Çalışmalar ve Nicolai J. Wewer Albrechtsen, Novo Nordisk Vakfı Mükemmeliyet Gelişmekte Olan Araştırmacı Hibe - Endokrinoloji ve Metabolizma (Başvuru No. NNF19OC0055001), Avrupa Diyabet Araştırmaları Vakfı Geleceğin Lideri Ödülü (NNF21SA0072746) ve Danimarka Bağımsız Araştırma Fonu, Sapere Aude (1052-00003B). Novo Nordisk Vakfı Protein Araştırmaları Merkezi, Novo Nordisk Vakfı tarafından finansal olarak desteklenmektedir (Hibe sözleşmesi NNF14CC0001). Şekil 1B, biorender.com ile oluşturulmuştur. Dr. Rune E. Kuhre'ye (Novo Nordisk A/S) perfüze fare karaciğeri ile ilgili verimli görüşmeler için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan deneyleri, Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği, Danimarka Çevre ve Gıda Bakanlığı (izin 2018-15-0201-01397) ve yerel etik komitesinin izniyle 2010/63/EU sayılı AB direktifi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (yayın No. 85-3) ve hayvan deneylerini düzenleyen Danimarka mevzuatının yönergeleri izlenerek gerçekleştirilmiştir (1987). Bu terminal bir prosedürdür ve ölüm nedeni derin anestezi altında diyaframın kansızlaşması ve delinmesidir.
1. Deney hayvanları
<ol><li>İstenilen suş, yaş ve cinsiyete sahip fareler elde edin. Bu çalışmada 11-16 haftalık erkek C57BL / 6JRj fareleri kullanılmıştır. Kafes başına 5 adede kadar erkek veya 8 dişi fareyi, yem ve suya ad libitum erişimi ile barındırın ve sabah 6'dan akşam 6'ya kadar ışıklar açıkken 12 saat/12 saat aydınlık-karanlık döngüsünü sürdürün.</li>
</ol>2. Ameliyat öncesi hazırlıklar
<ol><li>Karaciğer perfüzyon tamponu yapın.<ol><li>Krebs-Henseleit Tamponu. 118 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/LMgSO4 ve 1,2 mmol/L KH2PO4'ü dH2O içinde karıştırın ve çözün.</li>
		<li>25 mmol/L NaHCO3'ü çözün ve karıştırırken tampona yavaşça ekleyin. Tamponu 4 derecede saklayın. Tampon en az 1 ay stabildir. NOT: CaCl2 ve NaHCO3 eklenmeden önce ayrı ayrı çözülmezse çökelme meydana gelebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfüzyon tamponunu 2 μm'lik bir filtreden süzün ve HCl kullanarak pH'ı 7.5'e ayarlayın. NOT: Kapalı şişelerde saklandığında bile pH zamanla arttığı için bu adım deney gününde gerçekleştirilmelidir.</li>
	<li>Test bileşiklerini istenen nihai konsantrasyondan daha yüksek bir konsantrasyonda hazırlayın (örneğin, filtrelenmiş ve pH ayarlı Krebs-Henseleit perfüzyon tamponunda bir yan kol pompası ile 20 mL / dak hızında infüze edildiğinde 0.175x konsantrasyon). Uygunsa, Krebs-Henseleit perfüzyon tamponundaki test bileşiklerini, taşıyıcı olarak %1 BSA eklenmiş (tüm peptitler için gerekli olan boru ve cam eşyalara yapışmayı önlemek için), uygun boyutta bir filtreden süzülerek seyreltin.</li>
</ol>3. Operasyon ve perfüzyon
NOT: Bu çalışmada kullanılan perfüzyon kurulumunun bir gösterimi Şekil 1'de verilmiştir.
<ol><li>Karaciğere yeterli oksijen sağlamak ve işlemin başlangıcından itibaren doğru pH'ı korumak için perfüzyon tamponunu (%95 O 2,% 5 CO2) en az 30 dakika gazlayın (bikarbonat tampon sistemi sürekli gazlama altında 7.4 pH'a ulaşacaktır, bkz. Ek Şekil 1).</li>
	<li>İntraperitoneal enjeksiyon ile ketamin (90 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) uygulayarak bir fareyi uyuşturun.</li>
	<li>Fareyi ısıtılmış bir ameliyat masasına sırtüstü yerleştirin ve ayak parmağının sıkışmasına yanıt olarak refleks eksikliğini onaylayın. Saçın makasa yapışmasını önlemek için %70 etanol püskürtün. Fareyi sıcak yüzeye sabitlemek, aşağıdaki prosedürler için kararlılığı artırmaya yardımcı olur.</li>
	<li>Karın tabanında makasla bir kesi yapın ve karın boşluğunu ortaya çıkarmak için her iki taraftan göğüs kafesine doğru yukarı doğru kesin. Portal damarı açığa çıkaran bir pamuklu çubuk kullanarak bağırsakları sağa doğru hareket ettirin.</li>
	<li>Kavisli forseps kullanarak portal damarın altına iki bağ yerleştirin ve her bağ için gevşek bir düğüm hazırlayın.</li>
	<li>Portal vene 0,7 mm'lik bir kateter yerleştirin. Delindiğinde, iğneyi kateterden çıkarın ve Şekil 2'de gösterildiği gibi kateterin ucu karaciğere yakın olana kadar kateteri damar boyunca yönlendirin. Kan katetere akar.</li>
	<li>Bağları sıkın. Kateter kanla dolu değilse, hava kabarcığı girmesini önlemek için perfüzyon tamponu ile doldurun.</li>
	<li>Perfüzyon tüpünü takın ve silindir pompasını 0.8 mL/dk perfüzyon akış hızında çalıştırarak 37 °C'de Krebs-Henseleit bikarbonat tamponu ile karaciğerin perfüzyonunu başlatın. Karaciğer saniyeler içinde soluklaşır.</li>
	<li>Makas kullanarak göğüs kafesini ve diyaframı kesin. Bu noktada, hayvana ötenazi yapılır. İnce uçlu forseps kullanarak suprahepatik inferior vena kava altına bir bağ yerleştirin. Damarı daha erişilebilir hale getirmek için farenin arkasına bir kalem, rulo gazlı bez veya başka bir tek kullanımlık öğe yerleştirin.</li>
	<li>Kalbin sağ atriyumundan suprahepatik inferior vena kavaya bir kateter yerleştirin. Delindiğinde, iğneyi kateterden çıkarın ve kateterin ucu karaciğere yakın olana kadar kateteri damar boyunca yönlendirin. Kan ve perfüzyon tamponu hemen biter.</li>
	<li>Bağı sıkın ve perfüzyon atıklarının toplanması için bir tüp takın. Tüm tüpleri su geçirmez bantla (şık bant veya benzeri) sabitleyin.</li>
	<li>Karışımı önlemek için sağ renal venin hemen üzerindeki infrahepatik vena kava boyunca bir damar klempi yerleştirmek için bir damar klemp adaptörü kullanın (Şekil 2).</li>
	<li>Perfüzyon akış hızını 3,5 mL/dk'ya yükseltin ve bir zamanlayıcı başlatın. Basınç kaydını başlatın. Başarılı perfüzyon genellikle ~ 10 mm / Hg'lik bir basınçla sonuçlanır.</li>
	<li>Karaciğeri tuzlu suyla nemlendirilmiş steril bir örtü ile örtün ve kurumasını önlemek için deney sırasında salin ekleyin.</li>
	<li>Perfüzyon atık suyunu 1 dakika boyunca toplayın ve hacmi ölçün. Hacim yaklaşık 3.5 mL / dak olmalıdır. Bu aşamada kan karışımı beklenmez ve kalp artık pompalamaz.</li>
	<li>Deneye başlamadan önce 30 dakikalık bir dengeleme süresi bekleyin.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65596/65596fig01.jpg"> Şekil 1: Perfüzyon kurulumunun bir gösterimi. (A) Ameliyat masası bir tripod standı üzerinde yükseltilir ve 37 °C'ye ısıtılır. Perfüzyon tamponu gazlanır (%95 O 2,% 5 CO2 ' dir), peristaltik silindirli bir pompa ile pompalanır ve yerleşik bir kabarcık tutucu ile ısı eşanjöründe ısıtılır. Sistem ayrıca perfüzyon basıncının ayarlanması için bir manometre ve mil pompasından oluşur. Perfüzyon basıncı, bir PC'deki bir dönüştürücü, bir basınç kayıt programı aracılığıyla sürekli olarak kaydedilir ve görselleştirilir. (B) Kırmızı kutu, üç muslukların bağlantılarını yakalar. İlk üç vana, bir şırınga pompası aracılığıyla bir test bileşiğinin infüzyonu için açıktır ve ikincisi kapalıdır. Üçüncüsü sürekli basınç ölçümleri için açıktır. Dördüncü musluk, örneğin perfüze karaciğer boyunca gaz analizi için girdi numunelerini toplamak için kullanılabilir. Konektörler, daha fazla veya daha az infüzyon hattı gerektiren belirli deneyler için gerektiği gibi değiştirilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65596/65596fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65596/65596fig02.jpg"> Şekil 2: Karaciğer perfüzyonu öncesi ve sırasında fare karın boşluğunun fotoğrafları . (A) Yeşil nokta, portal ven kateterinin ucunun yerini gösterir. Kateterin ucunun, portal venin dallanma noktasının hemen altında, sol ve sağ hepatik portal venlere ancak pankreato-duodenal dalın üzerinde yer alması sızıntıyı önlemek için önemlidir. Sarı nokta, kanın perfüze karaciğere geri akışını önlemek için sağ böbrek veni ile karaciğer arasındaki infrahepatik inferior vena kava üzerindeki damar klempinin doğru yerini gösterir. (B, C) Portal ven (B) ve suprahepatik inferior vena kava (C) ve infrahepatik inferior vena kava (B) üzerindeki damar klempine yerleştirilen iki kateter ile perfüze edilmiş bir fare karaciğeri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65596/65596fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Deney
<ol><li>Dengeleme periyodunun sonunda bir kesir toplayıcı kullanarak ilk temel numuneleri toplayarak deneye başlayın. İstenilen zaman aralığında numuneleri toplayın ve hemen buzun üzerine koyun.</li>
	<li>Kabarcık kapanını düzenli olarak kontrol edin ve boşalmaya yakın olduğunda perfüzyon tamponu ile yeniden doldurun.</li>
	<li>Tamponun bir örneğini, organa girmeden hemen önce üç bir musluktan ve inferior vena kavaya yerleştirilen toplama kateterinden (karaciğerden perfüze edildikten sonra) toplayın.</li>
	<li>Organın metabolik olarak aktif olduğunu doğrulamak için numuneleri bir kan gazı analizörü ile ölçün (CO2'nin kısmi basıncında bir artış ve pH'da bir azalma ile gösterilir).</li>
	<li>Deney boyunca uygulanabilirliği değerlendirmek için deneyin sonunda 4.3-4.4 adımlarını tekrarlayın (Ek Şekil 2). NOT: Oksijen kısmi basıncındaki azalma, tüp, organ vb. oksijen kayıpları nedeniyle güvenilir bir solunum ölçüsü sağlamaz.</li>
	<li>15 dakikalık başlangıç perfüzyonundan sonra, bir şırınga pompası kullanarak istenen akış hızında üç bir musluktan bir test maddesini infüze ederek ilk stimülasyonu başlatın (örneğin, bir yan kol pompası aracılığıyla 20 mL/dak hızında infüze edildiğinde test maddesinin 0.175x konsantrasyonu). Alternatif olarak, temel tamponu, son konsantrasyonda test bileşiğini içeren yeni (oksijenli ve ısıtılmış) bir tampona geçirin.</li>
	<li>Stimülasyonu durdurun ve ikinci stimülasyona başlamadan önce 20-30 dakika boyunca temel numuneler toplayın.</li>
	<li>Deneyin sonunda, 5-10 dakika boyunca uygun bir pozitif kontrol uygulayın.</li>
	<li>Deneyden sonra, perfüze karaciğeri eksize edin ve çıktıyı karaciğer ağırlığına normalleştirmek için tartın. Çıktıyı protein içeriğine normalleştirmek için protein içeriğinin potansiyel ölçümü için karaciğeri sıvı nitrojen içinde dondurun.</li>
</ol>5. Biyokimyasal ölçümler
<ol><li>Perfüzyon tamponundaki ölçümler için uygun tahlilleri (kurum içi veya ticari olarak temin edilebilen kolorimetrik veya ELISA tahlilleri) kullanarak ilgilenilen molekülün konsantrasyonunu ölçün. Tampon, metabolomik ve proteomik gibi çoğu omik tabanlı teknikle uyumludur. NOT: Bu çalışmada üre, daha önce tarif edilen bir kolorimetrik teste dayalı olarak ölçülmüştür14. Glikoz ve esterleştirilmemiş yağ asitleri, ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak ölçüldü.</li>
</ol>6. Veri analizi
<ol><li>Verileri, zaman içindeki salgı çıktısını gösteren XY grafiklerinde sunun. NOT: İn vitro perfüzyon sisteminin erdemlerinden biri, in vivo çalışmalarda olduğu gibi çıktıda ölçülen konsantrasyon (mmol/L) yerine verileri gerçek çıktı (konsantrasyon × akış hızı, örneğin μmol/dk) olarak ifade etmenin mümkün olmasıdır. Farklı fare modellerini karşılaştırırken çıktıyı karaciğer ağırlığına veya kontrol farelerini, karaciğer ağırlığındaki bir artışın artan yağ içeriğine bağlı olabileceği obezite veya karaciğer hastalıkları olan fare modelleriyle karşılaştırırken toplam protein içeriğine (BCA ile ölçülür) normalleştirmeyi düşünün.</li>
	<li>Özet verileri, başlangıç sırasında ve bir stimülasyon periyodu boyunca (tipik olarak 15-30 dakika) ortalama veya toplam çıktıyı temsil eden hayvan başına ayrı noktalar veya çalışma tasarımına bağlı olarak her stimülasyon periyodu için önceki taban çizgisini kullanarak artımlı çıktı olarak sunun.</li>
	<li>Verileri, çoklu test için uygun bir post-hoc test ile eşleştirilmiş t-testi (iki grup) veya tekrarlanan stimülasyonlarla (ikiden fazla grup) tek yönlü ANOVA kullanarak analiz edin.</li>
</ol>

In Situ Mouse Liver Perfusion Model to Study Metabolic Responses to Substrates

<ol>
	<li>Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+co-culture+of+rat+parenchymal+and+non-parenchymal+liver+cells+to+evaluate+cellular+interactions+and+response.">Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response.</a> Scientific Reports. 6, 25329 (2016).</li><li>Lauschke, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+rearrangements+of+cellular+MicroRNA+signatures+are+key+drivers+of+hepatocyte+dedifferentiation.">Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation.</a> Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).</li><li>Seirup, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+changes+in+chromatin+structure+during+dedifferentiation+of+primary+hepatocytes+in+vitro.">Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro.</a> Genomics. 114 (3), 110330 (2022).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+in+vitro+human+liver+models+to+in+vivo+human+liver+using+RNA-Seq.">Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq.</a> Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).</li><li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury,+liver+function,+and+disease.">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187 (2016).</li><li>Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+and+progress+in+precision-cut+liver+slice+cultures.">Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137 (2021).</li><li>Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glass-based,+continuously+zonated+and+vascularized+human+liver+acinus+microphysiological+system+(vLAMPS)+designed+for+experimental+modeling+of+diseases+and+ADME/TOX.">A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX.</a> Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li><li>Barto&#353;ek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated Liver Perfusion and its Applications. , (1973).</li><li>Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+perfused+rat+liver:+conceptual+and+practical+considerations.">The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations.</a> Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).</li><li>Mischinger, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+technique+for+isolated+perfusion+of+rat+livers+and+an+evaluation+of+perfusates.">An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates.</a> Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).</li><li>Vairetti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+the+liver+temperature+employed+during+machine+perfusion+and+reperfusion+damage:+role+of+Ca2.">Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2.</a> Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).</li><li>Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+and+improving+the+mouse+and+rat+isolated+perfused+liver+preparation.">Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).</li><li>Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+determination+of+urea+concentrations+in+cell+culture+medium.">Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).</li></ol>

Yazarlar bu makaleyle ilgili herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

İzole perfüze fare karaciğeri, hepatik metabolizmanın dinamikleri ve moleküler mekanizmaları üzerine yapılan çalışmalar için güçlü bir araştırma aracıdır. Dakikadan dakikaya numune toplama imkanı, bir test bileşiğinin karaciğer üzerindeki doğrudan etkisinin ayrıntılı bir değerlendirmesini sağlar. İn vivo çalışmalarla karşılaştırıldığında, perfüze karaciğer, kan tarafından taşınan karaciğer dışı faktörlerden kaçınarak ve deneysel koşullar üzerinde tam kontro...

Karaciğer metabolizmada önemli bir organdır. Glikoz, lipid ve amino asit metabolizmasını düzenleyerek tüm vücut enerji dengesinin kontrolünde anahtar rol oynar. Dünya çapında karaciğer hastalıklarındaki artış, önemli bir küresel sağlık yükü olarak ortaya çıkmaktadır ve patofizyoloji ve karaciğer fonksiyonları üzerindeki sonuçları hakkında daha fazla bilgiye ihtiyaç vardır.
İn vivo çalışmaları tamamlamak için karaciğer araştırmaları için çeşitli in vitro modeller geliştirilmiştir. Kemirgenlerden ve insanlardan izole edilmiş ve kültürlenmiş primer hepatositler yaygın olarak kullanılmaktadır. Parankimal olmayan hücreler, diferansiyel ve gradyan santrifüjleme kullanılarak hepatositlerden ayrılabilir ve farklı hücre tiplerinin ko-kültürü, hücreler arası karışma1'i incelemek için yararlıdır. Primer insan hepatositleri, ilaç toksisitesini test etmek için altın standart olarak kabul edilse de, birkaç çalışma, hepatositlerin doku kültüründe hızla farklılaştığını ve bunun sonucunda hepatik fonksiyonların kaybına neden olduğunu göstermiştir 2,3,4. 3D sferoid sistemdeki hepatosit kültürü, farklılaşmayı iyileştirir, daha kararlıdır ve karaciğeri in vivo olarak geleneksel 2D kültür sistemlerinden daha yüksek derecede taklit ediyor gibi görünmektedir5. Hassas kesilmiş karaciğer dilimleri, doku mimarisini sağlam tutan ve karaciğerde bulunan parankimal olmayan hücreleri içeren bir başka köklü in vitro modeldir6. Daha gelişmiş in vitro modeller arasında çip üzerinde karaciğer7 ve karaciğer organoidleri8 bulunur. Bununla birlikte, tüm bu yaklaşımlarla, vektörel portal-hepatik ven akışı da dahil olmak üzere yapısal bütünlük ve akış dinamiklerinde bir kayıp vardır ve bu da genellenebilirliği büyük olasılıkla etkiler.
İzole perfüze sıçan karaciğeri ilk olarak 1855'te Claude Bernard tarafındantanımlanmıştır 9 ve hala karaciğer biyolojisi, toksikoloji ve patofizyoloji çalışmaları için çeşitli bilimsel alanlarda kullanılmaktadır. Perfüze karaciğerin yukarıda belirtilen in vitro modellere göre avantajları arasında hepatik mimarinin korunması, vasküler akış, hepatosit polaritesi ve zonlaması ve hepatositler ile parankimal olmayan hücreler arasındaki etkileşimler yer alır. İn vivo çalışmalarla karşılaştırıldığında, perfüze karaciğer, kan tarafından taşınan karaciğer dışı faktörlerden kaçınarak ve deneysel koşullar üzerinde tam kontrol ile karaciğer metabolizmasının izole bir şekilde incelenmesine izin verir. 10,11,12,13 yıllarında sıçan karaciğer perfüzyon modelini geliştirmek için çeşitli değişiklikler yapılmıştır. İzole perfüze karaciğer çalışmaları için fareler kullanılmış olsa da, daha az literatür mevcuttur. Burada, fare karaciğerinden gelen hepatik venöz atık suda gerçek zamanlı olarak ölçülen metabolik substratlara ve hormonlara akut ve doğrudan metabolik yanıtları incelemek için portal ven ve suprahepatik vena kava inferiorunun kanülasyonu ile fare karaciğerinin in situ perfüzyonu için bir yöntem sunuyoruz.

hepatic glucose production, ureagenesis, and lipolysis quantified using the perfused mouse liver model

Karaciğer, besin metabolizması da dahil olmak üzere çok sayıda fonksiyona sahiptir. Diğer in vitro ve in vivo karaciğer araştırma modellerinin aksine, izole edilmiş perfüze karaciğer, karaciğer biyolojisi ve metabolizmasının, karaciğer dışı faktörlerin etkisinden ayrılmış, bozulmamış bir hepatik mimari ile tüm karaciğerde incelenmesine izin verir. Karaciğer perfüzyonları başlangıçta sıçanlar için geliştirilmiştir, ancak yöntem farelere de uyarlanmıştır. Burada fare karaciğerinin in situ perfüzyonu için bir protokol tarif ediyoruz. Karaciğer, oksijenli Krebs-Henseleit bikarbonat tamponu ile portal venden antegrad olarak perfüze edilir ve çıktı, devreyi kapatmak için infrahepatik inferior vena kavanın klemplenmesi ile suprahepatik inferior vena kavadan toplanır. Bu yöntem kullanılarak, bir test bileşiğinin doğrudan hepatik etkileri, ayrıntılı bir zaman çözünürlüğü ile değerlendirilebilir. Karaciğer fonksiyonu ve canlılığı en az 3 saat boyunca stabildir ve aynı deneye iç kontrollerin dahil edilmesine izin verir. Bu modeli kullanan deneysel olasılıklar çoktur ve karaciğer fizyolojisi ve karaciğer hastalıkları hakkında fikir verebilir.

The liver is an essential organ in metabolism. It plays a key role in the control of whole-body energy balance by regulating glucose, lipid, and amino acid metabolism. The increase in liver diseases worldwide is emerging as a major global health burden, and more knowledge is needed about the pathophysiology and its consequences for liver functions.
Various in vitro models have been developed for research on the liver to complement in vivo studies. Isolated and cultured primary hepatocytes from rodents and humans are widely used. Non-parenchymal cells can be separated from hepatocytes using differential and gradient centrifugation, and the co-culture of different cell types is useful for studying intercellular crosstalk1. Although primary human hepatocytes are considered the golden standard for testing drug toxicity, several studies have shown that the hepatocytes rapidly dedifferentiate in tissue culture resulting in loss of hepatic functions2,3,4. Hepatocyte culture in a 3D spheroid system ameliorates the dedifferentiation, is more stable, and appears to mimic the liver in vivo to a higher degree than the traditional 2D culture systems5. Precision-cut liver slices are another well-established in vitro model that keeps the tissue architecture intact and contains the non-parenchymal cells present in the liver6. More advanced in vitro models include liver-on-a-chip7 and liver organoids8. However, with all these approaches, there is a loss of structural integrity and flow dynamics, including vectorial portal-hepatic vein flow, which likely impacts the generalizability.
The isolated perfused rat liver was first described by Claude Bernard in 18559, and is still used in various scientific fields for studies of liver biology, toxicology, and pathophysiology. Advantages of the perfused liver compared to the above-mentioned in vitro models include the maintenance of the hepatic architecture, the vascular flow, the hepatocyte polarity and zonation, and the interactions between hepatocytes and non-parenchymal cells. Compared to in vivo studies, the perfused liver allows the study of liver metabolism in an isolated manner avoiding extra-hepatic factors carried by the blood and with complete control over the experimental conditions. Several modifications have been made to improve the rat liver perfusion model over the years10,11,12,13. Although mice have been used for isolated perfused liver studies, less literature is available. Here, we present a method for in situ perfusion of the mouse liver by cannulation of the portal vein and the suprahepatic vena cava inferior to study the acute and direct metabolic responses to metabolic substrates and hormones as measured in the hepatic venous effluent from the mouse liver in real-time.

Author Spotlight: Investigating Hepatic Adaptations and Prediabetic Progression in Liver Diseases 

Hepatik Glikoz Üretimi, Ürejenez ve Lipoliz, Perfüze Fare Karaciğer Modeli Kullanılarak Ölçüldü

Bir uyaranın veya substratın ilgilenilen molekülün salınmasına yol açıp açmadığını belirlemek için sabit bir taban çizgisi gereklidir. Şekil 3A'da başarılı bir deney örneği gösterilmektedir. Perfüze karaciğerde üre üretimi 2 dakikalık aralıklarla ölçülür ve ortalama ± SEM olarak gösterilir. İki stimülasyon periyodunun her birinden önceki başlangıç periyotları sabittir. İki stimülasyon periyodu boyunca ortalama üre ?...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Hepatic Adaptations and Prediabetic Progression in Liver Diseases at JoVE.com

Burada, karaciğer mimarisini bozmadan, ancak karaciğer dışı faktörlerin yokluğunda karaciğer metabolizmasının akut ve doğrudan regülasyonunu incelemek için fare karaciğerinin yerinde perfüzyonu için sağlam bir yöntem sunuyoruz.

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused ...

Laboratuvarımızda, karaciğerin yaygın ve nadir görülen karaciğer hastalıklarına nasıl tepki verdiğini ve bu adaptasyonun diyabet öncesi bir duruma nasıl yatkın olabileceğini araştırıyoruz. Karaciğer, besin mevcudiyetindeki ve hormon konsantrasyonlarındaki değişikliklere, ilgili genlerin artan transkripsiyonuyla, ancak daha da önemlisi, akut ve transkripsiyonel olmayan düzenleme ile yanıt verir. Perfüze karaciğer ile, metabolitlerin bir dakikadan dakikaya bir çözünürlükte salınması da dahil olmak üzere metabolizmanın tüm yönlerini ölçebiliriz.Bu tekniğin diğer in vitro modellere göre avantajları, karaciğerin sağlam bir karaciğer mimarisi ile yerinde bırakılmasıdır. Ve karaciğerin en az üç saat boyunca canlı olması, her fare karaciğerinin kendi kontrolü olmasına izin verir. Son olarak, çeviri alaka düzeyini artırmak.Fare perfüze karaciğer sistemini kullanarak, glukagon hormonunun yeni sinyal kaskadını tanımlayabilir ve karakterize edebiliriz. Bu, glukagon ve diğer hormonlar, yağlı karaciğer hastalığı ve diyabetli hastalarda karaciğerin dismetabolik durumlarında hayati bir rol oynayabileceğinden önemli olabilir.

hepatic-glucose-production-ureagenesis-lipolysis-quantified-using

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Medicine

Unit 1

Hepatic Glucose Production, Ureagenesis, and Lipolysis Quantified using the Perfused Mouse Liver Model

Pharmacokinetics: Drug Biotransformation

SCIENTISTS IN ACTION

1.1K Görüntüleme.  University of Copenhagen. Laboratuvarımızda, karaciğerin yaygın ve nadir görülen karaciğer hastalıklarına nasıl tepki verdiğini ve bu adaptasyonun diyabet öncesi bir duruma nasıl yatkın olabileceğini araştırıyoruz. Karaciğer, besin mevcudiyetindeki ve hormon konsantrasyonlarındaki değişikliklere, ilgili genlerin artan transkripsiyonuyla, ancak daha da önemlisi, akut ve transkripsiyonel olmayan düzenleme ile yanıt verir. Perfüze karaciğer ile, metabolitlerin bir dakikadan dakikaya bir çözü...

Video: Author Spotlight: Investigating Hepatic Adaptations and Prediabetic Progression in Liver Diseases 

The liver has numerous functions, including nutrient metabolism. In contrast to other in vitro and in vivo models of liver research, the isolated perfused liver allows the study of liver biology and metabolism in the whole liver with an intact hepatic architecture, separated from the influence of extra-hepatic factors. Liver perfusions were originally developed for rats, but the method has been adapted to mice as well. Here we describe a protocol for in situ perfusion of the mouse liver. The liver is perfused antegradely through the portal vein with oxygenated Krebs-Henseleit bicarbonate buffer, and the output is collected from the suprahepatic inferior vena cava with clamping of the infrahepatic inferior vena cava to close the circuit. Using this method, the direct hepatic effects of a test compound can be evaluated with a detailed time resolution. Liver function and viability are stable for at least 3 h, allowing the inclusion of internal controls in the same experiment. The experimental possibilities using this model are numerous and may infer insight into liver physiology and liver diseases.

Here, we present a robust method for in situ perfusion of the mouse liver to study the acute and direct regulation of liver metabolism without disturbing the hepatic architecture but in the absence of extra-hepatic factors.

Tıp

Mouse Liver Operation and Perfusion for Studying Hepatic Metabolism 

To begin, place the anesthetized C57 Black/6 JRj mouse. Supine on a heated operation table. Confirm the absence of reflex responses to toe pinching.Spray the mouse with 70%ethanol to prevent hair from sticking to the scissors. Using scissors, make an abdominal incision at the base, cutting upwards on both sides to the rib cage to expose the abdominal cavity. Use a cotton swab to move the intestines to the right, exposing the portal vein.Using curved forceps, place two ligatures under the portal vein and loosely tie each ligature. Next, insert a 0.7-millimeter catheter into the portal vein. When perforated, remove the needle from the catheter and guide the catheter through the vein until the tip of the catheter is close to the liver.Then, tighten the ligatures. Observe the liver. Set the flow rate from the roller pump and attach the profusion tube.Initiate the profusion of the liver at 37 degrees Celsius. Once the liver turns pale, use scissors to cut the rib cage and diaphragm. Then, using fine point forceps, place ligature under the suprahepatic inferior vena cava.Next, insert a catheter into the suprahepatic inferior vena cava through the right atrium of the heart. When perforated, remove the needle and guide the catheter through the vein closer to the liver. Then, tighten the ligature.Attach a tube for the collection of perfusion effluent and secure all tubes with waterproof tape. Using a vessel clamp adapter, place a vessel clamp across the infrahepatic vena cava immediately above the right renal vein to prevent dead mixture. Next, increase the perfusion flow rate to 3.5 milliliters per minute.Start the timer and pressure recording. Cover the liver with a sterile drape moistened with saline, equilibrate for 30 minutes, and measure the volume of effluent. After 30 minutes of equilibration, initiate the experiment for the first baseline sample collection in the fraction collector.Monitor the bubble trap regularly and refill with perfusion buffer when close to empty. Collect a buffer sample via a three-way stopcock immediately before it enters the organ and from the collecting catheter inserted in the inferior vena cava. Using a blood gas analyzer, measure the collected sample to confirm that the organ is metabolically active.After 15 minutes of baseline perfusion, using a syringe pump, start the first stimulation by infusing a test substance through a three-way stopcock at desired flow rate. After the simulation, collect baseline samples for 20 to 30 minutes before starting the second stimulation. The production of urea in the perfused liver with steady baseline periods preceding each of two stimulation periods suggested that the response of urea to two consecutive stimulations with mixed amino acids is consistent.A steady basal release of glucose and non-esterified fatty acids was observed. Before a robust increase in glucose and non-ED fatty acids during the glucagon infusion. The mean value at the basal state and during the glucagon infusion suggests that glucagon rapidly stimulates hepatic glycogenolysis and lipolysis.However, without steady basal periods, it becomes impossible to distinguish one urea response from the next.