Yazarlar, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi'nin BB/V017551/1 (S.K., T.P.H.) ve BB/W01095X/1 (A.L., T.P.H.) ve Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi - Savunma Bilimi ve Teknoloji Laboratuvarları ödülü EP/N026683/1 (C.J.W., A.M.B., T.P.H.) ödüllerinin desteğini büyük ölçüde kabul etmektedir. Bu yayını destekleyen veriler şu adreste açıkça mevcuttur: 10.25405/data.ncl.22232452. Yazar, açık erişim amacıyla, ortaya çıkan herhangi bir Yazar Kabul Edilmiş Makale sürümüne Creative Commons Atıf (CC BY) lisansı uygulamıştır.

1. Hücre lizat tamponu ve ortam hazırlama
<ol><li>2x YT+P agar ve besiyerinin hazırlanması<ol><li>16 g/L tripton, 10 g/L maya özütü, 5 g/L NaCl, 40 mL/L 1 M K 2 HPO 4, 22 mL/L 1 M KH2PO4 ve 15 g/L agar ölçerek 2x YT+P agar hazırlayın. 2x YT+P et suyu için önceki bileşimi takip edin ancak agarı atlayın.</li>
		<li>2x YT+P'yi otoklavlayarak sterilize edin.</li>
	</ol></li>
	<li>S30A tamponunun hazırlanması<ol><li>S30A tamponunu 5.88 g/L Mg-glutamat, 12.195 g/L K-glutamat ve 25 mL/L 2 M Tris ile hazırlayın, asetik asit ile pH 7.7'ye ayarlayın.</li>
		<li>S30A tamponunu 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>S30B tamponunun hazırlanması<ol><li>S30B tamponunu 5.88 g/L Mg-glutamat ve 12.195 g/L K-glutamat ile hazırlayın, 2 M Tris ile pH 8.2'ye ayarlayın.</li>
		<li>S30B tamponunu 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hücre lizat hazırlığı (4 günlük protokol)
<ol><li>1. Gün<ol><li>2x YT+P'yi 100 μg/mL ampisilin ile desteklenmiş agar plakalarına dökün.</li>
		<li>E. coli'yi −80 °C gliserol stoğundan ayırın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>2. Gün<ol><li>2x YT+P plakasından tek bir koloniyi 1 L'lik şaşkın bir şişede 400 mL 2x YT+P et suyuna (ampisilin ile desteklenmiş) aşılayın.</li>
		<li>37 °C'de 220 rpm çalkalayarak 24 saat inkübe edin.</li>
	</ol></li>
	<li>3. Gün<ol><li>24 saatlik kültürlerin OD600'ünü ölçün ve kaydedin; 3-4'lük bir OD600'de büyüme yeterlidir. NOT: 1 mL'lik bir bakteri kültürü alikutu alın ve OD600 nm'yi ölçmeden önce orta (2x YT+P suyu) ile seri seyreltme gerçekleştirin. OD600'ü hesaplarken seyreltme etkisine izin verin.</li>
		<li>Kültürü önceden soğutulmuş 500 mL'lik santrifüj şişeleri arasında eşit olarak aktarın.</li>
		<li>4,500 °C'de 15 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.</li>
		<li>Santrifüjleme sırasında, önceden hazırlanmış S30A tamponuna 2 mL/L 1 M DTT ekleyerek, tamponu karıştırarak ve buz üzerinde tutarak S30A tampon hazırlığını tamamlayın.</li>
		<li>Hücre peletlerini 200 mL S30A tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Tüm pelet tamamen çözünene kadar şişeleri kuvvetlice vorteksleyin ve hücreleri mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.</li>
		<li>4,500 °C'de 15 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın.</li>
		<li>2.3.5-2.3.7 (dahil) adımlarını tekrarlayın.</li>
		<li>Her santrifüj şişesine 40 mL S30A tamponu ekleyin, peletleri yeniden süspanse edin ve önceden tartılmış 50 mL santrifüj tüplerine aktarın.</li>
		<li>4.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltarak atın ve kalan süpernatanı pipetle çıkarın ve mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Santrifüj tüplerini yeniden tartın, yeni kütleyi kaydedin ve peletlerin kütlesini hesaplayın.</li>
		<li>Peletleri sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve −80 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>4. Gün<ol><li>Peletleri buz üzerinde çözdürün.</li>
		<li>1 g pelet başına aşağıdakileri ekleyin: 1.2 mL S30A tamponu (kullanımdan önce DTT eklenir), 275 μL proteaz inhibitörü (8 mM stok) ve 25 μL lizozim (10 mg/mL stok).</li>
		<li>Peletler kalan kümeler olmadan tamamen çözünene kadar kuvvetlice girdap yapın, onları mümkün olduğunca buz üzerinde tutun.</li>
		<li>50 mL santrifüj tüplerinde, hücre süspansiyonlarını 120 W, 20 kHz,% 30 genlik ve 20 s / 40 s açma / kapama darbelerinde 5 dakikalık sonikasyon için sonikleştirin.</li>
		<li>Hücre kalıntılarını peletlemek için 4,000 ° C'de 1 saat boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı taze 50 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın.</li>
		<li>Tüpleri 37 °C'de 220 rpm'de 80 dakika inkübe edin.</li>
		<li>S30B tamponuna 1 mL/L 1 M DTT ekleyerek diyaliz malzemelerini hazırlayın. Karıştırın ve 1 L'lik steril bir behere 900 mL ekleyin. Manyetik bir karıştırıcı ekleyin ve 4 °C'de tutun.</li>
		<li>Akış reaksiyonunu takiben, hücre ekstraktını adım 2.4.7'den 2 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin.</li>
		<li>Peletsiz süpernatanı 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde buz üzerinde birleştirin.</li>
		<li>Üretilen hücre ekstraktının toplam hacmini belirleyin ve gerekli sayıda 10K MWCO diyaliz kasetini 2 dakika boyunca S30B'ye batırarak nemlendirin.</li>
		<li>Kasetleri 3 mL'ye kadar ekstrakt içeren bir şırınga ile yükleyin. 4 °C'de 3 saat karıştırarak 1 L beher başına üç kasete kadar diyalize edin.</li>
		<li>Ekstraktı berraklaştıran diyaliz tamamlandıktan sonra, ekstraktı 2 mL mikro santrifüj tüplerine aktarın. 20.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Arıtılmış ekstraktı buz üzerinde taze bir santrifüj tüpünde birleştirin ve karıştırmak için kısaca girdap yapın.</li>
		<li>Bir florometre kullanarak ekstraktın protein konsantrasyonunu belirleyin.</li>
		<li>Ekstraktı önceden soğutulmuşddH2Okullanarak 44.5 mg / mL'lik bir konsantrasyona seyreltin.</li>
		<li>200 μL'lik alikotlara ayırın, sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve −80 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Liyofilize hidrojellerin hazırlanması (Yöntem A)
<ol><li>0.75 g agaroz tartın, 100 mL'lik bir hacmeddH2Oekleyin ve erimiş agaroz stoğu oluşturmak için yüksek sıcaklıklarda 30 s'de mikrodalgada pişirin.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak, 50 μL erimiş agarozu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve jelin 20-30 dakika polimerize olmasına izin verin (jeller bir buzdolabına aktarılırsa polimerizasyon daha hızlı gerçekleşir).</li>
	<li>Polimerize jelleri içeren mikrosantrifüj tüplerini sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.</li>
	<li>Santrifüj tüplerinin kapağını çıkarın, santrifüj tüpü açıklıklarını balmumu filmiyle kapatın ve filmi bir iğne veya pipet ucuyla birkaç kez delin.</li>
	<li>Polimerize jelleri içeren mikrosantrifüj tüplerini 1-2 saat boyunca −80 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Santrifüj tüplerini −80 °C'lik depodan kurtarın ve tüplerin tamamen kuru olduğundan emin olarak bir dondurarak kurutucuya koyun.</li>
	<li>Dondurarak kurutma makinesini aşağıdaki ayarlarla devreye alın: sıcaklık: −20 °C, basınç: 0,1 mbar.</li>
	<li>Jeli gece boyunca donarak kurumaya bırakın.</li>
	<li>Jelleri dondurarak kurutucudan kurtarın ve gerekli olana kadar −80 °C'lik bir depoya koyun. NOT: Jeller 1 yıla kadar dondurularak kurutulmuş olarak saklanabilir.</li>
</ol>4. 14x enerji çözeltisi stoğunun hazırlanması
<ol><li>14x enerji çözeltisi üretmek için tüm reaksiyon bileşenlerini (Tablo 1) buz üzerinde 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde birleştirin.</li>
	<li>14x enerji çözeltisini 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine ayırın ve −80 ° C'de saklayın (daha küçük hacimli alikotlar kullanılabilir). NOT: 14x enerji çözeltisi, tüplerin tekrar tekrar donarak çözülmesi önlenirse, −80 °C'de birkaç ay saklanabilir.</li>
</ol>5. 4x amino asit stoğunun hazırlanması
<ol><li>Bir RTS Amino Asit Örnekleyici kitinin 20 amino asit bileşeninin tümünü buz üzerinde çözün. Tamamen çözündüklerinden emin olmak için amino asitleri vorteksleyin.</li>
	<li>50 mL'lik bir santrifüj tüpünde, 20 amino asidin tümünü birleştirin ve çözelti berraklaşana kadar 12 mL sterilddH2O. Vorteks ekleyin, sadece hafif bir beyaz renklenme bulanıklığı ile.</li>
	<li>4x amino asitleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine (500 μL alikotlar) ayırın.</li>
	<li>4x amino asit çözeltisi alikotlarını sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun ve alikotları −80 °C depolamaya taşıyın.</li>
</ol>6. Hücresiz tampon kalibrasyonu
NOT: Hidrojel reaksiyonları için kullanılan CFPS tamponu, Sun ve ark.35'ten modifiye edilen Banks ve ark.34'teki protokol izlenerek optimal DTT, Mg-glutamat ve K-glutamat konsantrasyonları için kalibre edilmiştir. Kalibrasyon reaksiyonu bileşimleri, K-glutamat (200 mM, 400 mM, 600 mM, 1.000 mM, 1.200 mM, 1.400 mM), Mg-glutamat (0 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM) ve DTT (0 mM, 5, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM) stokları. JMP Pro 15, özel bir DOE tasarımı oluşturmak (Tablo 2) ve optimal faktör konsantrasyonlarını belirlemek için analiz yapmak için kullanıldı.
<ol><li>Hücresiz ekstraktı −80 °C depolamadan geri kazanın ve buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>4x amino asit, 14x enerji solüsyonu, %40 PEG-8000, plazmit DNA, 3 M K-glutamat, 100 mM Mg-glutamat ve 100 mM DTT stoklarını buz üzerinde çözün.</li>
	<li>12.5 μL 4x amino asit, 3.57 μL 14x enerji çözeltisi, 2.5 μL %40 PEG-8000, 3 μg plazmit DNA ve 10 μL hücresiz ekstrakt (44.5 mg/mL) birleştirerek bir kalibrasyon ana karışımı oluşturun ve ddH2Oile reaksiyon başına 35 μL'ye kadar yapın.</li>
	<li>35 μL ana karışımı 384 oyuklu siyah bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına dağıtın.</li>
	<li>DOE tasarımını takiben, her reaksiyonu 50 μL'ye kadar yapmak içinddH2Oile birlikte her reaksiyona uygun hacimde Mg-glutamat, K-glutamat ve DTT ekleyin.</li>
	<li>Açıklanan plaka okuyucu ayarlarını kullanarak floresan algılama ve analiz için mikrotitre plakasını bir plaka okuyucuya aktarın (mCherry için): uyarma: 587 nm, emisyon: 610 nm, dalga boyu bant genişliği: 12 nm, optik: üst, sıcaklık: 37 °C, floresan okumaları toplam okuma süresinin 4 saati boyunca her 5 dakikada bir toplanır. Plakaları 60 rpm'de darbeli bir ayarda çalkalayarak inkübe edin.</li>
	<li>Sonuçları JMP DOE tasarımına yükleyin ve istenen yanıt değişkenlerine dayalı olarak K-glutamat, Mg-glutamat ve DTT için optimal konsantrasyon seviyelerini belirlemek için bir tahmin profili oluşturun; Bu durumda, maksimum floresan ve reaksiyon hızı yanıt değişkenleriydi.</li>
	<li>3X CFPS tamponunu oluşturmak için reaktifleri Tablo 2'te gösterildiği gibi birleştirin</li>
	<li>Aliquot ve −80 °C'de saklayın</li>
</ol>7. Rehidre liyofilize hidrojellerde CFPS (Yöntem A)
NOT: CFPS reaksiyonlarında kullanılan plazmitler, E. coli 36 için EcoFlex modüler araç setindeki bileşenler kullanılarak oluşturulmuştur ve Whitfield ve ark.1 JM23100 1'de açıklanmıştır. Bu bileşenler Addgene'den edinilebilir.
<ol><li>Hücresiz ekstraktı −80 °C depolamadan geri kazanın ve yaklaşık 20 dakika buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>2x CFPS tamponunu ve plazmit DNA'yı toplayın ve buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>Dondurularak kurutulmuş hidrojelleri toplayın ve jelleri tezgahta bekleterek 15 dakika oda sıcaklığına gelmelerini bekleyin.</li>
	<li>Jelleri 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın, gerekirse jelleri kuyucuklara sığdırmak için bir neşter ile kesin.</li>
	<li>1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 10 μL hücresiz ekstraktı 25 μL 2x CFPS tamponu ve 4 μg plazmit DNA ile birleştirin; CFPS çözeltisini oluşturmak için ddH2Oile toplam 50 μL hacme kadar çıkın.</li>
	<li>CFPS çözeltisini dondurularak kurutulmuş hidrojellerin üzerine pipetleyin.</li>
	<li>Jellerin oda sıcaklığında 5-10 dakika CFPS sisteminde ıslanmasına izin verin.</li>
	<li>Jelleri bir spatula kullanarak 384 oyuklu siyah bir mikrotitre plakasına aktarın.</li>
	<li>Adım 6.6'da açıklanan plaka okuyucu ayarlarını kullanarak floresan algılama ve analiz için mikrotitre plakasını bir plaka okuyucuya aktarın. Temsili sonuçlar önceki çalışmalarda mevcuttur31,33.</li>
</ol>8. Konuşlandırılabilir hidrojellerde hücresiz protein sentezi (Yöntem B)
<ol><li>−80 °C depolamadan hücresiz ekstraktı geri kazanın ve yaklaşık 20 dakika buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>Plazmid DNA'sını toplayın ve buz üzerinde çözdürün.</li>
	<li>Buz üzerinde 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 10 μL hücresiz ekstraktı 3 μg plazmit DNA ve 25 μL 2x CFPS tamponu ile birleştirerek toplam hacmi 37.5 μL'ye kadar birleştirin.</li>
	<li>3 g agaroz ölçün ve% 3 agaroz oluşturmak için 100 mL ddH2Otamponuna ekleyin.</li>
	<li>Mikrodalgada %3 agaroz 30 saniyede yüksek güçte patlar.</li>
	<li>12.5 μL erimiş agarozu, toplam 50 μL hacme kadar CFPS karışımı içeren 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin.</li>
	<li>Erimiş agarozun soğumasına izin verin, ancak polimerize olmayın, agarozu 50 °C'ye ayarlanmış bir ısı bloğunda bırakın.</li>
	<li>Erimiş agarozu CFPS çözeltisi ile birleştirin; pipetleme yoluyla karıştırın ve uçla karıştırın ve CFPS çözeltisi karıştırılmadan önce jel polimerizasyonunu önlemek için hızlı hareket ettiğinizden emin olun.</li>
	<li>Jellerin oda sıcaklığında soğumasını bekleyin ve yaklaşık 2 dakika polimerize edin.</li>
	<li>Polimerize agarozu bir spatula ile 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurun.</li>
	<li>Flaşla dondurulan hidrojelleri 1 saat boyunca −80 °C'de saklayın.</li>
	<li>Jelleri depodan kurtarın; Mikrosantrifüj tüpü kapaklarını çıkarın, tüpleri balmumu filmiyle örtün ve nemin kurumasını sağlamak için filmi delin.</li>
	<li>Dondurarak kurutma makinesini aşağıdaki ayarlarla devreye alın: sıcaklık: −20 °C, basınç: 0,1 mbar, 18 saat dondurarak kurutma (gece boyunca).</li>
	<li>Dondurularak kurutulmuş CFPS cihazlarını kullanana kadar −80 °C'lik bir depoda saklayın.</li>
	<li>Yaklaşık 50 μL ıslak hacme sahip dondurularak kurutulmuş CFPS cihazları, fazla sıvı olmadan 50 μLddH2Oile rehidre edilebilir. Rehidrasyon yaklaşık 30 dakika sürer.</li>
	<li>Jelleri bir spatula kullanarak 384 oyuklu siyah bir mikrotitre plakasına aktarın.</li>
	<li>Adım 6.6'da açıklanan plaka okuyucu ayarlarını kullanarak floresan algılama ve analiz için mikrotitre plakasını bir plaka okuyucuya aktarın. Temsili sonuçlar önceki yayınlardamevcuttur 31,33.</li>
</ol>

CFPS Reaksiyonlarının Çeşitli Hidrojel Matrislerine Gömülmesi

<ol>
	<li>Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Engineering+in+an+open+world.">Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world.</a> Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).</li><li>Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+Engineering+beyond+the+cell.">Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (12), e023853 (2016).</li><li>Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+enabled+rapid+prototyping+for+metabolic+engineering+and+synthetic+biology.">Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology.</a> Synthetic and System Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).</li><li>Kopniczky, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+as+a+prototyping+platform+for+mammalian+synthetic+biology.">Cell-free protein synthesis as a prototyping platform for mammalian synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 144-156 (2020).</li><li>Pandi, A., Grigoras, I., Borkowski, O., Faulon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+cell-free+biosensors+to+monitor+enzymatic+production.">Optimizing cell-free biosensors to monitor enzymatic production.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1952-1957 (2019).</li><li>Khambhati, K., Bhattacharjee, G., Gohil, N., Braddick, D., Kulkarni, V. S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+cell-free+protein+synthesis+for+extending+the+abilities+of+biological+systems.">Exploring the potential of cell-free protein synthesis for extending the abilities of biological systems.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 248 (2019).</li><li>Focke, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+in+vitro+folding+with+cell+free+protein+synthesis+for+membrane+protein+expression.">Combining in vitro folding with cell free protein synthesis for membrane protein expression.</a> Biochemistry. 55 (30), 4212-4219 (2016).</li><li>Fogeron, M. L., Lecoq, L., Cole, L., Harbers, M., B&#246;ckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+synthesis+of+complex+biomolecular+assemblies:+wheat+germ+cell-free+protein+expression+in+structural+biology.">Easy synthesis of complex biomolecular assemblies: wheat germ cell-free protein expression in structural biology.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 63958 (2021).</li><li>Bashir, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+concepts+of+hydrogels:+synthesis,+properties,+and+their+applications.">Fundamental concepts of hydrogels: synthesis, properties, and their applications.</a> Polymers. 12 (11), 2702 (2020).</li><li>Loo, S. L., V&#225;squez, L., Athanassiou, A., Fragouli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+hydrogels-A+promising+platform+in+enhancing+water+security+for+a+sustainable+future.">Polymeric hydrogels-A promising platform in enhancing water security for a sustainable future.</a> Advanced Material Interfaces. 8 (24), 2100580 (2021).</li><li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+materials.">Cell-free protein synthesis in hydrogel materials.</a> Chemical Communications. 56 (52), 7108-7111 (2020).</li><li>Yao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+strategies+for+adhesive+hydrogels+with+natural+antibacterial+agents+as+wound+dressings:+Status+and+trends.">Design strategies for adhesive hydrogels with natural antibacterial agents as wound dressings: Status and trends.</a> Materials Today Bio. 15, 100429 (2022).</li><li>Musgrave, C. S. A., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+lens+materials:+A+materials+science+perspective.">Contact lens materials: A materials science perspective.</a> Materials. 12 (2), 261 (2019).</li><li>Maher, A. J., Rana, A. G., Rawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+hydrogel+from+baby+diaper+wastes+and+its+application+for+enhancing+soil+irrigation+management.">Recovery of hydrogel from baby diaper wastes and its application for enhancing soil irrigation management.</a> Journal of Environmental Management. 239, 255-261 (2019).</li><li>Vigata, M., Meinert, C., Hutmacher, D. W., Bock, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+drug+delivery+systems:+A+review+of+current+characterization+and+evaluation+techniques.">Hydrogels as drug delivery systems: A review of current characterization and evaluation techniques.</a> Pharmaceutics. 12 (12), 1188 (2020).</li><li>Jacob, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+hydrogels+in+drug+delivery+systems,+tissue+engineering+and+wound+management.">Emerging role of hydrogels in drug delivery systems, tissue engineering and wound management.</a> Pharmaceutics. 3 (3), 357 (2021).</li><li>Senapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance.">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7 (2018).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biocompatible,+stimuli-responsive,+and+injectable+hydrogel+with+triple+dynamic+bonds.">A biocompatible, stimuli-responsive, and injectable hydrogel with triple dynamic bonds.</a> Molecules. 25 (13), 3050 (2020).</li><li>Shi, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactuators+based+on+stimulus-responsive+hydrogels+and+their+emerging+biomedical+applications.">Bioactuators based on stimulus-responsive hydrogels and their emerging biomedical applications.</a> NPG Asia Materials. 11, 64 (2019).</li><li>Fan, M., Tan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocompatible+conjugation+for+biodegradable+hydrogels+as+drug+and+cell+scaffolds.">Biocompatible conjugation for biodegradable hydrogels as drug and cell scaffolds.</a> Cogent Engineering. 7 (1), 1736407 (2020).</li><li>Byun, J. Y., Lee, K. H., Lee, K. Y., Kim, M. G., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+expression+and+in+situ+immobilization+of+proteins+for+generation+of+three-dimensional+protein+arrays+in+a+hydrogel+matrix.">In-gel expression and in situ immobilization of proteins for generation of three-dimensional protein arrays in a hydrogel matrix.</a> Lab on a Chip. 13 (5), 886-891 (2013).</li><li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles:+Towards+artificial+cells.">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li><li>Huang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BiobitsTM+explorer:+A+modular+synthetic+biology+education+kit.">BiobitsTM explorer: A modular synthetic biology education kit.</a> Science Advances. 4 (8), 5105 (2018).</li><li>Jaramillo-Isaza, S., Alfonso-Rodriguez, C. A., Rios-Rojas, J. F., Garc&#237;a-Guzm&#225;n, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+analysis+of+agarose-based+biopolymers+with+potential+use+in+regenerative+medicine.">Dynamic mechanical analysis of agarose-based biopolymers with potential use in regenerative medicine.</a> Materials Today Proceeding. 49, 16-22 (2022).</li><li>Wang, B. X., Xu, W., Yang, Z., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+on+recent+progress+of+the+hydrogels:+from+material+resources,+properties+to+functional+applications.">An overview on recent progress of the hydrogels: from material resources, properties to functional applications.</a> Macromolecular Rapid Communications. 43 (6), 2100785 (2022).</li><li>Salati, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose-based+biomaterials:+Opportunities+and+challenges+in+cartilage+tissue+engineering.">Agarose-based biomaterials: Opportunities and challenges in cartilage tissue engineering.</a> Polymers. 12 (5), 1150 (2020).</li><li>Buddingh, B. C., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+cells:+Synthetic+compartments+with+life-like+functionality+and+adaptivity.">Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (4), 769-777 (2017).</li><li>Kahn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microgels+as+a+platform+for+cell-free+protein+expression+and+display.">DNA microgels as a platform for cell-free protein expression and display.</a> Biomacromolecules. 17 (6), 2019-2026 (2016).</li><li>Yang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+transcription+and+translation+in+clay+hydrogel+and+implications+for+early+life+evolution.">Enhanced transcription and translation in clay hydrogel and implications for early life evolution.</a> Scientific Reports. 3, 3165 (2013).</li><li>Zhou, X., Wu, H., Cui, M., Lai, S. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+protein+expression+in+hydrogel+particles:+Towards+artificial+cells.">Long-lived protein expression in hydrogel particles: Towards artificial cells.</a> Chemical Science. 9 (18), 4275-4279 (2018).</li><li>Whitfield, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+genetic+devices+confer+autonomic+and+adaptive+properties+to+hydrogels.">Cell-free genetic devices confer autonomic and adaptive properties to hydrogels.</a> BioRxiv. , (2019).</li><li>Feng, L., Jianpu, T., Jinhui, G. D., Luo, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+DNA+hydrogel:+Design,+synthesis+and+applications.">Polymeric DNA hydrogel: Design, synthesis and applications.</a> Progress in Polymer Science. 98, 101163 (2019).</li><li>Howard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Datasets+for+Whitfield+et+al.">Datasets for Whitfield et al.</a> 2020 Chemical Communications. , (2020).</li><li>Banks, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Key+reaction+components+affect+the+kinetics+and+performance+robustness+of+cell-free+protein+synthesis+reactions.">Key reaction components affect the kinetics and performance robustness of cell-free protein synthesis reactions.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 218-229 (2022).</li><li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+implementing+an+Escherichia+coli-based+TX-TL+cell-free+expression+system+for+synthetic+biology.">Protocols for implementing an Escherichia coli-based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).</li><li>Moore, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EcoFlex:+A+multifunctional+MoClo+kit+for+E.+coli+synthetic+biology.">EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology.</a> ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).</li><li>Ben&#237;tez-Mateos, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+compartmentalized+cell-free+protein+synthesis+in+hydrogel+&#181;-channels.">Micro compartmentalized cell-free protein synthesis in hydrogel &#181;-channels.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (11), 2971-2978 (2020).</li></ol>

Burada, E. coli hücresi lizat bazlı CFPS reaksiyonlarının agaroz hidrojellere dahil edilmesi için iki protokol özetlenmiştir. Bu yöntemler, materyal boyunca eşzamanlı gen ekspresyonuna izin verir. Protokol diğer CFPS sistemleri için uyarlanabilir ve burada ayrıntıları verilen laboratuvarda hazırlanmış hücre lizatlarına ek olarak ticari olarak temin edilebilen CFPS kitleri ile başarılı bir şekilde yürütülmüştür. Daha da önemlisi, protokol, harici bir sıvı fazın yokluğunda gen ek...

Sentetik biyoloji, doğada bulunmayan işlevleri yerine getirebilen biyolojik tabanlı parçalar, cihazlar ve sistemler tasarlamak ve tasarlamak için çeşitli mühendislik disiplinlerini bütünleştirir. Çoğu sentetik biyoloji yaklaşımı hala canlı hücrelere bağlıdır. Buna karşılık, hücresiz sentetik biyoloji sistemleri, geleneksel hücre tabanlı gen ekspresyon yöntemlerininkısıtlamalarının çoğunu ortadan kaldırırken, biyolojik sistemlerin mühendisliği için daha fazla esneklik ve kısaltılmış bir süre sağlayarak, tasarımda benzeri görülmemiş düzeyde kontrol ve özgürlüğü kolaylaştırır 1,2,3. CFPS, yapay hücreler oluşturmak, genetik devrelerin prototipini oluşturmak, biyosensörler geliştirmek ve metabolitler üretmek de dahil olmak üzere çok sayıda disiplinde artan sayıda uygulamada kullanılmaktadır 4,5,6. CFPS ayrıca, agregasyona eğilimli proteinler, transmembran proteinler ve toksik proteinler 6,7,8 gibi canlı hücrelerde kolayca eksprese edilemeyen rekombinant proteinlerin üretilmesi için özellikle yararlı olmuştur.
CFPS tipik olarak sıvı reaksiyonlarda gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu, herhangi bir sıvı hücresiz cihazın bir reaksiyon kabı içinde bulunması gerektiğinden, bazı durumlarda konuşlandırılmalarını kısıtlayabilir. Burada sunulan yöntemlerin geliştirilmesinin gerekçesi, hücresiz sentetik biyoloji cihazlarının hidrojellere gömülmesi için sağlam protokoller sağlamaktı, kendi başına bir protein üretim platformu olarak değil, bunun yerine, hidrojellerin hücresiz cihazların laboratuvarın ötesinde konuşlandırılması için fiziksel bir şasi olarak kullanılmasına izin vermekti. Hidrojellerin CFPS şasisi olarak kullanılmasının çeşitli avantajları vardır. Hidrojeller, yüksek su içeriğine rağmen (bazen% 98'den fazla), katı özellikleresahip polimerik malzemelerdir 9,10,11. Macunlar, yağlayıcılar ve yapıştırıcılar olarak kullanımları vardır ve kontakt lensler, yara örtüleri, deniz yapışkan bantları, kir iyileştiriciler ve bebek bezleri 9,11,12,13,14 gibi çeşitli ürünlerde bulunurlar. Hidrojeller ayrıca ilaç dağıtım araçlarıolarak aktif olarak araştırılmaktadır 9,15,16,17. Hidrojeller ayrıca biyouyumlu, biyolojik olarak parçalanabilir ve kendi 9,18,19,20 uyaran tepkilerine sahip olabilir. Dolayısıyla buradaki amaç, moleküler biyolojiden türetilen işlevsellik ile malzeme bilimi arasında bir sinerji yaratmaktır. Bu amaçla, hücresiz sentetik biyolojiyi kollajen, laponit, poliakrilamid, fibrin, PEG-peptid ve agaroz 11,21,22 dahil olmak üzere bir dizi malzemeyle entegre etmenin yanı sıra cam, kağıt ve kumaş yüzeylerini kaplamak için çaba sarf edilmiştir 11,23,24 CFPS cihazları ile. Burada sunulan protokoller, örnek malzeme olarak agaroz kullanılarak CFPS reaksiyonlarını makro ölçekli (yani >1 mm) hidrojel matrislerine gömmek için iki yöntemi göstermektedir. Agaroz, yüksek su emme kapasitesi, kontrollü kendi kendine jelleşme özellikleri ve ayarlanabilir mekanik özelliklerinedeniyle seçilmiştir 11,24,25,26. Agarose ayrıca fonksiyonel CFPS'yi destekler, diğer birçok hidrojel alternatifinden daha ucuzdur ve biyolojik olarak parçalanabilir, bu da onu deneysel bir model sistem olarak çekici bir seçim haline getirir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin daha önce CFPS'yi bir dizi alternatif hidrojele gömmek için uygun olduğu gösterilmiştir11. Hidrojellerin geniş uygulama yelpazesi ve CFPS'nin işlevselliği göz önüne alındığında, burada gösterilen yöntemler, araştırmacıların kendi amaçlarına uygun biyolojik olarak geliştirilmiş hidrojel malzemeleri geliştirebilecekleri bir temel sağlayabilir.
Önceki çalışmalarda,23,27,28,29,30,31 reaksiyon tamponuna batırılmış hidrojellerde CFPS gerçekleştirmek için 1 μm ila 400 μm boyut aralığına sahip mikrojel sistemleri kullanılmıştır. Bununla birlikte, hidrojelleri CFPS reaksiyon tamponlarına daldırma gerekliliği, kendi başlarına malzeme olarak konuşlandırılma fırsatlarını sınırlar. Burada sunulan protokoller, jelleri reaksiyon tamponlarına daldırmaya gerek kalmadan hidrojeller içinde CFPS reaksiyonlarının gerçekleşmesine izin verir. İkincisi, makro ölçekli jellerin (2 mm ila 10 mm boyutunda) kullanılması, hidrojeller ve hücresiz gen ekspresyonu arasındaki fiziksel etkileşimin incelenmesine izin verir. Örneğin, bu teknikle, hidrojel matrisinin CFPS reaksiyonlarını11 nasıl etkilediğini ve CFPS reaksiyonlarının hidrojel matrisini31 nasıl etkileyebileceğini incelemek mümkündür. Daha büyük boyutlardaki hidrojeller ayrıca yeni, biyo-programlanabilir malzemelerin geliştirilmesine de izin verir32. Son olarak, CFPS reaksiyonlarını hidrojellere gömerek, plastik reaksiyon kaplarına olan gereksinimde de potansiyel bir azalma olur. Hücresiz sensörlerin konuşlandırılması için bu, plastik malzemelere bağımlı cihazlara göre açık avantajlara sahiptir. Birlikte ele alındığında, CFPS reaksiyonlarının hidrojellere gömülmesi, hücresiz cihazların laboratuvarın ötesinde konuşlandırılması için çeşitli avantajlar sağlar.
Burada sunulan yöntemlerin genel amacı, hidrojel matrisleri içinde CFPS reaksiyonlarının çalışmasına izin vermektir. Hücresiz protein üretim reaksiyonlarını makro ölçekli hidrojel malzemelere gömmek için iki farklı yöntem gösterilmiştir (Şekil 1). Yöntem A'da, CFPS bileşenleri, aktif bir sistem oluşturmak için liyofilize agaroz hidrojellere eklenir. Yöntem B'de, erimiş agaroz, tam bir CFPS hidrojel sistemi oluşturmak için CFPS reaksiyon bileşenleri ile karıştırılır, daha sonra liyofilize edilir ve ihtiyaç duyulana kadar depolanır. Bu sistemler, reaksiyonu başlatmak için bir hacim su veya tampon ve analit ile rehidre edilebilir.
Bu çalışmada Escherichia coli hücre lizat bazlı sistemler kullanılmaktadır. E. coli hücre lizat preparatı basit, ucuz ve yüksek protein verimi sağladığı için bunlar en popüler deneysel CFPS sistemlerinden bazılarıdır. Hücre lizatı, ribozomlar, tRNA'lar, aminoasil-tRNA sentetazları ve başlatma, uzama ve sonlandırma faktörleri dahil olmak üzere transkripsiyon ve translasyonu gerçekleştirmek için gereken makromoleküler bileşenlerle tamamlanır. Spesifik olarak, bu makale, E. coli hücre lizatları kullanılarak agaroz hidrojellerde eGFP ve mCherry üretimini gösterir ve bir plaka okuyucu ve konfokal mikroskopi kullanarak floresan görünümünü izler. Mikrotitre plaka okuyucu için temsili sonuçlar Whitfield ve ark.31'de görülebilir ve temel veriler kamuya açıktır 33. Ayrıca, jeller boyunca floresan proteinlerin ekspresyonu konfokal mikroskopi kullanılarak doğrulanır. Bu yazıda gösterilen iki protokol, hücre içermeyen gen devrelerinin saha dağıtımını destekleyecek şekilde dağıtımı için uygun bir fiziksel ortam yaratma nihai hedefi ile CFPS tabanlı genetik cihazların materyalde birleştirilmesine ve depolanmasına izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-PGA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-214793B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10752.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Severn Biotech</td>
			<td>30-15-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino Acid Sampler Kit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BTRABR1401801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cAMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9501-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coenzyme A (CoA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4282-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J14121.MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folinic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7878-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Carbosynth</td>
			<td>NG01208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1149-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49605-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAD</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6522-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG-8000</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>757551-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Dibasic (K2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3786-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD037-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein concentration kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A50668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rossetta 2 DE 3 E.coli</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71397-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85558-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109541001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J23160.MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1625-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HS4323-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K MWCO dialysis cassettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>66381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge bottles</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>3120-9500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha 1-2 LD Plus freeze-dryer</td>
			<td>Christ</td>
			<td>part no. 101521, 101522, 101527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H-X3R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black 384 well microtitre plates</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvettes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>222S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elga Purelab Chorus</td>
			<td>Elga</td>
			<td>#####</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Microcentrifuge 5425R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP00532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B34183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JMP license</td>
			<td>SAS Institute</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>15353518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Amcor</td>
			<td>PM-966</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photospectrometer (Biophotometer)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>16713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes and tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>#####</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Balance</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>16384738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator (Sonicator)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12893543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Static Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MIR-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe and needles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>66490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo max Q8000 (Shaking Incubator)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SHKE8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Varioskan Lux platereader</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>VLBL00GD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Genie 2</td>
			<td>Cole-parmer</td>
			<td>OU-04724-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR PHenomenal pH 1100 L, ph/mv/&#176;c meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>662-1657</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogels

Sentetik gen ağları, bilim insanlarının ve mühendislerin genetik düzeyde kodlanmış işlevselliğe sahip yeni sistemler tasarlamaları ve inşa etmeleri için bir platform sağlar. Gen ağlarının konuşlandırılması için baskın paradigma hücresel bir şasi içinde olsa da, sentetik gen ağları hücresiz ortamlarda da konuşlandırılabilir. Hücresiz gen ağlarının umut verici uygulamaları arasında biyosensörler bulunur, çünkü bu cihazlar biyotik (Ebola, Zika ve SARS-CoV-2 virüsleri) ve abiyotik (ağır metaller, sülfürler, böcek ilaçları ve diğer organik kirleticiler) hedeflere karşı gösterilmiştir. Hücresiz sistemler tipik olarak bir reaksiyon kabı içinde sıvı halde konuşlandırılır. Bununla birlikte, bu tür reaksiyonları fiziksel bir matrise gömmek, daha geniş bir ortam kümesinde daha geniş uygulamalarını kolaylaştırabilir. Bu amaçla, hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarını çeşitli hidrojel matrislerine gömmek için yöntemler geliştirilmiştir. Bu çalışmaya elverişli hidrojellerin temel özelliklerinden biri, hidrojel malzemelerin yüksek su sulandırma kapasitesidir. Ek olarak, hidrojeller, işlevsel olarak faydalı olan fiziksel ve kimyasal özelliklere sahiptir. Hidrojeller, depolama için dondurularak kurutulabilir ve daha sonra kullanılmak üzere yeniden sulandırılabilir. CFPS reaksiyonlarının hidrojellere dahil edilmesi ve tahlili için iki adım adım protokol sunulmaktadır. İlk olarak, bir CFPS sistemi, bir hücre lizatı ile rehidrasyon yoluyla bir hidrojele dahil edilebilir. Hidrojel içindeki sistem daha sonra hidrojel yoluyla tam protein ekspresyonu için yapısal olarak indüklenebilir veya eksprese edilebilir. İkincisi, hücre lizatı, polimerizasyon noktasında bir hidrojele eklenebilir ve tüm sistem, hidrojel içinde kodlanan ekspresyon sistemi için indükleyiciyi içeren sulu bir çözelti ile daha sonraki bir noktada dondurularak kurutulabilir ve yeniden sulandırılabilir. Bu yöntemler, hidrojel malzemelere duyusal yetenekler kazandıran hücresiz gen ağlarına izin verme potansiyeline sahiptir ve laboratuvarın ötesinde konuşlanma potansiyeline sahiptir.

Synthetic biology integrates diverse engineering disciplines to design and engineer biologically based parts, devices, and systems that can perform functions that are not found in nature. Most synthetic biology approaches are still bound to living cells. By contrast, cell-free synthetic biology systems facilitate unprecedented levels of control and freedom in design, enabling increased flexibility and a shortened time for engineering biological systems while eliminating many of the constraints of traditional cell-based gene expression methods1,2,3. CFPS is being used in an increasing number of applications across numerous disciplines, including constructing artificial cells, prototyping genetic circuits, developing biosensors, and producing metabolites4,5,6. CFPS has also been particularly useful for producing recombinant proteins that cannot be readily expressed in living cells, such as aggregation-prone proteins, transmembrane proteins, and toxic proteins6,7,8.
CFPS is typically performed in liquid reactions. This, however, may restrict their deployment in some situations, as any liquid cell-free device must be contained within a reaction vessel. The rationale for the development of the methods presented here was to provide robust protocols for embedding cell-free synthetic biology devices into hydrogels, not as a protein production platform per se but, instead, to allow the use of hydrogels as a physical chassis for the deployment of cell-free devices beyond the laboratory. The use of hydrogels as CFPS chassis has several advantages. Hydrogels are polymeric materials that, despite a high water content (sometimes in excess of 98%), possess solid properties9,10,11. They have uses as pastes, lubricants, and adhesives and are present in products as diverse as contact lenses, wound dressings, marine adhesive tapes, soil improvers, and baby diapers9,11,12,13,14. Hydrogels are also under active investigation as drug delivery vehicles9,15,16,17. Hydrogels may also be biocompatible, biodegradable, and possess some stimuli responses of their own9,18,19,20. Therefore, the goal here is to create a synergy between molecular biology-derived functionality and materials science. To this end, efforts have been made to integrate cell-free synthetic biology with a range of materials, including collagen, laponite, polyacrylamide, fibrin, PEG-peptide, and agarose11,21,22, as well as to coat surfaces of glass, paper, and cloth11,23,24 with CFPS devices. The protocols presented here demonstrate two methods for embedding CFPS reactions in macro-scale (i.e., &#62;1 mm) hydrogel matrices, using agarose as the exemplar material. Agarose was chosen due to its high water absorption capacity, controlled self-gelling properties, and tuneable mechanical properties11,24,25,26. Agarose also supports functional CFPS, is cheaper than many other hydrogel alternatives, and is biodegradable, making it an attractive choice as an experimental model system. These methods have, however, been previously demonstrated as appropriate for embedding CFPS in a range of alternative hydrogels11. Considering the wide range of applications of hydrogels and the functionality of CFPS, the methods demonstrated here can provide a basis from which researchers are able to develop biologically enhanced hydrogel materials suited to their own ends.
In previous studies, microgel systems with a size range of 1 &#181;m to 400 &#181;m have been used to perform CFPS in hydrogels submerged in reaction buffer23,27,28,29,30,31. The requirement to submerge hydrogels within CFPS reaction buffers, however, limits opportunities for their deployment as materials in their own right. The protocols presented here allow CFPS reactions to occur within hydrogels without the need to submerge the gels in reaction buffers. Second, the use of macroscale gels (between 2 mm and 10 mm in size) allows the study of the physical interaction between hydrogels and cell-free gene expression. For example, with this technique, it is possible to study how the hydrogel matrix affects CFPS reactions11 and how CFPS reactions can impact the hydrogel matrix31. Larger sizes of hydrogels also allow for the development of novel, bio-programmable materials32. Finally, by embedding CFPS reactions into hydrogels, there is also a potential reduction in the requirement for plastic reaction vessels. For the deployment of cell-free sensors, this has clear advantages over devices dependent on plasticware. Taken together, embedding CFPS reactions in hydrogels provides several advantages for the deployment of cell-free devices beyond the laboratory.
The overall goal of the methods presented here is to allow the operation of CFPS reactions within hydrogel matrices. Two different methods are demonstrated for embedding cell-free protein production reactions in macro-scale hydrogel materials (Figure 1). In Method A, CFPS components are introduced to lyophilized agarose hydrogels to form an active system. In Method B, molten agarose is mixed with CFPS reaction components to form a complete CFPS hydrogel system, which is then lyophilized and stored until needed. These systems can be rehydrated with a volume of water or buffer and analyte to commence the reaction.
This study uses Escherichia coli cell lysate-based systems. These are some of the most popular experimental CFPS systems, as E. coli cell lysate preparation is simple, inexpensive, and achieves high protein yields. The cell lysate is complemented with the macromolecular components needed to perform transcription and translation, including ribosomes, tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases, and initiation, elongation, and termination factors. Specifically, this paper demonstrates the production of eGFP and mCherry in agarose hydrogels using E. coli cell lysates and monitors the appearance of fluorescence using a plate reader and confocal microscopy. Representative results for the microtiter plate reader can be seen in Whitfield et al.31, and the underlying data are publicly available33. Further, the expression of fluorescent proteins throughout the gels is confirmed using confocal microscopy. The two protocols demonstrated in this paper allow for the assembly and storage of CFPS-based genetic devices in materia with the ultimate goal of creating a suitable physical environment for the distribution of cell-free gene circuitry in a manner supportive of field deployment.

Yazar Spotlight: Hidrojellere Hücresiz Protein Sentezi Reaksiyonlarını Gömmek İçin Yeni Bir Yaklaşım 

Hücresiz Protein Sentezi Reaksiyonlarını Makro Ölçekli Hidrojellere Gömme Yöntemleri

We know living systems continuously integrate information from many different sources and that these signals trigger complex and subtle responses. Much of this information processing occurs at the molecular level. We're interested in operating these processes within materials, but without cells.The purpose is to give materials novel functionality. Challenges in this work are primarily associated with the cell-free protein synthesis reaction, rather than working with hydrogel. Cell reaction require high quality cell lysate as well as high quality and purity DNA to function well.This protocol allows researchers to embed molecular biology reactions into a physical biodegradable material that can be taken outside of the laboratory. Also, because the reaction output interacts directly with the material chassis, there is potential for the development of materials with novel sensing and response capabilities. In short-term, we see these methods as providing a novel route to the deployment of cell-free diagnostic devices.This protocol allows a number of devices to be created and spatially organized in a manner that is not possible for liquid reactions. Our future interests are twofold. First, we are interested in expanding the nature of the hydrogels we use to bring more material functionality to the work.Second, we are interested in increasing the complexity and performance of the gene networks we operate in gels, expanding the biological functionality of these systems.

Bu protokol, CFPS reaksiyonlarını hidrojel matrislerine gömmek için iki yöntemi detaylandırır ve Şekil 1 , iki yaklaşımın şematik bir özetini sunar. Her iki yöntem de dondurarak kurutmaya ve uzun süreli depolamaya uygundur. Yöntem A, iki nedenden dolayı en çok kullanılan metodolojidir. İlk olarak, bir dizi hidrojel malzeme ile çalışmak için en uygun yöntem olduğu gösterilmiştir11. İkincisi, Yöntem A, genetik yapıların paralel olarak te...

Watch this Scientific Journal Video about A Novel Approach for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Hydrogels at JoVE.com

Burada, hücresiz protein sentezi reaksiyonlarını harici bir sıvı faza ihtiyaç duymadan makro ölçekli hidrojel matrislerine gömmek için iki protokol sunuyoruz.

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. ...

Canlı sistemlerin sürekli olarak birçok farklı kaynaktan gelen bilgileri entegre ettiğini ve bu sinyallerin karmaşık ve ince tepkileri tetiklediğini biliyoruz. Bu bilgi işlemenin çoğu moleküler düzeyde gerçekleşir. Bu süreçleri malzemeler içinde, ancak hücreler olmadan çalıştırmakla ilgileniyoruz.Amaç, malzemelere yeni işlevsellik kazandırmaktır. Bu çalışmadaki zorluklar, hidrojel ile çalışmaktan ziyade, öncelikle hücresiz protein sentezi reaksiyonu ile ilişkilidir. Hücre reaksiyonu, iyi çalışması için yüksek kaliteli hücre lizatının yanı sıra yüksek kaliteli ve saflıkta DNA gerektirir.Bu protokol, araştırmacıların moleküler biyoloji reaksiyonlarını laboratuvar dışına alınabilecek fiziksel bir biyolojik olarak parçalanabilen malzemeye yerleştirmelerine olanak tanır. Ayrıca, reaksiyon çıktısı doğrudan malzeme şasisi ile etkileşime girdiğinden, yeni algılama ve tepki yeteneklerine sahip malzemelerin geliştirilmesi için potansiyel vardır. Kısa vadede, bu yöntemlerin hücresiz teşhis cihazlarının konuşlandırılması için yeni bir yol sağladığını görüyoruz.Bu protokol, sıvı reaksiyonlar için mümkün olmayan bir şekilde bir dizi cihazın oluşturulmasına ve uzamsal olarak düzenlenmesine izin verir. Gelecekteki çıkarlarımız iki yönlüdür. İlk olarak, işe daha fazla malzeme işlevselliği getirmek için kullandığımız hidrojellerin doğasını genişletmekle ilgileniyoruz.İkincisi, jellerde işlettiğimiz gen ağlarının karmaşıklığını ve performansını artırmak, bu sistemlerin biyolojik işlevselliğini genişletmekle ilgileniyoruz.

methods-for-embedding-cell-free-protein-synthesis-reactions-macro

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Embedding Cell-Free Protein Synthesis Reactions in Macro-Scale Hydrogels

869 Görüntüleme.  Newcastle University. Canlı sistemlerin sürekli olarak birçok farklı kaynaktan gelen bilgileri entegre ettiğini ve bu sinyallerin karmaşık ve ince tepkileri tetiklediğini biliyoruz. Bu bilgi işlemenin çoğu moleküler düzeyde gerçekleşir. Bu süreçleri malzemeler içinde, ancak hücreler olmadan çalıştırmakla ilgileniyoruz.Amaç, malzemelere yeni işlevsellik kazandırmaktır. Bu çalışmadaki zorluklar, hidrojel ile çalışmaktan ziyade, öncelikle hücresiz protein sentezi reaksiyonu i...

Video: Yazar Spotlight: Hidrojellere Hücresiz Protein Sentezi Reaksiyonlarını Gömmek İçin Yeni Bir Yaklaşım 

Synthetic gene networks provide a platform for scientists and engineers to design and build novel systems with functionality encoded at a genetic level. While the dominant paradigm for the deployment of gene networks is within a cellular chassis, synthetic gene networks may also be deployed in cell-free environments. Promising applications of cell-free gene networks include biosensors, as these devices have been demonstrated against biotic (Ebola, Zika, and SARS-CoV-2 viruses) and abiotic (heavy metals, sulfides, pesticides, and other organic contaminants) targets. Cell-free systems are typically deployed in liquid form within a reaction vessel. Being able to embed such reactions in a physical matrix, however, may facilitate their broader application in a wider set of environments. To this end, methods for embedding cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in a variety of hydrogel matrices have been developed. One of the key properties of hydrogels conducive to this work is the high-water reconstitution capacity of hydrogel materials. Additionally, hydrogels possess physical and chemical characteristics that are functionally beneficial. Hydrogels can be freeze-dried for storage and rehydrated for use later. Two step-by-step protocols for the inclusion and assay of CFPS reactions in hydrogels are presented. First, a CFPS system can be incorporated into a hydrogel via rehydration with a cell lysate. The system within the hydrogel can then be induced or expressed constitutively for complete protein expression through the hydrogel. Second, cell lysate can be introduced to a hydrogel at the point of polymerization, and the entire system can be freeze-dried and rehydrated at a later point with an aqueous solution containing the inducer for the expression system encoded within the hydrogel. These methods have the potential to allow for cell-free gene networks that confer sensory capabilities to hydrogel materials, with the potential for deployment beyond the laboratory.

Here, we present two protocols for embedding cell-free protein synthesis reactions in macro-scale hydrogel matrices without the need for an external liquid phase.

Biyoloji

Cell-Free Protein Synthesis in Rehydrated Lyophilized Hydrogels

To begin, transfer the hydrogels to 1.5 milliliter micro centrifuge tubes, trimming the gels with a scalpel if necessary to make them fit in the wells. In another 1.5 milliliter micro centrifuge tube, combine 10 microliters of the cell-free extract with 25 microliters of two x cell-free protein synthesis buffer and four micrograms of plasmid DNA. Make up to a total volume of 50 microliters with double distilled water to prepare the cell-free protein synthesis solution.Pipette the solution onto the freeze dried hydrogels, and allow the gels to soak in the cell-free protein synthesis system for five to 10 minutes at room temperature. Transfer the gels to a black 384 well microtiter plate using a spatula. Then, transfer the microtiter plate to a plate reader, and use the plate reader settings shown on the screen for fluorescence detection and analysis.

Rehidre Liyofilize Hidrojellerde Hücresiz Protein Sentezi

Cell-Free Protein Synthesis in Deployable Hydrogels

In a 1.5 milliliter microcentrifuge tube on ice, combine 10 microliters of the cell-free extract with four micrograms of plasmid DNA and 25 microliters of 2X cell-free protein synthesis buffer. Make up to a total volume of 50 microliters with double-distilled water to prepare the cell-free protein synthesis solution. Weigh 0.75 grams of agarose and add it to 100 milliliters of double-distilled water buffer to prepare 0.75%agarose.Microwave the 0.75%agarose in 30-second bursts at high power and pipette 50 microliters of the molten agarose into 1.5-milliliter microcentrifuge tubes or into molds of a desired shape. Place the molten agarose on a heat block set to 50 degrees Celsius and allow the agarose to cool but not polymerize. Then, mix the molten agarose with the cell-free protein synthesis solution by pipetting and stirring with the pipette tip.Allow the gels to cool to room temperature and polymerize for approximately two minutes. Transfer the polymerized agarose to 1.5-milliliter microcentrifuge tubes with a spatula and flash freeze in liquid nitrogen. Place the flash-frozen hydrogels into minus 80 degrees Celsius storage for one hour.After that, remove the microcentrifuge tube lids. Cover the tubes with a wax film and pierce the film to allow the moisture to be dried off. Set the temperature of the freeze dryer to minus 20 degrees Celsius and pressure to 0.1 millibars and freeze-dry the cell-free protein synthesis devices for 18 hours or overnight.Rehydrate the freeze-dried devices for 30 minutes with 50 microliters of double-distilled water without excess liquid, and transfer the gels to a black 384-well microtiter plate using a spatula. Finally, place the microtiter plate on a plate reader and use the plate reader settings shown on the screen for fluorescence detection and analysis. The cell-free protein synthesis of eGFP and mCherry in a hydrogel using E.coli cell lysates is shown in this figure.0.75%agarose gels were prepared without DNA template with four micrograms of either eGFP or mCherry template or with four micrograms of both eGFP and mCherry template. An overlay of the two channels is also shown, and the overlay includes the differential interference contrast image. The results confirmed the co-expression of both mCherry and eGFP in agarose.