler üretmek için protokole grafiksel genel bakış, hiPSC'lere yeniden programlanarak ve podositlere farklılaşarak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
İlk adım olarak, somatik dermal fibroblastlar deri punch biyopsisinden büyütüldü ve OCT3/4, KLF4, SOX2 ve c-MYC29,30,31 transkripsiyon faktörlerini eksprese eden plazmidlerle elektroporasyon yoluyla entegrasyonsuz bir yöntem kullanılarak hiPSC'lere yeniden programlandı. Ortaya çıkan hiPSC kolonileri daha sonra seçildi ve genişletildi. Farklılaşma, WNT sinyal yolunun aktivasyonu ile mezodermal soyun indüksiyonu ile başladı, bunu hala çoğalabilen nefron progenitör hücrelerin oluşumu izledi. Son olarak, hücreler podositlere farklılaştırıldı. Bu prosedürde, Bang ve ark.32 ve Okita ve ark.33 tarafından hiPSC'lerin oluşturulması için epizomal yeniden programlama için daha önce yayınlanmış protokolleri ve ayrıca Musah ve ark.28,34,35 tarafından hiPSC'lerin podositlere farklılaştırılması için bir protokolü değiştirdik ve birleştirdik.
Gerçekten de, protokolümüz tarafından üretilen podositler, primer ve sekonder ayak süreçlerinin ayrı bir ağının gelişimi ve sinaptopodin, podosin ve nefrin gibi podositlere özgü belirteçlerin ekspresyonu ile ilgili olarak in vivo podositlere daha yakın bir fenotipe sahipti. HiPSC türevi podositlerin kullanımıyla, hastanın genetik arka planı yeniden programlama ve farklılaşma sırasında korunur. Bu, hastaya özgü podosit hastalığının modellenmesini ve potansiyel terapötik maddelerin ex vivo olarak neredeyse sınırsız sayıda hücre sayısında keşfedilmesini sağlar. Dahası, bu protokol minimal invaziv, uygun maliyetli, etik olarak kabul edilebilir ve ilaç geliştirme için yeni yollar kolaylaştırabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m sterile filter</td>
			<td>Rotilab</td>
			<td>P668.1</td>
			<td>for sterilization of differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>all-trans retinoic acid</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72262</td>
			<td>supplement for differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement (50 x), serum free</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>supplement for serum-free differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG iMatrix-511 Silk</td>
			<td>biogems</td>
			<td>RL511S</td>
			<td>additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELLSTAR Filter Cap Cell Culture Flasks, T75, 250 mL</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>82050-856</td>
			<td>cell culture plastics suitable for fibroblast culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021 (5 mg)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252917-06-9&#160;</td>
			<td>supplement for differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel hESC qualified matrix&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354277</td>
			<td>additional option of extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture (solubilized basement membrane matrix)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td>to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>countess II FL&#160; Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryoPure tubes, 2 ml, QuickSeal screw cap, white</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72380</td>
			<td>cryovials for freezing of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A994.1</td>
			<td>for fibroblast freezing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (1:1) (1 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320074</td>
			<td>basic medium for differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 + Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565018</td>
			<td>basic medium for fibroblast medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS M5000 Imaging System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMF5000</td>
			<td>phase contrast microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum premium, inactivated (FCS)</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P301902</td>
			<td>serum for fibroblast medium, fibroblast freezing medium and podocyte maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fisherbrand Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm gap, 800 &#181;L capacity, sterile</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB104</td>
			<td>cuvette used for electroporation/episomal reprogramming of fibroblasts (4mm gap)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluoromount-G Mounting Medium, with DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4959-52</td>
			<td>mounting medium containing dapi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gauge needle (0.6 x 30 mm)</td>
			<td>BD Microlance3</td>
			<td>300700</td>
			<td>for separation of hiPSC colonies into small pieces</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human Recombinant Activin A Protein</td>
			<td>78001.1</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td>supplement for differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human recombinant bone morphogenetic protein 7 (BMP7)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>120-03P</td>
			<td>supplement for differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>human VEGF-165 Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PHC9394</td>
			<td>supplement for differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>insulin-transferrin-selenium (ITS -G) (100 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41400045</td>
			<td>supplement for podocyte maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X964.1</td>
			<td>for sterility test of hiPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lookOut Mycoplasma PCR Detection Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MP0035-1KT</td>
			<td>commercial mycoplasma detection kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>Diagonal GmbH &#38; Co.KG</td>
			<td>21,102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtube 1.5 mL&#160;</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72706400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1 Complete Kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>basic medium for serum-free hiPSC culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nalgene freezing container Mr.Frosty</td>
			<td>Roth</td>
			<td>AC96.1&#160;</td>
			<td>to ensure optimal freezing conditions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>normal goat serum</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab 7481</td>
			<td>for preincubation solution and antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nunc 24 well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142485</td>
			<td>cell culture plastics suitable for hiPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nunc 48 well plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>152640</td>
			<td>cell culture plastics suitable for hiPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nunc 6 well plates&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140685</td>
			<td>cell culture plastics suitable for hiPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nunc EasYDish Dishes 100 mm</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150466</td>
			<td>cell culture plastics suitable for hiPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>cell culture plastics suitable for hiPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nutriFreez D10 Cryopreservation Medium</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>05-713-1E&#160;</td>
			<td>serum-free cryopreservation medium for cryopreservation of hiPSC and nephron progenitor cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058021</td>
			<td>electroporation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hMLN</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#27079</td>
			<td>plasmid for episomal reprogramming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hOCT3/4 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#27077</td>
			<td>plasmid for episomal reprogramming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCXLE-hSK plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#27078</td>
			<td>plasmid for episomal reprogramming</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>to avoid bacterial contamination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic coverslips</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>&#160; 83.1840.002</td>
			<td>for immunofluorescent stainings of hiPSCs and hiPSC-derived podocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROTI Histofix</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P087.3</td>
			<td>commercial paraformaldehyde (4 %) for fixation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 + L-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875034</td>
			<td>basic medium for podocyte maintenance medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>staining chamber StainTray Black lid</td>
			<td>Roth</td>
			<td>HA51.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>enzymatic cell detachment solution used for dissociation of hiPSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile phosphate buffered saline (PBS) (1 x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190094</td>
			<td>used for washing and coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile water</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T1432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe without needle 20 mL</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>300629</td>
			<td>to filter sterilize differentiation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 100 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,33,902</td>
			<td>sterile cell culture plastics used for cutting the skin biopsy and fibroblast culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC dish 35 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>8,33,900</td>
			<td>sterile cell culture plastics used for outgrowing fibroblasts from skin biopsy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triton X 100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td>for preincubation solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypan Blue Stain (0.4 %) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td>to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA (10 x)&#160;</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>X0930-100</td>
			<td>dissociation reagent used for fibroblasts and nephron progenitor cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube 15 mL</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>188271-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube 50 mL</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vitronectin ACF</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>05-754-0002</td>
			<td>extracellular matrix reagent used in coating solution to coat cell culture plastics suitable for hiPSC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (10 mg)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td>to avoid apoptosis of hiPSCs during splitting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT4&#160;</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60093.1</td>
			<td>pluripotency marker, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSEA-4</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>60062FI.1</td>
			<td>pluripotency marker, dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>proliferation marker, dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>synaptopodin</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>21064-1-AP</td>
			<td>podocyte-specific marker, dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nephrin</td>
			<td>Progen</td>
			<td>GP-N2</td>
			<td>podocyte-specific marker, dilution 1:25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>podocin</td>
			<td>proteintech</td>
			<td>20384-1-AP</td>
			<td>podocyte-specific marker, dilution 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21435</td>
			<td>secondary anditbody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alexa Fluor 647 Goat Anti-Rabbit SFX Kit, highly cross-adsorbed</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A31634</td>
			<td>secondary anditbody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21206</td>
			<td>secondary anditbody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21422</td>
			<td>secondary anditbody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td>secondary anditbody, dilution 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of patient-derived podocytes from skin biopsies

Podositler, glomerüler filtrasyon bariyerinin idrar bölgesinde oturan ve glomerulusun seçici filtre fonksiyonuna katkıda bulunan epitel hücreleridir. Podosit spesifik genlerdeki mutasyonlar fokal segmental glomerüloskleroza (FSGS) neden olabilir ve podositler diğer birçok primer ve sekonder nefropatide de etkilenir. Farklılaşmış doğaları nedeniyle, birincil hücre kültürü modelleri podositler için sınırlıdır. Bu nedenle, yaygın olarak şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş hücreler kullanılır. Bununla birlikte, bu şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş podositlerin (siPodositler) birkaç sınırlaması vardır: hücreler, özellikle akıcılığa ulaştıklarında, kültürde farklılaşabilir ve birkaç podosit spesifik belirteç, ya sadece hafifçe ifade edilir ya da hiç ifade edilmez. Bu da siPodositlerin kullanımını ve fizyolojik, patofizyolojik ve klinik erişim için uygulanabilirliklerini sorgulamaktadır. Burada, dermal fibroblastların hiPSC'lere epizomal olarak yeniden programlanması ve ardından podositlere farklılaşması yoluyla deri punch biyopsisinden hastaya özgü podositler de dahil olmak üzere insan podositlerinin üretilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Bu podositler, ayak süreçlerinin gelişimi ve podosit spesifik belirtecin ekspresyonu gibi morfolojik özellikler açısından in vivo podositlere çok daha iyi benzemektedir. Son olarak, ancak daha da önemlisi, bu hücreler hastaların mutasyonlarını korur ve podosit hastalıklarını ve potansiyel terapötik maddeleri bireyselleştirilmiş bir yaklaşımla incelemek için geliştirilmiş bir ex vivo model ile sonuçlanır.

Podocytes are specialized, post-mitotic renal epithelial cells that form the glomerular filtration barrier of the kidney along with the glomerular basement membrane (GBM), glomerular endothelial cells, and glycocalyx. Phenotypically, podocytes consist of a cell body and primary, microtubule-driven membrane extensions, as well as secondary extensions called foot processes1,2. The glomerular filtration barrier that filters urine from the blood is built of fenestrated endothelium, GBM, and a specialized type of intercellular junction that connects neighboring podocyte foot processes, called the slit diaphragm of podoctyes3. Under healthy conditions, proteins larger than albumin are retained from the filtration barrier due to their size and charge4.
Mutations in cytoskeletal- or podocyte-specific genes, as well as circulating factors affecting podocyte signaling pathways, are known to induce podocyte effacement, detachment, or apoptosis, resulting in proteinuria and glomerular sclerosis. In particular, cytoskeletal rearrangement, changes in podocyte polarity or damage of foot processes with an associated loss of slit junctions are&#160;pivotal5. Due to their terminally differentiated status, podocytes can hardly be replaced after detachment of the GBM. However, if podocytes are attached to the GBM, they can still recover from effacement and reform interdigitating foot processes6,7,8. Further understanding of the events that lead to podocyte damage in various glomerular disorders may provide novel therapeutic targets that will aid in developing treatments for these diseases. Podocyte damage is a hallmark of different glomerular diseases, including focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), diabetic nephropathy, minimal change disease, and membranous glomerulonephropathy, requiring reliable podocyte ex vivo models to study the pathological mechanisms and potential treatment approaches for these diseases9,10. Podocytes can be studied ex vivo by classical primary cell culture based on the isolation of glomeruli by differential sieving11. However, due to the terminally differentiated state with limited proliferation capacity, most researchers use mouse or human ciPodocyte cell lines that express temperature-sensitive variants of the SV40 large T antigen. Alternatively, ciPodocytes are isolated from transgenic mice harboring the SV40 Tag immortalizing gene1,12.
CiPodocytes proliferate at 33 &#176;C, but enter growth arrest and start differentiating at 37 &#176;C13,14. It has to be kept in mind that experimental data obtained with these cells should be interpreted with certain caution, as the cells are generated using an unnatural gene insertion15. As these cells harbor an immortalizing gene, the cellular physiology is altered because of ongoing proliferation12. Podocyte cell lines generated by this approach have recently been questioned, as mouse, human, and rat ciPodocytes express less than 5% of synaptopodin and nephrin at the protein level, as well as NPHS1 and NPHS2 at the mRNA level&#160;compared to glomerular expression16. Moreover, most podocyte cell lines do not express nephrin17,18. Chittiprol et al. also described a significant difference in cell motility and responses to puromycin and doxorubicin in ciPodocytes16. Podocytes can be found in urine after detachment from the GBM in different glomerular diseases19,20,21,22. Viable urinary podocytes can be cultivated ex vivo for up to 2-3 weeks, but most cells undergo apoptosis23,24. Interestingly, podocytes are not only found in the urine of patients with glomerular disease but also in the urine of healthy subjects, most likely when they are senescent-again with a limited potential of replication in culture24. Furthermore, the urinary-derived podocyte number is limited, and the cells dedifferentiate in culture, show less foot processes, change morphology, and most importantly have limited proliferation capacity. The expression of podocyte-specific genes is absent, disappears within a few weeks, or varies among these cell clones. Some cells positive for the podocyte-specific marker co-expressed the marker of tubular epithelial cells or myofibroblasts and mesangial cells, which suggests dedifferentiation and/or transdifferentiation of the cultured urinary podocytes24,25.
Recently, the generation of ciPodocyte cell lines derived from the urine of patients and healthy volunteers by transduction with a thermo-sensitive SV40 large T antigen and hTERT has been described26. mRNA expression for synaptopodin, nestin, and CD2-associated&#160;protein was detected, but podocin mRNA was absent in all clones. In addition to the problems with urinary podocytes, these cells also contain the inserted immortalizing gene, resulting in the disadvantages discussed above.
In contrast, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have a huge capacity to self-renew and differentiate into multiple cell types under appropriate conditions. It has been shown before that hiPSCs can serve as an almost unlimited source of podocytes27,28.
Here, a two-step protocol to generate patient-specific podocytes from dermal fibroblasts of skin punch biopsies with subsequent episomal reprogramming into hiPSCs and a final differentiation into hiPSC-derived podocytes is described (Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig01.jpg" /> 
Figure 1: Protocol to generate patient-specific hiPSC-derived podocytes. Graphical overview of the protocol to generate patient-specific podocytes from dermal fibroblasts of a skin biopsy by reprogramming into hiPSCs and differentiation into podocytes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
As a first step, somatic dermal fibroblasts were outgrown from a skin punch biopsy and reprogrammed into hiPSCs using an integration-free method by electroporation with plasmids expressing the transcription factors OCT3/4, KLF4, SOX2, and c-MYC29,30,31. Arising hiPSC colonies were subsequently selected and expanded. Differentiation began with the induction of the mesodermal lineage by activation of the WNT signaling pathway, followed by the generation of nephron progenitor cells that were still able to proliferate. Finally, the cells were differentiated into podocytes. In this procedure, we modified and combined previously published protocols for episomal reprogramming for the generation of hiPSCs by Bang et al.32 and Okita et al.33, as well as a protocol for the differentiation of hiPSCs into podocytes by Musah et al.28,34,35.
Indeed, podocytes generated by our protocol had a phenotype closer to podocytes in vivo, regarding the development of a distinct network of primary and secondary foot processes and the expression of podocyte-specific markers, like synaptopodin, podocin, and nephrin. With the use of hiPSC-derived podocytes, the patient&#39;s genetic background is maintained during reprogramming and differentiation. This enables patient-specific podocyte disease modelling and the discovery of potential therapeutic substances ex vivo in an almost unlimited cell number. Moreover, this protocol is minimally invasive, cost-efficient, ethically acceptable and may facilitate new avenues for drug development.

Yazar Spotlight: Cilt Biyopsilerinden Hasta Kaynaklı Podosit Üretimi  

Cilt Biyopsilerinden Hasta Kaynaklı Podositlerin Üretimi

We describe a protocol for generating human podocytes by episomal reprogramming dermal fibroblasts into human-induced pluripotent stem cells. These cells resemble in vivo podocytes much better than immortalized podocytes in terms of podocyte food processes and expression of podocyte specific marker. Podocytes are terminally differentiated cells.Therefore, these cells no longer proliferate and primary podocyte analysis in cell culture is limited. Even though the problem of limited cell number was overcome by using conditionally immortalized podocytes, these podocytes present a dedifferentiated phenotype and behavior, which questions their use in basic research. With the help of induced pluripotent stem cells, podocytes can be generated in vitro in an almost unlimited cell number with typical podocyte morphology including distinct food processes and expression of podocyte specific marker.When using the patient-specific stem cells to differentiate into podocytes, it is possible to study the cell's disease-specific alterations ex vivo. In case, the initial skin biopsy was taken from a patient with a genetic podocyte disease. Podocytes generated with our protocol are personalized diseased cells carrying the patient's mutation.Thus, these cells represent an improved ex vivo model to study podocyte diseases and potential therapeutic substances in an individualized approach.

Epizomal yeniden programlama ve farklılaşmayı birleştiren bu adım adım protokolle, podositle ilgili bir gende hastanın mutasyonunu taşıyan podositler üretmek mümkündür. Bu, hastalığa özgü podosit değişikliklerinin ex vivo analizini sağlar. Hastanın genetik arka planı, tüm farklı hücre aşamalarında protokol sırasında korunur. Ek olarak, terminal olarak farklılaşmış proliferasyon yapmayan podositlerin yetersiz hücre sayısı sınırlaması, hiPSC türevi podositler kullanılarak aşılabilir. HiPSC-podositlerin, hiPSC'lere yeniden programlama ve ardından podositlere farklılaşma yoluyla büyümüş dermal fibroblastlardan üretilmesi birkaç ay sürse de, protokolün üç farklı adımında hücreleri dondurmak mümkündür (Şekil 2). Fibroblastlar, hiPSC'ler ve nefron progenitör hücreleri için nefron progenitör diferansiyasyon ortamında 7 gün boyunca farklılaştıktan sonra donma mümkündür. Bu nedenle, çalışan hücre bankalarının ve büyük ölçekli deneylerin oluşturulması mümkündür.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig02.jpg"> Şekil 2: Bir faz kontrast mikroskobu ile protokolün bireysel adımları. (A) Büyümüş dermal fibroblastlar. (B) Yeniden programlamadan sonra hiPSC koloni oluşumu. (C) Seçilmiş hiPSC kültürü. (D) 2 günlük farklılaşmadan sonra mezoderm hücreleri. (E) Nefron progenitör farklılaşma ortamında 14 günlük farklılaşmadan sonra nefron progenitör hücreleri. (F) Terminal farklılaştırılmış hiPSC türevi podositler. Ölçek çubukları 300 μm (A,B,D-F) ve 150 μm'yi (C) temsil eder. Kar tanesi olası donma adımlarını vurgular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Üretilen hiPSC türevli podositler, hücre tipi ve morfolojisi ile ilgili ciddi değişiklikler içeren uzun bir protokolden geçtiğinden, hücre karakterizasyonu zorunludur. Boyut ve hücre şekli gibi hücre morfolojisinin yanı sıra büyüme davranışı, bir faz kontrast mikroskobu kullanılarak izlenebilir. Fibroblastlar, 150 μm ila 300 μm boyutlarında uzun iğ benzeri bir fenotip sunar (Şekil 2A). Yeniden programlamadan sonra, 50 μm küçük hiPSC'lere sahip koloniler oluşur. Bu koloniler, yüksek çekirdek-vücut oranı ve artmış proliferasyon hızı ile ayırt edilen farklı sınırlar ve hiPSC'ler gösterir (Şekil 2C). Podositler terminal olarak farklılaşmış hücreler olduğundan, proliferasyon hızı ilerleyici farklılaşma ile azalır ve hücre morfolojisi belirgin ayak süreçlerine sahip 300 μm büyüklüğünde yıldız şeklindeki podositlere dönüşür (Şekil 2F).
Akıcılık, hiPSC kültürünün kritik bir noktasıdır ve koloniler çok yoğunlaştığında kendiliğinden farklılaşma ortaya çıkabilir (Şekil 3). Bu koloniler, kültür kabının etkilenen kısımlarını kazıyarak geçmeden önce çıkarılmalıdır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig04.jpg"> Şekil 3: Farklı kalitedeki hiPSC'lere örnekler. Başarılı bir şekilde (A) yeniden programlanmış hiPSC kolonilerinin ve (B) seçilmiş hiPSC'lerin faz kontrast görüntülerinin yanı sıra (C) spontan farklılaşma, (D, E) hiPSC olmayan koloniler ve (F) çok yoğun bir hiPSC kültürü. Ölçek çubukları 300 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu protokolün farklı hücre tipleri, belirli bir işaretleyicinin ekspresyonu ile ilgili olarak doğrulanmalıdır. Yeniden programlamadan sonra, hiPSC'ler pluripotens kapasitesini yeniden kazanır ve SSEA4, OCT3/4 ve Ki67 gibi proliferasyon ve pluripotens belirteçlerini eksprese eder (Şekil 4)38,39,40. Yeniden programlamanın yanı sıra uzun süreli hiPSC kültürü ve farklılaşmanın anormal bir karyotipe yol açabileceği veya daha doğrusu mutasyonlara neden olabileceği bilinmektedir41. Bu nedenle, kültürlenmiş hücrelerin genetik arka planı zaman içinde ve farklı pasajlarda g-bandı ve tüm ekzom dizilimi ile izlenmelidir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig03.jpg"> Şekil 4: İmmünofloresan boyama ile üretilen hiPSC'lerin karakterizasyonu. Üretilen hiPSC'lerin (A) proliferatif belirteç Ki67'nin yanı sıra pluripotens belirteçleri (B) OCT3/4 ve (C) SSEA4 için boyanarak karakterizasyonu. Ölçek çubukları 100 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Morfolojik olarak, hiPSC türevli podositler yıldız şeklinde görünür ve siPodositlere kıyasla uzun birincil ve ikincil ayak süreçlerinin farklı bir ağını ifade eder (Şekil 5). HiPSC türevi podositler, sinaptopodin, nefrin ve podosin gibi podosit spesifik belirteç proteinlerini eksprese eder (Şekil 6A-C)42.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig05.jpg"> Şekil 5: HiPSC türevli podositlerin siPodositlere kıyasla morfolojisi. Sağlıklı bir donörden alınan (A,B) hiPSC türevli podositlerin hücre morfolojisi ve filopodia açısından (A,D) siPodositlerle faz kontrast mikroskobu (A,C) ve taramalı elektron mikroskobu (B,D) kullanılarak karşılaştırılması. Ölçek çubukları 150 μm (A,C) ve 20 μm'yi (B,D) temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu nedenle, hiPSC türevli podositlerin sadece sağlıklı donörlerden değil, aynı zamanda podosit spesifik genlerde mutasyonları olan hastalardan da karşılaştırılması, hastanın mutasyonunun ex vivo olarak bireyselleştirilmiş karakterizasyonuna izin verir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65364/65364fig06.jpg"> Şekil 6: HiPSC türevli podositlerde ve siPodositlerde podosit spesifik bir belirtecin karakterizasyonu. Sağlıklı bir donörden alınan (A-K) hiPSC türevi podositlerin podosit spesifik belirteç proteinleri sinaptopodin (A,D), nefrin (B,E) ve podosin (C,F) açısından (D-F) sipodositlerle karşılaştırılması. Ölçek çubukları 50 μm'yi temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/65364fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1. Çalışmada kullanılan tüm hücre kültürü ortamlarının ve çözeltilerinin bileşimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65364/Table%201_REv2.zip" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies at JoVE.com

Bu makalede, dermal fibroblastlardan hastaya özgü podositlerin epizomal yeniden programlanması yoluyla insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere (hiPSC'ler) ve ardından podositlere farklılaşması için iki aşamalı bir protokol açıklanmaktadır.

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the ...

Dermal fibroblastları insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere epizomal olarak yeniden programlayarak insan podositleri üretmek için bir protokol tanımladık. Bu hücreler, podosit gıda süreçleri ve podosit spesifik belirteçlerinin ekspresyonu açısından in vivo podositlere ölümsüzleştirilmiş podositlerden çok daha iyi benzemektedir. Podositler terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir.Bu nedenle, bu hücreler artık çoğalmaz ve hücre kültüründe primer podosit analizi sınırlıdır. Sınırlı hücre sayısı sorunu, şartlı olarak ölümsüzleştirilmiş podositler kullanılarak aşılmasına rağmen, bu podositler, temel araştırmalarda kullanımlarını sorgulayan farklılaşmamış bir fenotip ve davranış sunar. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin yardımıyla, podositler, farklı gıda süreçleri ve podosit spesifik belirtecinin ekspresyonunu içeren tipik podosit morfolojisi ile neredeyse sınırsız sayıda in vitro olarak üretilebilir.Podositlere farklılaşmak için hastaya özgü kök hücreleri kullanırken, hücrenin hastalığa özgü değişikliklerini ex vivo olarak incelemek mümkündür. Olguda, ilk deri biyopsisi genetik podosit hastalığı olan bir hastadan alındı. Protokolümüzle üretilen podositler, hastanın mutasyonunu taşıyan kişiselleştirilmiş hastalıklı hücrelerdir.Bu nedenle, bu hücreler podosit hastalıklarını ve potansiyel terapötik maddeleri bireyselleştirilmiş bir yaklaşımla incelemek için geliştirilmiş bir ex vivo modeli temsil eder.

generation-of-patient-derived-podocytes-from-skin-biopsies

Research

JoVE Journal

Biology

Generation of Patient-Derived Podocytes from Skin Biopsies

1.0K Görüntüleme.  Friedrich-Alexander University (FAU) Erlangen-Nürnberg. Dermal fibroblastları insan kaynaklı pluripotent kök hücrelere epizomal olarak yeniden programlayarak insan podositleri üretmek için bir protokol tanımladık. Bu hücreler, podosit gıda süreçleri ve podosit spesifik belirteçlerinin ekspresyonu açısından in vivo podositlere ölümsüzleştirilmiş podositlerden çok daha iyi benzemektedir. Podositler terminal olarak farklılaşmış hücrelerdir.Bu nedenle, bu hücreler artık çoğalmaz ve hücre kültüründe primer podo...

Video: Yazar Spotlight: Cilt Biyopsilerinden Hasta Kaynaklı Podosit Üretimi  

Podocytes are epithelial cells sitting on the urinary site of the glomerular filtration barrier that contribute to the selective filter function of the glomerulus. Mutations in podocyte-specific genes can cause focal segmental glomerulosclerosis (FSGS), and podocytes are also affected in many other primary and secondary nephropathies. Due to their differentiated nature, primary cell culture models are limited for podocytes.&#160;Therefore, commonly conditionally immortalized cells are used. However, these conditionally immortalized podocytes (ciPodocytes) have several limitations: the cells can dedifferentiate in culture, especially when they reach confluency, and several podocyte-specific markers are either only slightly or not expressed at all. This brings the use of ciPodocytes and their applicability for physiological, pathophysiological, and clinical reach into question. Here, we describe a protocol for the generation of human podocytes-including patient-specific podocytes-from a skin punch biopsy by episomal reprogramming of dermal fibroblasts into hiPSCs and subsequent differentiation into podocytes. These podocytes resemble in vivo podocytes much better in terms of morphological characteristics, like the development of foot processes and the expression of the podocyte-specific marker. Finally, yet importantly, these cells maintain patients&#39; mutations, resulting in an improved ex vivo model to study podocyte diseases and potential therapeutic substances in an individualized approach.

This manuscript describes a two-step protocol to generate patient-specific podocytes from dermal fibroblasts via episomal reprogramming into human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) and subsequent differentiation into podocytes.

Biyoloji

﻿Outgrowth of Dermal Fibroblasts from a Skin Punch Biopsy

Outgrowth of Dermal Fibroblasts from a Skin Punch Biopsy  

To begin, take the skin biopsy tube with fibroblast medium. Remove the medium, and wash the skin punch biopsy thrice with five milliliters of sterile, pre-warmed PBS. Using sterile forceps, transfer the skin punch biopsy to a 10-centimeter cell culture plate, and cut it widthwise into three or four pieces with a sterile scalpel, leaving the epidermis and dermis.Transfer each piece into a sterile, 35-millimeter, plastic cell culture dish, and press it gently into the culture dish. Allow it to dry for five to 10 minutes until the liquid evaporates and the biopsy is attached to the cell culture plastic. Using a 1, 000-microliter pipette, add one milliliter of fibroblast medium dropwise around the biopsy to a final volume of three milliliters.Incubate the sample for seven days at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide without feeding or moving the dish. At the end of the incubation, change the medium to fresh, pre-warmed fibroblast medium. Finally, use a phase contrast microscope to monitor the outgrown spindle-like fibroblasts around the skin biopsy, and freeze the selected cells after growing them.

Bir Deri Punch Biyopsisinden Dermal Fibroblastların Büyümesi

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)

Episomal Reprogramming of Dermal Fibroblasts to Generate Human-Induced Pluripotent Stem Cells (HiPSCs)  

To begin, take a flask of cultured fibroblast cells, coat a 10-centimeter cell culture plate suitable for hiPSC culture with four milliliters of cold coating solution per plate, and incubate the plate for one hour at 37 degrees Celsius. Afterward, remove the media from the fibroblasts and wash them with four milliliters of pre-warmed PBS per flask. Aspirate the PBS and associate the fibroblasts with four milliliters of Trypsin-EDTA per flask by incubating for five to seven minutes at 37 degrees Celsius.Monitor cell detachment using a phase contrast microscope, and if needed, tap against the side of the flask to detach the cells from the plastic surface. Transfer the detached cells to a 50-milliliter conical tube and wash the empty flasks with six milliliters of pre-warmed fibroblast medium. Collect and pool the remaining cells in the conical tube.Then centrifuge the cells at 200 g for five minutes at 20 degrees Celsius. Aspirate the supernatant and re-suspend the cell pellet in three milliliters of fresh, pre-warmed PBS. Count the cells, transfer 1.5 times 10 to the sixth fibroblasts into a new conical tube and fill up with PBS to the five millimeter mark.Centrifuge the tube at 200 g for five minutes at 20 degrees Celsius. Discard the supernatant, re-suspend the cell pellet in five milliliters of electroporation medium, and centrifuge again. In the meantime, aspirate the coating solution from the coated 10-centimeter cell culture plate and add seven milliliters of pre-warmed fibroblast medium.At the end of the centrifugation, discard the supernatant and re-suspend the cell pellet in electroporation medium with a concentration of 1.5 times 10 to the sixth cells in 250 microliters. Transfer the 250 microliter cell suspension to an electroporation cuvette with a four millimeter gap distance. Next, prepare a plasma transfection mix by adding four micrograms of each plasmid to a total volume of 50 microliters of electroporation medium.Transfer the transfection mix to the cuvette, mix gently by flicking, and electroporate with one pulse at 280 volts. Finally, transfer 150 microliters of the electroporated fibroblasts to the prepared 10-centimeter cell culture plate. Agitate the plate thrice in all directions to distribute the cells, and incubate overnight.Fibroblasts present in a long, spindle-like phenotype, the size of 150 to 300 nanometers. After reprogramming, colonies with 50 micrometer small hiPSCs occur displaying distinct borders. The hiPSCs are distinguished by a high nuclei to body ratio and increased proliferation rate.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücreler (hiPSC'ler) Üretmek için Dermal Fibroblastların Epizomal Yeniden Programlanması

Selection, Expansion, and Quality Control of hiPSCs Generated from Dermal Fibroblasts

To begin, take the plate of electroporated fibroblasts and observe the formation of hiPSC colonies under a 10x to 20x objective phase contrast microscope. The hiPSC colonies with 300 micrometer diameter, distinct borders, and a high nuclei to body ratio are suitable for picking. Before picking, coat the wells of a 96 well plate suitable for hiPSC culture with 100 microliters of coating solution.And incubate for one hour at 37 degrees Celsius. During incubation, mark the colonies of interest at the bottom of the cell culture dish with a pen. For the final preparation of the 96 well plate, remove the coating solution and add 100 microliters of pre-warmed hiPSC culture medium, containing 10 micromoles of ROCK inhibitor Y-27632 to each well.Next, wash the cells with pre-warmed PBS and add fresh pre-warmed hiPSC culture medium containing 10 micromoles of ROCK inhibitor Y-27632 before picking to remove dead cells. Pick the hiPSC colonies using a gauge needle and divide the colonies into small pieces by drawing a grid into each colony. Afterward, use a phase contrast microscope to check that the colonies are successfully divided into pieces.Finally, transfer the colonies with a 100 microliter pipette to the prepared 96 well plate, holding the pipette upright over the colony. Allow the cells to attach overnight at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide without disturbance. The following day, replace the medium with 200 microliters of fresh hiPSC culture medium to remove the ROCK inhibitor Y-27632 and place the plates back in the incubator.Monitor the 96 well plate and mark the wells with successfully picked clones. The marked clones can be expanded and frozen at this point. Phase contrast images have successfully reprogrammed hiPSC colonies, selected hiPSCs, spontaneously differentiated colonies, non-hiPSC colonies, and a too dense hiPSC culture are presented.