Bu protokol, primer fare hepatositlerinde total mitokondriyal ve peroksizomal yağ asidi beta-oksidasyonunun ölçümü için sağlam bir yöntem sağlamak amacıyla geliştirilmiştir. Sağlam hücrelerin kullanımı organel bütünlüğünü ve düzenleyici mekanizmaları yerinde tutar. Ek olarak, taze izole edilmiş hepatositlerin tahlili, orijin karaciğerine göre gen ekspresyonundaki değişiklikleri en aza indirir.
Ameliyat zor olabilir. Kendinden emin, gayretli ve odaklanmış olmalısın. Kanülasyon başarılı olduktan sonra, deneyin ve rahatlayın, ancak perfüzyonun kalitesine dikkat edin ve izleyin.
Prosedürü başlatmak için, anestezi uygulanan farenin karnını ve göğsünü % 70 etanol ile serbestçe püskürtün. Daha sonra forsepsleri kullanarak karın tabanının yakınındaki cildi ve karın duvarını yukarı çekin ve organları açığa çıkarmak için orta hattın her iki tarafında ve diyaframa kadar yanal olarak kesin. Bağırsakları sağ tarafa hareket ettirerek ve karaciğerin loblarını hafifçe yukarı çevirerek inferior vena kava veya IVC'yi açığa çıkarın.
IVC'yi hafifçe eğmek ve kanülasyonu kolaylaştırmak için farenin arkasına iğne kapağı gibi küçük bir silindirik nesne yerleştirin. Pompayı tamponla en düşük hızda çalıştırdıktan sonra, iğneyi IVC'ye yerleştirin. Daha sonra basıncı hafifletmek ve kan ve perfüzyon tamponlarının drenajına izin vermek için portal damarı kesin.
Akış hızını dakikada yedi mL'ye çıkarmadan önce. Karaciğeri ılık tamponla perfüze edin ve hava kabarcıklarının ortaya çıkmasını önlemek için tampon içeren tüpe yerleştirilen çizginin sürekli olarak suya batırıldığından emin olun. Perfüzyon meydana gelirken, ikisini tamponlamak için 130 mikrolitre kollajenaz çözeltisi ekleyin ve serolojik bir pipetle pipetleyerek karıştırın.
Tampon içeren tüpteki hacim yaklaşık beş mL'ye düştüğünde, tüpün yan tarafına pipetleme yaparak birini tamponlamak için yavaşça beş mL tampon iki ekleyin. Kalan tampon ikisini tüpe eklemeden önce eklemeyi iki kez tekrarlayın. Tüpte yaklaşık 5 ila 10 mL tampon iki bırakıldığında perfüzyonu durdurun.
Daha sonra karaciğeri tüketin ve 20 mL buz gibi soğuk tampon iki içeren 100 mL kültür kabına aktarın. Laminer akış başlığının altında, cerrahi makas ve cımbız kullanarak karaciğer dokusunu yavaşça ayırın. Daha sonra hepatositlerin süspansiyonuna yaklaşık 20 mL buz gibi soğuk M199 tamponu ekleyin ve daha büyük karaciğer parçalarından ek hepatositlerin salınmasını nazikçe teşvik etmek için bir şırınganın pistonunu kullanarak 100 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün.
Toplama tüpü dolana kadar hücre süspansiyonunu toplamak için 100 mL kültür kabını ve hücre süzgecini M199 tamponu ile yıkayın. Daha sonra süspansiyonu dört santigrat derecede iki dakika boyunca 50 x g'de santrifüj edin. Hepatosit peletini 30 mL soğuk M199'da döndürerek yeniden askıya almadan önce süpernatantı aspire edin.
Yıkamayı bir kez tekrarlayın. Substrat karışımını çoklu reaksiyonlar için hazırlamadan önce palmitik asit ve sığır serum albümini veya BSA çözeltilerini çözün. Bir mikrosantrifüj tüpünde reaksiyon başına Aliquot 13.5 mikrolitre BSA çözeltisi.
Tüpü 41 santigrat dereceye ısıttıktan sonra, reaksiyon başına 200 mM palmitik asit çözeltisinden bir mikrolitre ekleyin. Çözünür palmitik asit-BSA kompleksinin oluşumunu kolaylaştırmak için tüpü 41 santigrat derecede inkübasyondan önce ve sırasında 20 ila 30 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde vorteksleyin. Bu süre zarfında, ayrı 1.5-mL mikrosantrifüj tüplerindeki reaksiyonları durdurmak için kullanılacak olan 133 mikrolitre 1 M perklorik asit aliquot.
Reaksiyonlara başlamadan önce, hazırlanan radyoaktif BSA-palmitik asit kompleksini seyreltmek için reaksiyon başına 485.5 mikrolitre M199 tamponunu 37 santigrat derecede bir tüpe inkübe edin ve inkübe edin. Daha sonra, numuneler olarak ayrı 14-mL yuvarlak tabanlı tüplerde inhibitörlü veya inhibitörsüz 750 mikrolitre M199 dağıtın. Hepatosit yıkama adımları sırasında, reaksiyonlara başlamadan 10 ila 15 dakika önce, tüpleri dakikada 180 ila 200 dönüşte 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir sallanan su banyosuna aktarın.
Hepatositlerin yaşayabilirliği en az% 75 ise, arıtılmış BSA-palmitik asit çözeltisini içeren mikrosantrifüj tüpüne reaksiyon başına 0.8 mikrolitre karbon-14 palmitik asit aktarılarak substrat karışımının hazırlanması. Tüpü 41 santigrat derecede su banyosuna döndürmeden önce vorteks. Son hepatosit süspansiyonundan hemen sonra, bir mL pipet kullanarak sallanan su banyosundaki 14 mL'lik yuvarlak alt tüplerin her birine 750 mikrolitre hepatosit süspansiyonu aktarın ve tüpleri bir inkübatöre aktarmadan önce kısa bir süre düşük hızda vorteksleyin, her bir ilaveyi 30 saniye kademelendirin.
Ayrı bir hepatosit aliquotunu beş dakika boyunca 3000 x g'de döndürmek için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Sonuçları normalleştirmek için numunedeki toplam protein miktarını ölçmek için peleti eksi 80 santigrat derecede saklamadan önce süpernatantı çıkarın. Hepatositler 37 santigrat derecede ön inkübasyon altındayken, reaksiyonlara başlamaya hazır olana kadar 37 santigrat derecede tutmak için radyoaktif BSA-palmitik asit kompleksini ılık ortama ekleyin.
Reaksiyonları başlatmak için, hepatositleri su banyosundan çıkarın ve hepatositlere 500 mikrolitre substrat karışımı ekleyin. 15 dakika boyunca inkübe etmek için su banyosuna dönmeden önce hücreleri beş saniye boyunca düşük bir hızda vorteksleyin. Bir dizi reaksiyon başlatın ve arka plan radyoaktivitesini belirlemek için hemen durun.
Sayımı gerçekleştirmek için artık substrat karışımının 200 ila 250 mikrolitrelik yinelenen alikotlarını 6-mL sintilasyon şişelerine aktarın ve bir kenara koyun. Reaksiyonları durdurmak için, hepatositleri su banyosundan çıkarın ve orta hızda vorteks yaparak yeniden askıya alın ve ardından hepatosit süspansiyonunun 400 mikrolitresini perklorik asit içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Tüm numuneler için sırayı tekrarlamadan önce tüpleri hemen kapatın ve vorteksleyin, 30 saniye boyunca kademelendirin.
1.5-mL mikrosantrifüj tüplerini 10 dakika boyunca 13.000 x g'de döndürdükten sonra, süpernatantın 300 mikrolitresini 6-mL'lik bir sintilasyon şişesine aktarın ve numunelerdeki radyoaktiviteyi saymak için parıltı sıvısının 4 mL'sini ekleyin ve substrat bir sintilasyon sayacındaki alikotları karıştırın. Çalışmada, karaciğer perfüzyonu karaciğer başına 30 ila 40 milyon hücre verdi, ortalama% 80 canlılık ileAçlık grubundaki glikoz konsantrasyonunun düşürülmesinin hepatositlerin verimi veya canlılığı üzerinde olumsuz bir etkisi olmadığı da gözlendi. Beslenen ve oruç tutan erkek farelerden izole edilen hepatosit süspansiyonu, CPT1 ve mitokondriyal yağ asidi oksidasyonunun güçlü bir inhibitörü olan etomoksir varlığında ve yokluğunda yağ asidi beta-oksidasyon kapasitesi açısından test edildi.
Arka plan radyoaktivitesi ile ilişkili dakika başına sayım veya BGBM, palmitik asit grubuna göre değişir. Bununla birlikte, CPM, substrat karışımı ile inkübe edilen örneklerden hala önemli ölçüde daha düşüktü. Açlık çeken farelerden izole edilen hepatositler, hem mitokondriyal hem de peroksizomal yağ asidi beta-oksidasyon oranlarında sağlam bir artış göstermektedir.
Veriler, beslenen ve oruç tutan farelerden izole edilen hepatositlerde palmitik asidin oksitlenme oranını belirlemek için daha fazla çalışılmıştır. Kabarcıkların çizgiye girmesini önleyin. Perfüzyon sırasında iğneyi sabit tutun.
Hepatositleri kullanırken nazik olun. Onları dağıtırken süspansiyonda tutun. Bu prosedürden izole edilen hepatositler, yağ asidi sentezi gibi diğer metabolik yolları test etmek için bir süspansiyon olarak kullanılabilir veya hücre kültürü deneyleri için kaplanabilirler.
